Name: flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma
Uploaded: 2022-08-09T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma at JoVE.com

Arbeidet rapportert her ble støttet av det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR-18-CE19-0029). Forfatterne takker S.M. Bardet for hennes bidrag til genereringen av en stabil GCaMP6f cellelinje og D. O'Connor for hennes hjelp med in ovo-modellen .

<ol>
	<li>Koshy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+time+trends+for+glioblastoma+using+the+SEER+17+population-based+registries.">Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries.</a> Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).</li><li>Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma:+Overview+of+disease+and+treatment.">Glioblastoma: Overview of disease and treatment.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 2-8 (2016).</li><li>Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+results+of+a+new+focal+tissue+ablation+technique:+irreversible+electroporation.">In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation.</a> IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).</li><li>Breton, M., Mir, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsecond+and+nanosecond+electric+pulses+in+cancer+treatments.">Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments.</a> Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).</li><li>Frandsen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+therapeutic+applications+of+calcium+electroporation+to+effectively+induce+tumor+necrosis.">Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis.</a> Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).</li><li>Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+implantable+microelectrodes+for+future+medicine:+prosthetics,+neural+signal+recording+and+neuromodulation.">Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).</li><li>Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+analysis+of+silicon+microelectrode-induced+strain+in+the+brain.">Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain.</a> Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).</li><li>Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+organic+and+inorganic+biomaterials+for+neural+interfaces.">A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces.</a> Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).</li><li>Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+biostability+assessment+of+chronically-implanted+Parylene+C+neural+sensors.">In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).</li><li>Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDOT:PSS-coated+stimulation+electrodes+attenuate+irreversible+electrochemical+events+and+reduce+cell+electropermeabilization.">PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization.</a> Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+chorioallantoic+membrane+as+a+novel+in+vivo+model+for+the+testing+of+biomaterials.">The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).</li><li>Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+glioblastoma+mouse+model+maintaining+brain+parenchymal+physical+constraints+and+suitable+for+intravital+two-photon+microscopy.">An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).</li><li>Lefevre, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+flexible+electronics+for+pulsed+electric+field+delivery+in+a+vascularized+3D+glioblastoma+model.">Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model.</a> npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).</li><li>Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically-encoded+calcium+indicators+for+live+cell+calcium+imaging+and+localization+in+virus-infected+cells.">Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells.</a> Methods. 90, 28-38 (2015).</li><li>Bl&#246;mer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector.">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Hickman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology:+Capturing+tumor+complexity+in+vitro/ex+vivo.">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li><li>Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAM-LDPI+method:+a+novel+platform+for+the+assessment+of+drug+absorption.">The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).</li><li>Kundekov&#225;, B., M&#225;&#269;ajov&#225;, M., Meta, M., &#268;avarga, I., Bil&#269;&#237;k, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+Membrane+Models+of+Various+Avian+Species:+Differences+and+Applications.">Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications.</a> Biology. 10 (4), 301 (2021).</li><li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice.">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Tilnærmingen beskrevet i dette arbeidet gjør det mulig for hjernesvulstmodeller med et integrert PEF-leveringssystem å studere effekten av PEF på ulike nivåer av biologisk organisasjon. Mikrofabrikasjonsprotokollen består av standard tynnfilmprosesser, som gir en stor grad av frihet i elektrodedesign som kan tilpasses den spesifikke applikasjonen. Noen ganger kan et ekstra termisk glødningstrinn være nyttig på slutten av fabrikasjonen, for å redusere bøyning av elektrodene som oppstod under produksjonen.
Bruken av en stabil glioblastomcellelinje som uttrykker en fluorescerende kalsiumindikator, unngår alle komplikasjoner knyttet til fargestofflevering og retensjon, spesielt i 3D-svulster som er svært tette16. Faktisk observeres et høyt uttrykksnivå over en lang periode sammenlignet med standard kjemiske fluorescerende kalsiumindikatorer17. Denne protokollen kan brukes på forskjellige cellelinjer, da den vanligvis brukes til avbildning av nevral aktivitet11. Her ble humane og murine cellelinjer brukt (U87 og Gl261 for implantasjon i henholdsvis immundefekte eller immunkompetente mus). Faktisk viste nyere studier at U87-cellelinjen er forskjellig fra de opprinnelige cellene, da mange mutasjoner ble ervervet over år med cellekultur, noe som påvirket eksperimentell reprodusering18. Metoden som brukes til fremstilling av 3D-svulster er høy gjennomstrømning, reproduserbar, og tillater generering av sfæroider av en bestemt størrelse avhengig av cellelinjen, antall celler ved såing og tidspunktet for vekst19. Imidlertid er disse sfæroider tette, noe som gir en ulempe ved avbildning i kjernen av svulsten.
In ovo-modellen er nyttig som en første tilnærming for å studere effekten av PEF på 3D-svulster og deres vaskulatur, uten interaksjoner med andre celletyper som er tilstede i hjernen. Denne modellen er billig, rask, høy gjennomstrømning og reiser færre etiske problemer enn dyremodeller. Det er viktig å opprettholde embryoets integritet gjennom hele forsøket, da det kan påvirke overlevelsen og kvaliteten på avbildningen. Spesiell forsiktighet må tas mens du åpner vaktelegget, for å unngå skade på den embryonale membranen. Transplantatet og plasseringen av de fleksible elektrodene må også utføres nøye, for å unngå blødninger som kan drepe embryoet. Injeksjon av fluorescerende fargestoff i blodkarene tillater samtidig visualisering av tumorcellene og vaskularisering med fluorescensmikroskopi. Den intraokulære injeksjonen må utføres nøye for å unngå at fargestoff lekker inn i den embryonale væsken, noe som kan forårsake en gjenværende fluorescens i bakgrunnen som forringer kvaliteten på avbildningen. Denne modellen kan også brukes til å følge legemiddelopptak, da det gir tilgang til sirkulasjonssystemet. Imidlertid er eksperimenter begrenset av embryoets 12-dagers overlevelsestid, og tillater dermed 7 dagers observasjon, noe som er betydelig kortere enn in vivo-modellen 21.
In vivo hjernesvulstmodellen kan overvåkes i 4 til 5 uker før dyr når et etisk eksperimentelt endepunkt bestemt av et plutselig vekttap på 20%. Det tolereres godt og forblir på plass hvis elektrodens forbindelseshale ikke er for lang. Ellers har dyr en tendens til å skrape vippekontakten, som til slutt kan bli revet, og dermed forhindre påfølgende tilkobling til stimulatoren. Denne 4-ukers perioden er likevel verdifull for å dekke de ulike stadiene av glioblastomutvikling. Ved sammenligning av tumorcelletetthetene i samme volum av interesse ved forskjellige tidsintervaller, kan utviklingen av tumorvekstkinetikken observeres. Spesielt ble det observert økt tumorvekst på tidspunktet for immunbryteren22. En lignende studie i nærvær av en stimulerende elektrode ville informere om effekten av PEF på tumorproliferasjonshastighet og tumorfølsomhet for immuneliminering. I forhold til i ovo-modellen kan in vivo-modellen ses som en verdifull preklinisk modell for å studere virkningen av immunceller på tumorprogresjon og deres bidrag til den terapeutiske effekten av PEF. Denne protokollen er tilpasset fra en tidligere artikkel med tillegg av en fleksibel elektrodeanordning på svulsten før du plasserer et kranialvindu14. Både akutt og kronisk bioelektrisk behandling av svulster kan karakteriseres ved direkte og påfølgende observasjoner med to-foton mikroskopi gitt at innledende stimulering forventes å indusere celledød og å utløse varig dysregulering av immunresponsen.
Tilkoblingene til den fleksible sonden er lett tilgjengelige under to-foton mikroskopet. Elektriske stimuleringsparametere kan dermed justeres i sanntid basert på den observerte effekten på nevralvevet og / eller de målrettede cellene, på samme måte som en lege ville utføre intervensjonsprosedyrer mens han observerte MR- eller CT-bilder av pasienten. En siste vurdering er viktigheten av forsiktig forsegling av elektroden på hjernen med superlim og silikonlim for å forhindre vevsvekst.
Avslutningsvis representerer protokollen beskrevet her en innovativ modell for å studere effekten av PEF-terapi med fleksible organiske polymerelektroder for glioblastomtumormodeller. De to modellene viser forskjellige nivåer av kompleksitet slik at cellulære, vaskulære eller immuneffekter kan skilles for en bedre forståelse av virkningsmekanismene. Konforme, overfladiske elektroder reduserer den iatrogene skaden samtidig som de muliggjør forstyrrelse av tumormikromiljøet, utløser vasokonstriksjon eller dysregulering av intracellulært kalsium15.

Glioblastoma multiforme (GBM) er en svært invasiv svulst og derfor vanskelig å utrydde med standardbehandlinger som reseksjon, strålebehandling og kjemoterapi. Til tross for multimodal behandling er prognosen fortsatt svært dårlig, og de fleste pasientene opplever sykdomsprogresjon innen 1 år etter diagnose 1,2. Nylig har utviklingen av bioelektriske behandlinger vist stort potensial for å forbedre eksisterende terapier. Disse terapiene bruker levering av pulserende elektriske felt (PEF), vanligvis i en enkelt behandlingsøkt, for å forstyrre cellulær membranintegritet og mikromiljøet til svulster. Denne cellemembranforstyrrelsen, også kjent som elektroporering, kan være reversibel eller irreversibel avhengig av elektrisk feltintensitet og antall pulser. Irreversibel elektroporering (IRE) brukes som en ikke-termisk vevsablasjonsteknikk der elektriske pulser forårsaker dødelig skade på cellulære membraner som fører til celledød3. Reversibel elektroporering brukes i elektrokjemoterapi (ECT), en etablert teknikk som består av levering av PEF i kombinasjon med kjemoterapimedisiner for å øke legemiddelopptaket i kreftceller4. Videre viste nyere studier kalsiumelektroporering som et alternativ til ECT med høy effektivitet for kreftbehandling, noe som også er billig og induserer færre bivirkninger5. Til tross for disse lovende fremskrittene, brukes PEF vanligvis ved hjelp av stive, metalliske elektroder som er kjent for å forårsake skade på bløtvev6. Hjernen er spesielt følsom for slike invasive enheter der det mekaniske misforholdet induserer betennelse og astroglial arrdannelse7.
I denne sammenheng presenteres et fleksibelt PEF-leveringssystem i kombinasjon med 3D-modeller av glioblastomtumorer, fra mikrofabrikasjon til en murinmodell. Konforme elektroder er laget med standard tynnfilmmikrofabrikasjonsprosesser, inkludert bruk av myke og biokompatible materialer som parylen-C, gull og PEDOT: PSS 8,9. En interdigitated elektrode design brukes til å dekke et stort overflateareal samtidig opprettholde tilstrekkelig gjennomsiktighet for avbildning mellom elektrodefingrene10. For tumormodellen produseres 3D-sfæroider av glioblastomceller som uttrykker en genetisk kodet fluorescensreporter ved hjelp av en variant av væskeoverlegget 96-brønnplatemetoden11. Sfæroidene er podet inn i chorioallantoic membranen til et vaktelembryo, noe som resulterer i en in ovo-modell som har blitt mye brukt til å studere angiogenese eller legemiddeltoksikologi12,13. Tumorer kan podes og vaskulariseres av embryoets vaskulatur i fravær av et immunsystem på dette stadiet av embryonal utvikling12. Fleksible elektroder plasseres deretter på toppen av den vaskulariserte svulsten for å studere effekten av PEF-levering på sfæroid og dens vaskulatur. Til slutt undersøkes disse effektene på en komplett levende organisme, inkludert tumormikromiljø og immunsystem, ved å implantere konstruerte sfæroider i hjerneparenkymet av murine modeller14. Fleksible elektroder plasseres på toppen av innføringsstedet, og kraniotomien er forseglet med et glassvindu, noe som tillater gjentatt to-foton avbildning over flere uker.
Disse metodene vil være nyttige for folk som er interessert i ulike domener som spenner fra mikroelektronikkteknikk til onkologiske applikasjoner. Mikrofabrikasjonsprotokollen kan brukes og tilpasses for alle bruksområder som krever tynnfilmmetallelektroder belagt med PEDOT: PSS. Videre vil de biologiske modellene utviklet for evaluering av antitumor elektriske behandlinger være av generell interesse for undersøkelsen av differensiering av cellulær, vaskulær og immunrespons mot implanterte materialer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440167</td>
			<td>GOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dodecylbenzenesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44198</td>
			<td>DBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Technic</td>
			<td>530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>NC1455685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3150 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 10XT</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 826 MIF Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10056124960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ Developer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10054224960</td>
			<td>Metal-ion-free developer for the positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ nLof 2070</td>
			<td>Microchemicals</td>
			<td></td>
			<td>Negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Axience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Legend X1R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator HERAcell 150i</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAC board</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB 6259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D&#233;co spray P&#233;b&#233;o</td>
			<td>Cultura</td>
			<td>3167860937307</td>
			<td>Black acrylic paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Texas Red 70.000</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Die bonding paste &#34;Epinal&#34;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>EN-4900GC</td>
			<td>Silver paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing machine</td>
			<td>Tianhao</td>
			<td>TH-2004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium + GlutaMAX&#8482;-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10567-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator COUVAD&#39;OR 160</td>
			<td>lafermedemanon.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6881.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs of Japanese quail</td>
			<td>Japocaille</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>S181BH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gl261</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th</td>
			<td>Neyco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and drying oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide Sequa-brene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate Delta 6 HP 350</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system pE-4000</td>
			<td>CoolLed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape SCOTCH 92 33x19</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide protection tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab made pulse generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010</td>
			<td>SCS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X 293 T cell line</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>63218</td>
			<td>HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X GoStix Plus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631280</td>
			<td>Quantitative lentiviral titer test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner MJB4</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-90 Concentrated cleaning solution</td>
			<td>International Products</td>
			<td>M9050-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 76 x 52 x 1 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1100420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 30G</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PalmSens4 potentiostat</td>
			<td>PalmSens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parylene-c : dichloro-p-cyclophane</td>
			<td>SCS</td>
			<td>300073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCB Processing Tanks</td>
			<td>Mega Electronics</td>
			<td>PA104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDOT:PSS Clevios PH 1000</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGP-CMV-GCaMP6f</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>40755</td>
			<td>plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma treatment system PE-100</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic mask</td>
			<td>Selba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10770-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow chemicals</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide copper film 60 &#181;m (Kapton)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>IM301522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Technic</td>
			<td>574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protolaser S</td>
			<td>LPKF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass 5 mm diameter</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>50-949-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Sensors - 60 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone adhesive Kwik-Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin coater</td>
			<td>S&#252;ss Microtec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Office depot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline-free f&#339;tal bovine Serum</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal evaporator Auto 500</td>
			<td>Boc Edwards</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td>Human glioblastoma cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex VTX-3000L</td>
			<td>LMS</td>
			<td>VTX100323410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect single shots reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631447</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible organic electronic devices for pulsed electric field therapy of glioblastoma

Glioblastom er vanskelig å utrydde med standard onkologiske terapier på grunn av sin høye grad av invasivitet. Bioelektriske behandlinger basert på pulserende elektriske felt (PEF) er lovende for forbedring av behandlingseffektiviteten. Imidlertid er de avhengige av stive elektroder som forårsaker akutt og kronisk skade, spesielt i bløtvev som hjernen. I dette arbeidet ble fleksibel elektronikk brukt til å levere PEF til svulster, og den biologiske responsen ble evaluert med fluorescerende mikroskopi. Interdigitated gullelektroder på et tynt, gjennomsiktig parylen-C-substrat ble belagt med den ledende polymeren PEDOT: PSS, noe som resulterte i en konformbar og biokompatibel enhet. Effektene av PEF på svulster og deres mikromiljø ble undersøkt ved hjelp av ulike biologiske modeller. Først ble monolayers av glioblastomceller dyrket på toppen av elektrodene for å undersøke fenomener in vitro. Som et mellomliggende trinn ble det utviklet en in ovo-modell der konstruerte tumorsfæroider ble podet i den embryonale membranen til en vaktel. På grunn av fraværet av et immunsystem førte dette til svært vaskulariserte svulster. På dette tidlige utviklingsstadiet har embryoer ikke noe immunsystem, og svulster blir ikke gjenkjent som fremmedlegemer. Dermed kan de utvikle seg raskt mens de utvikler sine egne fartøy fra det eksisterende embryovaskulære systemet, som representerer en verdifull 3D-kreftmodell. Til slutt ble fleksibel elektrodelevering av PEF evaluert i en komplett organisme med et funksjonelt immunsystem, ved hjelp av en syngen, ortograft (intrakraniell) musemodell. Tumor sfæroider ble podet inn i hjernen til transgene multifluorescerende mus før implantasjon av fleksible organiske elektrodeenheter. Et forseglet kranialvindu muliggjorde multifotonavbildning av svulsten og dens mikromiljø under behandling med PEF over en periode på flere uker.

Denne protokollen tillater applikasjonen til to glioblastommodeller der et fleksibelt PEF-leveringssystem er integrert. Etter mikrofabrikasjons- og pakketrinn karakteriseres fleksible elektroder i saltoppløsning ved elektrokjemisk impedansspektroskopi (EIS) for å vurdere og validere ytelsen. PEDOT: PSS-belagte elektroder viser de typiske kapasitive og resistive dominerte regionene atskilt med en avskjæringsfrekvens, mens de ubelagte elektrodene bare viser kapasitiv oppførsel (figur 2).
En variant av væskeoverleggsplatemetoden 96-brønns brukes til å dyrke 3D-svulster laget av transfekterte glioblastomceller som stabilt uttrykker en fluorescerende intracellulær kalsiumreporter. Veksten av sfæroidene kan observeres med et lysfeltmikroskop (figur 3; ED 0). Minst 2 eller 3 dager er nødvendig for å oppnå sfæriske og tette sfæroider, avhengig av cellelinjen og antall celler som seedes.
I in ovo-modellen er sfæroider podet i chorioallantoic membranen til et vaktelembryo (figur 3; ED 6). Transplantatets suksess kan vurderes ved fluorescensmikroskopi noen dager senere, da levende celler har intracellulært kalsium og dermed er fluorescerende (figur 3; ED 9). Vaskulariseringen av svulsten kan observeres under et fluorescensmikroskop ved å injisere et fluorescerende fargestoff i blodkarene (figur 3; ED9). Imidlertid kan det ikke alltid være mulig å visualisere blodkarene inne i svulsten, da sfæroiden er veldig tett. De fleksible interdigitaliserte elektrodene er plassert på toppen av den vaskulariserte svulsten (figur 3; ED 9) og koblet til en pulsgenerator. Sonden må plasseres forsiktig for å unngå blødning av embryoet; Ellers kan det fluorescerende fargestoffet spre seg, noe som hindrer enhver observasjon ved avbildning. Korrekt levering av pulsen til det biologiske miljøet kan verifiseres ved å måle strømmen som går gjennom kretsen. Avbildning av disse i ovo-modeller tillater sanntidsovervåking av effekten av PEF på det intracellulære kalsiumet i en 3D-glioblastomtumor, samt vasokonstriksjonen indusert på svulstens vaskulatur, og unngår påvirkning av andre celletyper, inkludert immunsystemet15.
Studien av PEF-effekten på glioblastom kan også utføres i en mer komplett og prediktiv modell. Faktisk består in vivo-modellen beskrevet ovenfor14 av poding av en 3D glioblastomtumor i hjerneparenkymen til en mus (figur 4). Injeksjonsstedet til svulsten er plugget av en tverrbundet dextrangelhemi-perle, for å rekapitulere de fysiologiske biofysiske begrensningene under veksten av svulsten. Selv om det er beskrevet i referanse14, er det verdt å understreke at det er kritisk viktig at dextran hemi-perlen er nøyaktig limt til dura materen; Ellers kan svulsten rømme gjennom den åpne dura og helt dekke hjernen, noe som gjør avbildningen umulig. For enhver kronisk avbildning utgjør vevsinnvekst som finner sted når kranialvinduet helbreder, en alvorlig barriere, da det nye vevet ikke er gjennomsiktig og gjør bildene tåkete eller ikke-brukbare. Derfor, etter å ha satt inn og limt hemi-perlen, må sideveggene til det åpne kranialvinduet forsegles med et tynt lag superlim omhyggelig plassert rundt hulromsveggen, uten å la superlimet gli eller strømme på duraen. Når den fleksible sonden er plassert på toppen av tumorinjeksjonsstedet, kan ingen bobler holde seg under sonden, av to grunner. For det første kan ikke avbildningen fortsette når bobler er til stede. For det andre tjener bobler som isolatorer, og endrer dermed de elektriske stimuleringsegenskapene. Etter å ha tatt forholdsregler beskrevet ovenfor, er kraniotomien forseglet med et glassvindu sementert til skallen for å tillate kronisk avbildning over uker. Siden svulsten består av GCaMP eller DsRed uttrykkende celler, kan injeksjonen bekreftes med et fluorescensmikroskop. Den elektrokjemiske impedansen til elektrodene må måles for å validere ytelsen etter implantasjon. Sammenlignet med impedansen i saltoppløsning forventes en økning av impedansen in vivo ved frekvenser over 100 Hz på grunn av tilstedeværelsen av et biologisk miljø (figur 5). Vaskularisert nevral parenkym og tumorinfiltrasjon kan observeres og karakteriseres gjennom det transparente substratet over uker ved tofotonmikroskopi (figur 6). Bruk av transgene dyr som uttrykker fluorescerende proteiner i celler av interesse (immunceller og nevroner) kan for eksempel tillate demonstrasjon av den minimale inflammatoriske prosessen indusert av elektrodeimplantasjon alene (figur 6A) eller vise tilstedeværelse av mikroglia og monocytter 26 dager etter implantasjon av en PEF-stimulert elektrode implantert på toppen av en voksende GBM-tumor (figur 6B1 ). I sistnevnte tilfelle ble det funnet både perifere monocyttavledede celler og hjerneresidente mikrogliaceller rundt og inne i svulsten (figur 6B2). På dagen for PEF-levering kan kontaktputene til de fleksible elektrodene kobles til pulsgeneratoren, direkte under to-fotonmikroskopet. Samlet sett kan denne modellen brukes til å undersøke effekten av bioelektriske behandlinger over tid ved bruk av ulike typer celler involvert i hjernesvulstutvikling, opp til en dybde på rundt 500 μm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig01.jpg"> Figur 1: Mikrofabrikasjon av fleksible elektroder . (A) Gullelektrodemønster og Parylen C-substrat. (B) Disposisjon åpning. (C) PEDOT: PSS belegg. (D) Tilkoblinger og emballasje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig02.jpg"> Figur 2: Elektrokjemisk impedansspektroskopi av fleksible gullelektroder og PEDOT: PSS-belagte kalde elektroder i en saltoppløsning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig03.jpg"> Figur 3: Inovo-modellen av glioblastom. ED 0: Sfæroid observert med et lysfeltmikroskop. ED 3: Skall mindre kultur av et vaktelembryo 3 dager etter åpning. ED 6: Tumor implantert i CAM observert med et lysfeltmikroskop. ED 9: Fleksibel enhet plassert på vaskularisert svulst (svulst i grønt og blodkar i rødt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig04.jpg"> Figur 4: In vivo-applikasjonen . (A) Skjema for in vivo eksperimenter. (B) Sondeplassering før påføring av dekkglass og akrylharpiks. (C) Fullført sondeimplantasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig05.jpg"> Figur 5: Elektrokjemisk impedansspektroskopi av fleksible gullelektroder i en saltoppløsning sammenlignet med en implantert sonde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig06.jpg"> Figur 6: Intravital multispektral to-foton avbildning gjennom elektroder . (A) Flislagt bilde av den sunne hjerneoverflaten i en kontroll multifluorescerende AMU-Neuroinflam mus 3 dager etter elektrodeimplantasjon. Cyan viser dendritisk arborisering av lag 5 pyramidale nevroner, grønn viser rekrutterte granulocytter og monocytter, og gul viser aktiverte mikroglia og dendrittiske celler. Rosa viser infrarød diffusjon på grunn av varmeakkumulering. (B1) Lignende bilde som i A , men 26 dager etter tumor sfæroid implantasjon 200 μm dypt inne i cortex umiddelbart etterfulgt av elektrode implantasjon. Legg merke til akkumulering av grønne og gule immunceller. (B2) Lignende bilde som i B1 , men 100 μm under overflaten av elektrodene. Legg merke til tilstedeværelsen av blå neuronal dendritisk arborisering i periferien av selve den røde tumormassen infiltrert av gule mikroglia og dendritiske celler. Dypblå viser et andre harmonisk signal fra peritumoralt kollagen. (B3) Zoomet visning av B2 som viser tilstedeværelse av interneuron somas (indikert med piler) i nærheten av svulsten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma at JoVE.com

Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

Dette arbeidet beskriver utviklingen av fleksible interdigiterte elektroder for implementering i 3D hjernesvulstmodeller, nemlig in vitro-kultur, i ovo-modell og in vivo murine modell. Den foreslåtte metoden kan brukes til å evaluere effekten av pulserende elektriske felt på svulster på forskjellige nivåer av kompleksitet.

Fleksible organiske elektroniske enheter for pulserende elektrisk feltterapi av glioblastom

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

Denne protokollen tillater levering av pulselektriske felt ved fleksibel elektronikk for å studere deres terapeutiske effekter på glioblastom. Vi gjør dette ved å visualisere tumormikromiljøet in vivo med avbildning. Bioelektronikken integreres i denne protokollen ved hjelp av flere forskjellige modeller med økende kompleksitet for å studere effekten av pulserende felt på kreft.Mikrofabrikasjonsteknikkene som presenteres i dette arbeidet, kan også testes som et middel til å behandle andre typer kreftformer, inkludert pasientavledede xenotransplantater. Dette beveger seg mot ideen om presisjonsmedisin skreddersydd for hver enkelt pasient. Disse sondene er laget med standard mikrofabrikasjonsteknikker, slik at produksjonen er grei og alle med et rent rom kan lage dem.For gullelektrodemønster, deponer et tre mikrometer lag parylen C med et parylenavsetningssystem ved å plassere de rene glasslysbildene i avsetningskammeret. Vei seks gram parylen C i en aluminiumsbåt, plasser den i ovnen, evakuer maskinen og start avsetningen med parametrene beskrevet i manuskriptet. Når avsetningen er ferdig og fordampertemperaturen er under 40 grader Celsius, slå av kjøleren, fordamperen, ovnen.Luft maskinen og samle prøvene. Spinnbelegg de plasmabehandlede prøvene med en negativ fotoresist ved 1.000 ganger G i 40 sekunder. Eksponer fotoresisten gjennom en maske som har den interdigiterte elektrodedesignen.Senk deretter prøvene i en metallionfri utvikler i tre minutter for å fjerne den ikke-eksponerte fotoresisten. For å deponere et 20 nanometer vedheftslag av krom og et 300 nanometer lag gull med en termisk fordamper, luft fordampermaskinen og klipp prøvene på den øvre runde platen med metallskruer. Fyll de dedikerte diglene med henholdsvis krom og gull.Forsegle og evakuer maskinen og start rotasjonen av prøveholderen. Velg smeltedigelen som inneholder krom og øk strømmen sakte til avsetningshastigheten når 0,2 ångstrøm per sekund. Åpne lukkeren, vent til avsetningen av 20 nanometer krom, lukk lukkeren og sakte rampe ned strømmen til null milliampere.Velg gullet som inneholder smeltedigelen og øk strømmen sakte til en avsetningshastighet på 0,2 ångstrøm per sekund. Åpne lukkeren for å fordampe gullet, vent til avsetningen av 10 nanometer gull, og øk deretter avsetningshastigheten til 1, 5 ångstrøm per sekund til omtrent 300 nanometer er avsatt. Lukk lukkeren og trapp sakte ned strømmen til null milliampere.Fordyp prøvene i et beger som inneholder aceton. Skyll deretter prøvene med isopropanol og tørk dem med en luftpistol. Spinn fire lag med PEDOT:PSS-løsning ved 150 ganger G i 35 sekunder.Fjern offerparylen C-laget ved å senke prøvene i vann. Dypp prøvene i avionisert vann i 30 minutter for å fjerne gjenværende såpe og lavmolekylære forbindelser i PEDOT: PSS-filmen og løsne prøvene fra glasssubstratet. Tilsett 75 mikroliter smeltet 1% agaroseoppløsning i hver brønn på 96-brønnplaten forsiktig og la den størkne i 15 minutter ved romtemperatur.Løsne de transducerte glioblastomcellene oppnådd under den stabile cellelinjegenereringen. Legg til 10.000 glioblastomceller per brønn og utgjør totalvolumet til 150 mikroliter per brønn ved bruk av DMEM som inneholder ett gram per liter glukose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbikarbonat, 10% føtal bovint serum, 100 enheter per mikroliter penicillin og 100 mikrogram per mikroliter streptomycin. Bytt ut halvparten av mediet med ferske medier annenhver dag inntil videre eksperimenter mens du holder pipettespissen i den øvre delen av brønnen for å unngå skade på agarose eller sfæroid selv.Plasser de befruktede eggene av japansk vaktel, Coturnix japonica, i en inkubator på skuffer med en automatisk rotator som gjør egg hver annen time. Denne dagen regnes som embryonal dag null. På embryonale dag tre, åpne forsiktig eggene med en pinsett med tynne tips forvasket med 70% etanol.Hell embryoet i en plastveiebåt, dekk det til med en annen veiebåt og legg det i en standard fuktet inkubator ved 37 grader Celsius i tre dager. På embryonale dag seks, gjør et lite snitt i chorioallantoic membran med en 23 gauge nål. Plasser en syv-dagers sfæroid på snittet ved hjelp av en pipette og returner embryoet til inkubatoren i tre dager til videre eksperimenter.Plasser en dråpe DPBS for å dekke kraniotomien. Plasser den fleksible elektroden på dråpen DPBS og plasser forsiktig baksiden av sonden med kontaktputene på musens bakside. Absorber DPBS-dråpen med et lite stykke papir til sonden kan ligge flatt på dura og følge krumningen i hjernen, slik at det lille laget av saltvann forblir under elektrodene for å fungere som en barriere mot limspillover.Legg en liten dråpe silikonlim på sonden og dekk den med et fem millimeter rundt dekselglass. Skyv glassdekselet ned til silikonet er jevnt fordelt og avstanden mellom glassdekselet og sonden er minimal. Vent deretter 30 sekunder til silikonet stivner.For å feste dekselglasset, påfør raskt superlim på sidene og skyv det ned til limet blir solid. Påfør superlim på sondens hals ved hjelp av en tannpirker, og pass på at superlimet blir trukket under nakken for å gi stabil støtte. Dekk skallen med dental sement for å bygge en kronisk hette og vær spesielt forsiktig med å dekke kantene på dekselglasset.Løft baksiden av sonden og påfør sement under sondens hals. Resten av sonden på sementen før den herder. Skyv sondens hals forsiktig ned for å plassere overflaten på samme nivå som dekkglasset og ikke i veien for mikroskopmålet under forsøket.Dekk toppen av sondehalsen med ikke mer enn 1,5 millimeter tannsementlag for å oppnå et fast grep på sonden. Bygg en sementbrønn som presenterer en 1,5 millimeter rygg på en til to millimeter rundt dekkglasset for å lage et basseng for nedsenkningsvæsken for de to fotonbildene. Etter at sementen har herdet, administrer postkirurgisk analgesi og hold dyret varmt til utvinning ved å pakke det inn i et papirhåndkle og plassere det nær en infrarød lyspære.PEDOT: PSS-belagte elektroder viser de typiske kapasitive og resistive dominerte områdene atskilt med en avskjæringsfrekvens, mens de ubelagte elektrodene bare viser kapasitiv oppførsel. Veksten av sfæroider observert med et brightfield-mikroskop viste at minst to eller tre dager er nødvendig for å oppnå sfæriske og tette sfæroider avhengig av cellelinjen og antall celler som seedes. I in ovo-modellen kan transplantatet av sfæroider i chorioallantoic-membranen vurderes ved fluorescensmikroskopi da levende celler har intracellulært kalsium og vaskulariseringen av svulsten kan vurderes ved å injisere et fluorescerende fargestoff i blodkarene.Sammenlignet med impedansen i saltoppløsning, forventes en økning av impedansen in vivo ved frekvenser over 100 hertz på grunn av tilstedeværelsen av et biologisk miljø. Vaskularisert nevrale parenkym og tumorinfiltrasjonen kan observeres og karakteriseres gjennom det gjennomsiktige substratet over uker ved to fotonmikroskopi. Bruken av transgene dyr som uttrykker fluorescerende proteiner i celler av interesse, kan demonstrere den minimale inflammatoriske prosessen indusert av elektrodeimplantasjon alene.Det kan vise tilstedeværelsen av mikroglia og monocytter 26 dager etter implantasjon pulserende elektriske felt stimulert elektrode. Både perifere monocyttavledede og hjerneresonante mikrogliaceller ble funnet rundt og inne i svulsten. Det kritiske punktet for suksess i implantatprosedyren er å sikre tetningen og flatheten i kranialvinduet og å optimalisere kvaliteten på kontakten med sonden.I tillegg til intravital bildebehandling, hva kan vurdere å kombinere protokollen vår med andre tiltak og teknikker som prøvetaking og målinger av blodarbeid for cytokiner, immunstatus ved flowcytometri eller til og med atferdsanalyse. Dette arbeidet baner vei for bruk av fleksible implanterbare enheter for kreft og åpner nye muligheter for bruk av bioelektronisk medisin for denne kroniske sykdommen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser å studere macrophage og Microglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytte oppover: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensjonale invasjonen analysen protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescens molekylær tomografi ved i Vivo avbildning av glioblastom Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Klinisk anvendelse av svulst behandling av feltene terapi i glioblastom

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

En 3D Spheroid modell for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Samkultur av Glioblastoma stamceller på mønstrede nevroner for å studere migrasjon og cellulære interaksjoner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

Positron Emission Tomography-basert dosemalingsstrålebehandling i en Glioblastoma Rat-modell ved hjelp av Small Animal Radiation Research Platform

A rat glioblastoma model to mimic chemo-radiation treatment of human glioblastoma in the clinic was previously established. Similar to the clinical ...

Application of Hemostatic Devices in Laparoscopic Hepatectomy

Påføring av hemostatiske enheter i Laparoskopisk hepatektomi

Laparoscopic hepatectomy is considered a conventional method for treating benign and malignant liver diseases because it is a minimally invasive method. ...

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Translasjonelle ortotopiske modeller av glioblastom multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...