I saggi del potenziale di membrana basati sulla fluorescenza forniscono metodi robusti per studiare gli effetti dei modulatori sui canali ionici espressi endogenamente nelle cellule epiteliali. Come prova del concetto, stiamo misurando la funzione di due canali ionici in linee cellulari epiteliali ben note. Questo test è versatile, poiché utilizza una sonda chimica esogena per misurare la funzione dei canali ionici, evitando così la necessità di sonde codificate geneticamente.
Questi saggi ad alto rendimento possono identificare e caratterizzare gli effetti dei modulatori di piccole molecole sui canali ionici, che hanno il potenziale per far progredire le terapie per la fibrosi cistica. Per iniziare, coltura di cellule Calu-3 e Caco-2 in un matraccio T75 contenente EMEM con siero bovino fetale al 20% e streptomicina alla penicillina all'1%. Aspirare il mezzo dal matraccio T75 dopo che le celle raggiungono l'80-100% di confluenza.
Lavare delicatamente le cellule con 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Quindi, aggiungere 2 millilitri di tripsina preriscaldata allo 0,25%, con EDTA allo 0,1%, al monostrato cellulare. Porre il matraccio a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti.
In questa fase, assicurarsi che le cellule si sollevino dalla superficie del pallone e si dissocino nella sospensione a cellula singola. Aggiungere 8 millilitri di terreno di coltura per neutralizzare la reazione. Quando le cellule raggiungono il 30-40% di confluenza, aggiungere 1,5 millilitri della sospensione cellulare a 18,5 millilitri di terreno di coltura in un tubo conico e mescolare.
Aggiungere 200 microlitri di questa sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per ottenere circa 140.000 celle per pozzetto. Per placcare una piastra completa da 384 pozzetti, aggiungere 1 millilitro della sospensione cellulare a 17 millilitri del terreno di coltura in un tubo conico per ottenere circa 50.000 cellule per pozzetto. Dopo la miscelazione, aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare a ciascun pozzetto.
Cambiare il terreno ogni due giorni e assicurarsi che le cellule raggiungano il 100% di confluenza entro tre-cinque giorni in tutti i pozzetti contemporaneamente. Cambiare il mezzo 24 ore prima degli studi funzionali. In primo luogo, preparare la soluzione tampone priva di sodio e cloruri con i reagenti elencati nel protocollo di testo.
Aggiungere i reagenti all'acqua bidistillata di grado di coltura tissutale. Lasciare sciogliere i reagenti mescolando per una notte a temperatura ambiente. Dopo che la soluzione è stabile, regolare il pH a 7,4 aggiungendo 1 soluzione molare NMDG goccia a goccia.
Mescolare per 30 minuti e regolare l'osmolarità della soluzione in un intervallo di 300 più o meno 5 millimoli per chilogrammo. Filtrare e conservare la soluzione tampone in flaconi sterili. Quindi, sciogliere 0,5 milligrammi del colorante potenziale di membrana in 1 millilitro di tampone privo di sodio e cloruro e riscaldare la soluzione a 37 gradi Celsius.
Rimuovere il terreno di coltura dai monostrati cellulari Calu-3 e Caco-2. Aggiungere 195 microlitri della soluzione colorante per pozzetto per la piastra a 96 pozzetti e 95 microlitri per pozzetto per una piastra da 384 pozzetti. Lasciare che le cellule carichino il colorante per 35 minuti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Quindi, prendere misure di fluorescenza con eccitazione a 530 nanometri ed emissione a 560 nanometri. Inizialmente, eseguire letture di base continue per cinque minuti a intervalli di 30 secondi. Quindi, aggiungere 5 microlitri di soluzione di Forskolin 400 micromolari a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti, per ottenere una concentrazione finale di Forskolin di un micromolare.
Per la piastra a 384 pozzetti, aggiungere cinque microlitri di soluzione di Forskolin da 20 micromolari. Prendi una valutazione di stimolazione per 20 minuti con misurazioni a intervalli di 15 secondi. Quindi, aggiungere 5 microlitri di una soluzione da 400 micromolari di inibitore CFTR alla piastra a 96 pozzetti, per ottenere una concentrazione finale di 10 micromolari.
Alla piastra a 384 pozzetti, aggiungere 5 microlitri di inibitore CFTR micromolare 200. Eseguire una lettura di inibizione per 15 minuti con misurazioni a intervalli di 30 secondi. Quantifica le misure di intensità di fluorescenza di ciascun pozzetto ed esporta i valori come foglio di calcolo.
in formato colonna, contenente singoli pozzi. Per calcolare i cambiamenti indotti da Forskolin, dividere le misure relative dell'unità di fluorescenza da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti per l'ultima misurazione dell'intensità di fluorescenza della lettura della linea di base e tracciarle. Misurare le risposte di picco come intensità massima di fluorescenza misurata dal basale durante la stimolazione di Forskolin.
Utilizzare questa misurazione, o area sotto la curva, per quantificare la risposta CFTR. La funzione CFTR è stata rilevata come depolarizzazione della membrana dopo stimolazione di Forskolin nelle cellule Caco-2. L'efflusso di fluoro è stato rilevato come un forte aumento della fluorescenza rispetto al DMSO come controllo del veicolo.
Dopo la stimolazione della forskolina, il segnale fluorescente è stato mantenuto fino all'aggiunta dell'inibitore CFTR, dopo di che c'è stato un rapido declino dell'intensità della fluorescenza. Questo fenomeno era riproducibile sia nelle cellule Caco-2 che in quelle Calu-3. L'attività CFTR è stata calcolata come la differenza nella variazione massima della fluorescenza dopo stimolazione con Forskolin o DMSO.
I singoli punti variavano tra più o meno 3 deviazioni standard dalla media nel caso della stimolazione di Forskolin e del controllo DMSO, indicando la riproducibilità del test. Per confermare la specificità delle risposte funzionali, questi saggi del potenziale di membrana possono essere ulteriormente convalidati utilizzando metodi elettrofisiologici convenzionali, come la camera di Ussing. Questa piattaforma è in grado di colmare il divario tra schermi modulatori ad alto rendimento e sistemi di espressione eterologhi e misurazioni bioelettriche dispendiose in termini di tempo in tessuti primari di difficile accesso.
