Fluorescensbaserade membranpotentialanalyser ger robusta metoder för att studera effekterna av modulatorer på jonkanaler som uttrycks endogent i epitelceller. Som proof of concept mäter vi funktionen hos två jonkanaler i välkända epitelcellinjer. Denna analys är mångsidig, eftersom den använder en exogen kemisk sond för att mäta jonkanalfunktionen, vilket kringgår behovet av genetiskt kodade sonder.
Dessa high-throughput analyser kan identifiera och karakterisera effekterna av småmolekylära modulatorer på jonkanaler, som har potential att främja terapier för cystisk fibros. Börja med att odla Calu-3- och Caco-2-celler i en T75-kolv innehållande EMEM med 20% fetalt bovint serum och 1% penicillinstreptomycin. Aspirera mediet från T75-kolven efter att cellerna når 80 till 100% sammanflöde.
Tvätta försiktigt cellerna med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning. Tillsätt sedan 2 ml förvärmt 0,25% trypsin, med 0,1% EDTA, till cellmonoskiktet. Placera kolven på 37 grader Celsius i cirka fem minuter.
I detta steg, se till att cellerna lyfter från kolvytan och dissocieras i encellssuspensionen. Tillsätt 8 ml odlingsmedium för att neutralisera reaktionen. När cellerna når 30 till 40% sammanflöde, tillsätt 1,5 ml av cellsuspensionen till 18,5 ml odlingsmedium i ett koniskt rör och blanda.
Tillsätt 200 mikroliter av denna cellsuspension till varje brunn på en 96-brunnsplatta för att få cirka 140 000 celler per brunn. För att platta en hel 384-brunnsplatta, tillsätt 1 ml av cellsuspensionen till 17 ml av odlingsmediet i ett koniskt rör för att få cirka 50 000 celler per brunn. Efter blandning tillsätt 50 mikroliter av cellsuspensionen till varje brunn.
Byt medium varannan dag och se till att cellerna når 100% sammanflöde inom tre till fem dagar i alla brunnar samtidigt. Byt medium 24 timmar före funktionsstudierna. Bered först den natriumfria, kloridfria buffertlösningen med de reagens som anges i textprotokollet.
Tillsätt reagenserna till vävnadsodlingskvalitet, dubbeldestillerat vatten. Låt reagenserna lösas upp under omrörning över natten vid rumstemperatur. När lösningen är stabil, justera pH till 7,4 genom att tillsätta 1 molar NMDG-lösning droppvis.
Blanda i 30 minuter och justera lösningens osmolaritet till ett intervall av 300 plus eller minus 5 millimol per kilo. Filtrera och förvara buffertlösningen i sterila flaskor. Lös sedan 0,5 milligram av membranpotentialfärgämnet i 1 ml natriumfri, kloridfri buffert och värm lösningen till 37 grader Celsius.
Ta bort odlingsmediet från Calu-3 och Caco-2 cell monolayers. Tillsätt 195 mikroliter färglösning per brunn för 96-brunnsplattan och 95 mikroliter per brunn för en 384-brunnsplatta. Låt cellerna ladda färgämnet i 35 minuter vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.
Ta sedan fluorescensmätningar med excitation vid 530 nanometer och emission vid 560 nanometer. Ta inledningsvis kontinuerliga baslinjeavläsningar i fem minuter med 30 sekunders intervall. Tillsätt sedan 5 mikroliter 400 mikromolar Forskolin-lösning till varje brunn på 96-brunnsplattan, för att få en slutlig Forskolin-koncentration av en mikromolar.
För 384-brunnsplattan, tillsätt fem mikroliter 20 mikromolar Forskolin-lösning. Ta en stimuleringsgrad i 20 minuter med mätningar med 15 sekunders intervall. Tillsätt sedan 5 mikroliter av en 400 mikromolär lösning av CFTR-hämmare till 96-brunnsplattan för att få en slutlig koncentration av 10 mikromolar.
Till 384-brunnsplattan, tillsätt 5 mikroliter 200 mikromolar CFTR-hämmare. Ta en hämningsavläsning i 15 minuter med mätningar med 30 sekunders intervall. Kvantifiera fluorescensintensitetsmätningarna för varje brunn och exportera värdena som ett kalkylblad.
i kolumnformat, innehållande enskilda brunnar. För att beräkna Forskolin-inducerade förändringar, dela de relativa fluorescensenhetsmätningarna från varje brunn på 96-brunnsplattan med den sista fluorescensintensitetsmätningen av baslinjeavläsningen och plotta dem. Mät toppresponsen som den maximala fluorescensintensiteten mätt från baslinjen under Forskolinstimulering.
Använd denna mätning, eller arean under kurvan, för att kvantifiera CFTR-svaret. CFTR-funktionen detekterades som membrandepolarisering efter Forskolin-stimulering i Caco-2-celler. Fluorutflöde detekterades som en kraftig ökning av fluorescens jämfört med DMSO som vehikelkontroll.
Efter Forskolin stimulering, den fluorescerande signalen upprätthölls tills tillsatsen av CFTR-hämmare, varefter det fanns en snabb nedgång i fluorescens intensitet. Detta fenomen var reproducerbart i både Caco-2- och Calu-3-celler. CFTR-aktiviteten beräknades som skillnaden i maximal förändring av fluorescens efter Forskolin- eller DMSO-stimulering.
Individuella punkter varierade mellan plus eller minus 3 standardavvikelser från medelvärdet vid Forskolin-stimulering och DMSO-kontrollen, vilket indikerar analysens reproducerbarhet. För att bekräfta specificiteten av funktionella svar kan dessa membranpotentialanalyser valideras ytterligare med konventionella elektrofysiologiska metoder, såsom Ussing-kammaren. Denna plattform kan överbrygga klyftan mellan modulatorskärmar med hög kapacitet och heterologa uttryckssystem och tidskrävande bioelektriska mätningar i svårtillgängliga primära vävnader.
