Name: tension gauge tether probes for quantifying growth factor mediated integrin mechanics and adhesion
Uploaded: 2022-02-11T14:30:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende medlemmerne af Mattheyses laboratorium for frugtbare diskussioner og kritik. Vi anerkender finansiering til A.L.M. fra NSF CAREER 1832100 og NIH R01GM131099.

1. Fremstilling af TGT oligonukleotid
BEMÆRK: Detaljerne om oligonukleotidsondesyntese er skitseret her. Bemærk, at nogle ændringer og rensningstrin kan outsources til brugerdefineret syntese.
<ol><li>Aktiver den primære amin af cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)] peptidet med azid-NHS-linkeren som beskrevet af Zhang et al22 ved blanding i et 1:1,5-forhold (100:150 nmoler) i et endeligt volumen på 10 μL dimethylformamid. Der tilsættes 0,1 μL af den organiske basistriethylamin, og der inkuberes i 12 timer ved 4 °C.</li>
	<li>Produktet renses ved omvendt fase HPLC ved hjælp af 0,1 M TEAA (opløsningsmiddel A) og 100 % acetonitril (opløsningsmiddel B) med en strømningshastighed på 1 ml/min og udgangsbetingelsen af 10 % opløsningsmiddel B indstillet til en gradient på 0,5 % /min. Kombiner de eluterede toppe (absorbans ved 203 nm) og kontroller ved MALDI-TOF massespektrometri. Produktet er cRGDfK-azid.</li>
	<li>For at generere TGT-topstrengen skal du kombinere cRGDfK-azid og alkyn-21-BHQ2 oligonukleotid (TGT-topstreng: 5Hexynyl/GTGAAATACCGCACAGATGCG/3BHQ_2) i et 2:1-forhold (͂200 μM: 100 μM) i 100 μL 1x phosphatbufferet saltvand (PBS) med 5 mM natriumascorbat og 0,1 μM præformet Cu-THPTA. Reaktionen fortsættes i mindst 4 timer ved stuetemperatur (RT) eller natten over ved 4 °C.</li>
	<li>Behandl blandingen gennem P2-afsaltningsgelen for at fjerne overskydende farvestof, biprodukter, organisk opløsningsmiddel og ikke-reagerede reagenser. Centrifugesøjlen klargøres med 650 μL forhydreret P2-gel ved at dreje den ned på 18.000 x g i 1 min. Kassér gennemstrømningsvæsken, og der tilsættes reaktionsblandingen. Drej igen ved 18.000 x g i 1 minut, og saml gennemstrømningen. Reaktionsblandingen bringes til et endeligt volumen på 300 μL med ultrarent vand. BEMÆRK: Forhydrere P2-gelen med vand i 6 timer.</li>
	<li>Rens den afsaltede reaktionsblanding ved omvendt fase HPLC. De organiske opløsningsmidler, der anvendes til denne oprensning, indbefatter 0,1 M TEAA iH2O(opløsningsmiddel A) og 100% MeCN (opløsningsmiddel B eller den mobile fase).<ol>
<li>Før blandingen injiceres, afbalanceres kolonnen med en indledende tilstand på 10% opløsningsmiddel B med en gradient på 1% / min. Juster strømningshastigheden til 1 ml/min. Reaktionsblandingen injicer HPLC-sløjfen med en 500 μL injektionsnål.</li>
		<li>Produktet opsamles ved at visualisere topabsorptionen ved 260 nm for DNA'et og 560 nm for BHQ2-quencheren. Tør det eluterede produkt natten over i en vakuumcentrifugalkoncentrator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anvend nukleofil substitution for at parre TGT-bundstreng til Cy3B-NHS ester som beskrevet i Ma et. Al25. 100 μM af 56 pN TGT bundstrengen (5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGCGGTATTTTCACTTT) med 50 μg Cy3B-NHS ester foropløst i 10 μL DMSO. pH-værdien af denne blanding justeres til 9 med 0,1 M natriumbicarbonat, og det endelige volumen bringes op på 100 μL med 1x PBS. Reaktionsblandingen inkuberes natten over ved RT.</li>
	<li>Blandingen renses sekventielt ved hjælp af P2-gelfiltrering og omvendt HPLC for at adskille ikke-reagerede reagenser, salte og organiske opløsningsmidler (beskrevet i trin 1.4 og 1.5).</li>
	<li>Koncentrationen af de oprensede oligonukleotidfarvekonjugater anslås ved at registrere deres absorbans ved 260 nm ved hjælp af et spektrofotometer.</li>
	<li>Karakterisere de rensede produkter ved MALDI-TOF massespektrometri. Overskydende 3-hydroxypicolinsyre opløses i TA50-opløsningsmiddel (50:50 v/v acetonitril og 0,1 % TFA i ddH2O) for at forberede den friske MALDI-matrix. Estimerede og målte molekylvægte for de mærkede produkter er: cRGDfK-1-BHQ2 - 8157,9 (beregnet), 8160,1 (fundet); Cy3B mærket 56 pN TGT - 10272,7 (beregnet), 10295,8 (fundet).</li>
	<li>Opløs de øverste og nederste tråde separat i nukleasefrit vand i en koncentration mellem 30-50 μM. Brug DNase-fri pipettespidser for at undgå lagerkontaminering. Opbevares ved 4 °C til kortvarige anvendelser eller -20 °C til langtidsanvendelser. Stabiliteten af oligonukleotider påvirkes ikke af gentagne fryse-optøningscyklusser.</li>
</ol>2. Overfladebehandling
Dag 1:
<ol><li>Anbring 25 mm glasdæksler (op til 8) i et polytetrafluorethylenstativ. Risten anbringes i et 50 ml borosilikatbægerglas indeholdende 40 ml 200 vandtæt ethanol. Bægerglasset dækkes med paraffinfilm for at undgå, at der trænger vand ind, og sonikeres ved en driftsfrekvens på 35 kHz i 10-15 minutter ved RT (figur 1A).</li>
	<li>Et 50 ml bægerglas fyldes med 40 ml piranhaopløsning, der er frisklavet ved at blande svovlsyre og hydrogenperoxid i forholdet 3:1 i et pyrexbægerglas. Rør med en glaspipette. Dækslappen overføres til bægerglasset, og der inkuberes i 30 minutter ved RT i stinkhætten for at ætse dækslens overflade (figur 1B). BEMÆRK: Brug fuld PPE, herunder en laboratoriefrakke, handsker og beskyttelsesbriller, og arbejd i den kemiske røghætte. Tilsæt hydrogenperoxid til syren langsomt for at forhindre overophedning af opløsningen.</li>
	<li>Efter ætsning skal du bruge pincet til at overføre dækslappen til et bægerglas med ultrarent vand. Gentag dette trin seks gange med 15 s intervaller for fuldstændigt at neutralisere syren (figur 1C). BEMÆRK: Lad Piranha-opløsningen stå i den kemiske røghætte natten over, før den kasseres i syreaffaldsbeholderen.</li>
	<li>Undersøg visuelt dækslerne for at sikre, at overfladerne ser rene ud uden mønstre eller støvpartikler på glasoverfladen. Trin 2.1-2.4 gentages, hvis der registreres mønstre eller støv. BEMÆRK: Test overfladens hydrofilicitet ved at dyppe behandlede dækslips i vand og fjerne dem lodret. Vand på behandlede dækslips trækker sig tilbage som et ensartet ark for at danne Youngs ringe sammenlignet med ubehandlede dækslips, der danner patches.</li>
	<li>Dækslappen overføres til et bægerglas med 200 vandtæt ethanol, og vaskes to gange i 15 s for at afbalancere overfladerne til organisk opløsningsmiddel. Overfør dækslappen til 200 bevis ethanolopløsning med 3% APTES i 1 time ved RT for at silanisere dækslipsene (figur 1D). Bægerglasset dækkes med paraffinfilm. BEMÆRK: APTES-aflejringsparametre varierer afhængigt af overfladerensningsmetoden, indholdet af opløsningsmiddelvand, APTES-koncentration, inkubationstider og udglødningstemperatur.</li>
	<li>Stativet nedsænkes i et rent bægerglas med 200 vandtæt ethanolopløsning. Gentag denne vask tre gange i 15 s hver (figur 1E).</li>
	<li>Dækslipsene tørres med nitrogengas (N2) med lavt udgangstryk. Læg dækslerne i en 10 cm polystyrenskål med et stykke paraffinfilm lagt fladt inde i det. Sørg for, at dækslerne er tørre og adskilte (figur 1F).</li>
	<li>Der tilsættes 100 μL 2 mg/ml NHS-biotinopløsning i DMSO til fire dækslips anbragt på paraffinfilm. Sæt en "sandwich" med de fire andre dækslips ovenpå (to dækslips vendt mod hinanden med funktionaliseringsopløsningen imellem) og inkuber fadet natten over ved 4 °C (figur 1G). BEMÆRK: Ved 4 °C er NHS-reagenset mere stabilt, hvilket letter ensartet overfladefunktionalisering. Derudover bevarer sandwichen reagenser. Undgå at tilføje overskydende opløsning i sandwichen, da det kan lække ud og få dækslips til at glide.</li>
</ol>Dag 2:
<ol start="9"><li>Tag fadet ud fra 4 °C, og adskil de sammensmeltede dæksler. Orienter gliderne i stativet med den belagte overflade vendt mod hinanden som vist i figur 2A. Vask dem med 200 vandtæt ethanolopløsning tre gange i 15 s hver. Tør med N2 gas og læg dem i en ny skål med en paraffinfilm inde i den. BEMÆRK: Orientering af dækslips som angivet hjælper med at identificere den funktionaliserede overflade.</li>
	<li>Dækslerne vaskes med 1 ml 1x PBS tre gange for at afbalancere dem tilbage til den vandige fase. Der tilsættes 800 μL 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS (w/v) til hver af dækslipsene, og der inkuberes ved RT i 30 minutter for at passivisere overfladen og blokere ikke-specifik binding af efterfølgende funktionaliseringsreagenser (figur 2B).</li>
	<li>Efter inkubation vaskes dækslerne tre gange med 1 ml 1x PBS. Der tilsættes 800 μL 1 μg/ml streptavidin i 1x PBS ved RT i 45-60 min for at funktionalisere dækslerne (figur 2C). BEMÆRK: Behold en dækslip uden streptavidin for at verificere passiveringseffektivitet (valgfrit). Add10 nM biotinylerede molekyler og billede ved hjælp af eksperimentelle betingelser. Denne overfladeintensitet skal være tæt på kameraets mørke støj.</li>
	<li>Samtidig med trin 2.11 samles TGT-sonderne (øverste: nederste streng i 1:1 molforhold) i en slutkoncentration på 50 nM i 100 μL 1 M NaCl i et PCR-rør ved hjælp af en termocycler. Dissocier tråde ved 95 °C i 5 min og udglødes gradvist ved at reducere temperaturen til 25 °C og opretholde den i 25 min (figur 2D). Undgå udvidet eksponering af TGT-sonder for lys.</li>
	<li>Efter streptavidininkubation skal du bruge 1x PBS til at vaske dækslerne tre gange. Tilsæt 100 μL af de færdigmonterede TGT-sonder til fire af dækslerne, og lav sandwich ved hjælp af de resterende 4 dækslips med den funktionaliserede side vendt mod sonderne (otte overflader kræver fire rør hybridiserede TGT-sonder). Dæk med aluminiumsfolie og inkuber i 1 time ved RT for at tillade sondebinding til overfladen (figur 2E).</li>
	<li>Efter inkubation adskilles sandwicherne og vaskes dækslipsene med 1x PBS tre gange. TGT-overfladerne er nu klar til billeddannelse. Saml forsigtigt dækslerne i præcleaned billeddannelseskamre og tilsæt 1x PBS for at holde overfladerne hydreret (figur 2F). BEMÆRK: Overspænding af kamrene vil knække overfladen. Undgå tørring af overfladerne.</li>
</ol>3. Celleforberedelse og farvning
<ol><li>For at undersøge effekten af den epidermale vækstfaktor (EGF) stimulering på Cos-7 mekanik, vedhæftning og cellespredning, prøv at prøve Cos-7 celler med 0,05% Trypsin-EDTA i 2 min. Neutraliser trypsin ved vask med HBSS og centrifugering ved 800 x g i 5 min. Gentag neutraliseringstrinnet igen.</li>
	<li>Pladeceller med en massefylde på 4 x 104 celler på de samlede TGT-overflader i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 50 ng/ml EGF eller DMEM uden EGF. Lad cellerne sprede sig i 60 minutter ved 37 °C med 5 % CO2 i en cellekulturinkubator (figur 3A). BEMÆRK: Celler inkuberes i DMEM uden serum for at undgå stimulering fra vækstfaktorer. EGF fortyndes i 10 mM eddikesyre for at lave en bestand på 1 mg / ml. Det bruges ved 50 ng / ml i DMEM til billeddannelseseksperimenter.</li>
	<li>Efter inkubation vaskes cellerne tre gange med 1x PBS og fastgøres med 2 ml 4% paraformaldehyd i 12 minutter ved RT (figur 3B). BEMÆRK: Alle inkubationstrin udføres på en roterende ryster ved ~ 35 o / min for ensartet spredning af opløsningerne. Beskyt TGT-overfladerne mod lys ved at dække dem, indtil de er klar til billeddannelse.</li>
	<li>Opsuge fikseringsmidlet og vask dækslerne fem gange med 1x PBS med 5 minutters intervaller ved RT. Eventuelt inkuberes dækslerne med 50 mM NH4Cl i 1x PBS i 30 minutter ved 37 °C for at slukke paraformaldehydassocieret autofluorescens og vask tre gange med 1x PBS med 5 minutters intervaller (figur 3B).</li>
	<li>Buffer A (1x PBS, 5% normalt hesteserum, 5% normalt gedeserum, 1% BSA, 0,025% Triton X-100) tilsættes, og der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C for at blokere og permeabilisere cellerne. Vask tre gange med 1x PBS med 5 minutters intervaller (figur 3B).</li>
	<li>Placer billedkamrene med dækslips i en fugtighedsbeholder. Fortynd det primære anti-paxillin-antistof (fokal adhæsionsmarkør) ved 1:250 i blokerende buffer (1x PBS, 5% normalt hesteserum, 5% normalt gedeserum, 1% BSA, 0,005% Triton x-100). Der inkuberes med 200 μL primær antistofopløsning pr. dækslip i 2 timer ved 37 °C (figur 3B). BEMÆRK: Lad ikke overfladerne tørre ud.</li>
	<li>Vask dækslerne fem gange med 1x PBS med 5 minutters mellemrum og returner dem i fugtighedsbeholderen. Etiketceller samtidig med en blanding af farvestofkonjugeret gede-antikanin sekundært antistof ved 1:800 fortynding og farvestofkonjugeret phalloidin (actin) ved 1:400 fortynding i 200 μL blokerende buffer pr. dækslip. Der inkuberes ved 37 °C i 60 minutter (figur 3B).</li>
	<li>Overfladerne vaskes fem gange med 1x PBS med 5 minutters mellemrum, og de opbevares ved 4 °C, indtil de er klar til billeddannelse (figur 3B). BEMÆRK: Billedprøver inden for 3 dage efter overfladebehandling for at undgå signalnedbrydning.</li>
</ol>4. Erhvervelse af billeder
<ol><li>Brug en olie nedsænkning 60x mål med en høj numerisk blænde (1,49) på et omvendt mikroskop med 488, 561 og 647 TIRF excitation, RICM excitation, et perfekt fokussystem og et digitalt kamera.<ol>
<li>Tilsæt olie til målet, rengør dækslip bunden af prøvekammeret, og læg prøven på scenen. Fokuser på en celle og engager det perfekte fokus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sæt mikroskopet i RICM-billeddannelsestilstand med epifluorescens excitation og en GFP-filterterning med emissionsfilteret fjernet. Juster RICM'en ved at lukke og centrere epi-belysningsåbningsmembranen.</li>
	<li>Sæt mikroskopet i TIRF-tilstand med laser excitation og en quad-pass TIRF filterterning. Fokuser 488 nm laseren til et lille sted på loftet i rummet, og øg indfaldsvinklen indtil forbi den kritiske vinkel, mens du overvåger fluorescens på kameraet i live-tilstand. Overhold en kraftig reduktion i baggrundsfluorescens og et enkelt fokusplan, når den kritiske vinkel overskrides. BEMÆRK: TIRF exciterer et tyndt område (~ 100 nm) tættest på sample-coverslip-grænsefladen, der fremhæver åbne TGT-sonder og fokale adhæsioner, samtidig med at fluorescens uden for fokus elimineres inde fra cellen. Hvis TIRF ikke er til rådighed, kan der anvendes epifluorescens. Signal/støj-forholdet vil dog være lavere.</li>
	<li>Identificer celler til billeddannelse ved hjælp af kameraets "live" -tilstand ved hjælp af RICM.</li>
	<li>Få RICM-billedet og TIRF-billeder af actin (640 nm ex), integrinspænding (561 nm ex) og paxillin (488 nm ex). Få billeder sekventielt ved hjælp af en eksponeringstid på 200 ms. BEMÆRK: Eksponeringstiden afhænger af mange faktorer, herunder målet, lasereffekt, emissionsfiltre og kamerafølsomhed. Signalet skal være mindst 2x større end baggrunden. Baggrunden er omkring 1000 AU, så signalet skal være mindst 2000-3000 AU.</li>
	<li>Gentag 4,4-4,5 for mindst 30 celler. Skift dækslips, fokus og gentag 4.4-4.5.</li>
</ol>5. Analyse af data
BEMÆRK: Udfør kvantitativ billedanalyse ved hjælp af Fiji-softwaren og analysen ved hjælp af statistiksoftware.
<ol><li>Åbn billedsættet for en celle.</li>
	<li>Opret en maske af celleområdet (RICM-maske) ved at spore cellens afgrænsning i RICM-billedet ved hjælp af billedvalgsværktøjet ImageJ Freehand. Gem interesseområdet (ROI) til ROI manager (Analyser > Værktøjer > ROI manager) (Figur 4A1,2).</li>
	<li>Vælg et repræsentativt område uden for cellen i integrinspændingsbilledet, og tegn et investeringsafkast på mindst 200 x 200 pixel. Ekskluder andre celler eller fluorescerende affald fra ROI. Mål baggrundsfluorescensen i ROI ved hjælp af måleværktøjet (Analyze > Measure) (Figur 4A3).</li>
	<li>Subtraher den gennemsnitlige baggrundsfluorescens opnået i trin 5.2 fra spændingsbilledet (Process > Math > Subtraktion) (Figur 4A4).</li>
	<li>Brug ricm-masken, der er fastlagt i trin 5.2, til at definere spændingssignalet i cellefodaftrykket (ROI manager > Select > Apply mask > Edit > Clear outside) (Figur 4A5).</li>
	<li>Opret en tærskelmaske til spændingsbilledet ved hjælp af Huangs metode til automatisk tærskelværdi (billede > Juster > tærskel) (Figur 4A6). Sørg for, at tærskelmasken bedst repræsenterer området for den genererede integrinspænding. Som tommelfingerregel skal du indstille tærsklen til 2x den gennemsnitlige baggrundsfluorescens.</li>
	<li>Oprette en markering af den tærskelspændingsmaske (Rediger > markering > Oprette) (Figur 4A7).</li>
	<li>Overfør den valgte maske til det spændingsbillede, der blev genereret i trin 5.4, og mål den integrerede intensitet af åbne sonder (ROI manager > Select (Tension Mask) > Analyze > Measure > RawIntDen) (Figur 4C).</li>
	<li>Mål cellemorfometrisk egenskabsområde, cirkularitet og billedformat fra RICM-masken (ROI manager > Select (RICM-maske) > Anvend maske > Analyser > Måling) (Figur 4B).</li>
	<li>Mål den mekaniske brudtæthed, defineret som procentdelen af cellefodaftrykket med bristede sonder ved at vælge spændingsmaskebilledet og anvende RICM-masken (ROI manager > Select (RICM Mask) > Analyze > Measure > %Area) (Figur 4C).</li>
	<li>Eksporter målingerne til yderligere analyse og visualisering til statistiksoftware.</li>
	<li>Gentag 5.1-5.11 for hver celle.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lim, C. -. G., Jang, J., Kim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+machinery+for+sensing+mechanical+force.">Cellular machinery for sensing mechanical force.</a> BMB Reports. 51 (12), 623-629 (2018).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Micro)managing+the+mechanical+microenvironment.">(Micro)managing the mechanical microenvironment.</a> Integrative Biology. 3 (10), 959-971 (2011).</li><li>Vogel, V., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+matter+in+health+and+disease.+From+Cancer+to+Tissue+Engineering.">Mechanical forces matter in health and disease. From Cancer to Tissue Engineering.</a> Nanotechnology. , 233-303 (2010).</li><li>Wang, J. H. C., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+rules+cell+biology.">Mechanics rules cell biology.</a> BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 2 (1), 16 (2010).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).</li><li>Streuli, C. H., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+co-operation+between+integrins+and+other+receptor+systems.">Signal co-operation between integrins and other receptor systems.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 491-506 (2009).</li><li>Chiasson-MacKenzie, C., McClatchey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-induced+cytoskeletal+changes+drive+complex+cell+behaviors:+The+tip+of+the+iceberg.">EGFR-induced cytoskeletal changes drive complex cell behaviors: The tip of the iceberg.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li><li>Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+as+biomechanical+sensors+of+the+microenvironment.">Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 457-473 (2019).</li><li>De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+EGFR+signaling+in+tumor+microenvironment.">The role of the EGFR signaling in tumor microenvironment.</a> Journal of Cellular Physiology. 214 (3), 559-567 (2008).</li><li>Javadi, S., Zhiani, M., Mousavi, M. A., Fathi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+Epidermal+Growth+Factor+Receptors+(EGFR)+and+integrins+in+resistance+to+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors+(TKIs)+in+solid+tumors.">Crosstalk between Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR) and integrins in resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in solid tumors.</a> European Journal of Cell Biology. 99 (4), 151083 (2020).</li><li>Eliceiri, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+and+growth+factor+receptor+crosstalk.">Integrin and growth factor receptor crosstalk.</a> Circulation Research. 89 (12), 1104-1110 (2001).</li><li>Dan, L., Jian, D., Na, L., Xiaozhong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+EGFR+and+integrin+affects+invasion+and+proliferation+of+gastric+cancer+cell+line,+SGC7901.">Crosstalk between EGFR and integrin affects invasion and proliferation of gastric cancer cell line, SGC7901.</a> OncoTargets and Therapy. 5, 271-277 (2012).</li><li>Giancotti, F. G., Tarone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+control+of+cell+fate+through+joint+integrin/receptor+protein+kinase+signaling.">Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling.</a> Annual Reviews: Cell and Developmental Biology. 19, 173-206 (2003).</li><li>Ricono, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cross-talk+between+epidermal+growth+factor+receptor+and+integrin+alphavbeta5+promotes+carcinoma+cell+invasion+and+metastasis.">Specific cross-talk between epidermal growth factor receptor and integrin alphavbeta5 promotes carcinoma cell invasion and metastasis.</a> Cancer Research. 69 (4), 1383-1391 (2009).</li><li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell-generated+forces:+a+guide+to+the+available+tools.">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li><li>Hang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosensors+for+single+cell+mechanical+interrogation.">Nanosensors for single cell mechanical interrogation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 179, 113086 (2021).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+traction+forces+by+micropillar+arrays:+contribution+of+substrate+warping+to+pillar+deflection.">Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection.</a> Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li><li>Ma, V. P. -. Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Nanotechnology+as+an+Emerging+Tool+to+Study+Mechanotransduction+in+Living+Systems.">DNA Nanotechnology as an Emerging Tool to Study Mechanotransduction in Living Systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Kim, Y., Kim, K. A., Kim, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+force+sensors+to+study+the+molecular+level+forces+required+to+activate+signaling+pathways.">Double-stranded DNA force sensors to study the molecular level forces required to activate signaling pathways.</a> Journal of the Korean Physical Society. 78 (5), 386-392 (2021).</li><li>Rao, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+activation+attenuates+the+mechanical+threshold+for+integrin+tension+and+focal+adhesion+formation.">EGFR activation attenuates the mechanical threshold for integrin tension and focal adhesion formation.</a> Journal of Cell Sciences. 133 (13), (2020).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Ma, V. P. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+induced+catalytic+amplification+reaction+for+readout+of+receptor-mediated+cellular+forces.">Mechanically induced catalytic amplification reaction for readout of receptor-mediated cellular forces.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5488-5492 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+single+molecular+forces+required+to+activate+integrin+and+notch+signaling.">Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling.</a> Science. 340 (6135), 991-994 (2013).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60-61, 70-85 (2017).</li><li>Kantlehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+coating+with+cyclic+RGD+peptides+stimulates+osteoblast+adhesion+and+proliferation+as+well+as+bone+formation.">Surface coating with cyclic RGD peptides stimulates osteoblast adhesion and proliferation as well as bone formation.</a> ChemBioChem. 1 (2), 107-114 (2000).</li><li>Kapp, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+evaluation+of+the+activity+and+selectivity+profile+of+ligands+for+RGD-binding+integrins.">A comprehensive evaluation of the activity and selectivity profile of ligands for RGD-binding integrins.</a> Scientific Reports. 7, 39805 (2017).</li><li>Kok, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+functional+evaluation+of+RGD-modified+proteins+as+alpha(v)beta(3)+integrin+directed+therapeutics.">Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as alpha(v)beta(3) integrin directed therapeutics.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 128-135 (2002).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2019).</li><li>Luca, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-Jagged+complex+structure+implicates+a+catch+bond+in+tuning+ligand+sensitivity.">Notch-Jagged complex structure implicates a catch bond in tuning ligand sensitivity.</a> Science. 355 (6331), 1320-1324 (2017).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Brockman, J. M., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+proofreading:+a+general+mechanism+to+enhance+the+fidelity+of+information+transfer+between+cells.">Mechanical proofreading: a general mechanism to enhance the fidelity of information transfer between cells.</a> Frontiers in Physics. 7, 14 (2019).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Med den detaljerede trinvise procedure, der er beskrevet ovenfor, kan man forberede TGT-overflader til at kvantificere cellemorfologi og integrinspænding genereret af vedhængende celler under cellefastgørelse og spredning efter behandling med EGF. Det enkle sondedesign og syntese og overfladebehandling sammen med den enkle eksperimentelle opsætning gav en stabil platform til at studere interaktionen mellem EGFR og integriner. Samlet set validerer resultaterne, at ligandafhængig aktivering af EGFR forbedrer cellespredning, indstiller de kraftbærende egenskaber af integrinreceptorer og fremmer fokal vedhæftningsorganisation og modning. Resultaterne opnået ved hjælp af TGT-sonder understøtter den overordnede hypotese om, at vækstfaktorer, såsom EGFR, fungerer som 'mekano-arrangører', hvilket øger mængden og den rumlige organisering af integrinspænding og regulerer orienteringen og mekanikken af fokale adhæsioner.
Ved påføring på TGT-overfladen lander cellerne, binder og spredes, når integrinreceptorerne (αVβ3) sanser og binder til cRGDfK-liganden. Dermed kan TGT-sonderne brydes mekanisk og generere fluorescens på stedet for ligandindgreb. Udlæsningen er den kumulative "krafthistorie" for cellen, der interagerer med overfladen. Der er nogle almindelige problemer med TGT-overfladerne, der kan være til stede under disse eksperimenter. Høj overfladebaggrundsfluorescens (figur 6A, B), ujævn overfladeudseende, cellernes manglende evne til at generere spændingssignal (figur 6C, D) og manglende spredning af celler (figur 6E, F) kan skyldes tekniske mangler med TGT-sonden eller overfladesyntesen. Løsninger på disse fælles problemer fremgår af tabel 1.
Det enkle design af TGT-sonder giver cellebiologer et kraftfuldt værktøj til at studere specifikke vækstfaktor-integrin-signalresultater isoleret uden interferens fra andre celleoverfladereceptorer ved kun at tilvejebringe specifikke ligander og stimuleringer. Derudover tillader TGT-sonder undersøgelse af spændingstærsklen, der understreger individuelle integrinreceptorer under celleadhæsion ved pN-følsomhed. Alternative tilgange rapporterer ikke kræfter udøvet af individuelle receptorer med høj rumlig opløsning i faste prøver31. Traktionskraftmikroskopi er kun følsom over for nN-kræfter, en størrelsesorden højere end de kræfter, der påføres af individuelle integrinreceptorer15, og molekylære spændingssonder måler pN-kræfter, men fordi de er reversible, modstår de ikke robust fiksering. Af disse grunde er TGT-sonder et attraktivt værktøj til at studere mekanikken i vækstfaktor-integrin-interaktioner.
Der er flere tekniske nuancer forbundet med TGT-sonder, der bør overvejes, før man designer et eksperiment. Spændingsbilledet er et øjebliksbillede, der repræsenterer krafthistorikken og ikke en indikator for receptor-ligand-engagementerne på et givet tidspunkt. Da signalgenerering er afhængig af sondeseparation, skyldes TGT-fluorescensen åbne sonder, der ikke er under aktiv spænding fra receptor-ligandinddragelse. Dette betyder, at aflæsningen for integrinspænding opnået på TGT-overfladen er historisk og kumulativ i naturen, der repræsenterer, hvor der var kræfter større end Ttol; placeringen af aktuelle receptorligandkræfter mindre end Ttol rapporteres ikke19,32. Fordi TGT-brud resulterer i afslutning af receptor-ligandinddragelsen, skyldes cellespredning integrin-ligandinteraktioner, der oplever kræfter lavere endT-tol. Brugeren skal derfor være forsigtig, når han definerer tiden efter plettering for at estimere de mekaniske resultater forbundet med integrinbaserede adhæsioner. Endelig skal betydningen af Ttol overvejes. De TGT-sonder, der anvendes her, har enT-tol på 56 pN, hvor Ttol er den konstante kraft, der er nødvendig for at sprænge 50% af sonderne, når de påføres 2 s. Når man overvejer komplicerede biologiske systemer, oplever TGT'er sandsynligvis en heterogen og forskelligartet kraftgradering med varierende tidsafhængigheder. Hvis TGT'er brydes af kræfter større end Ttol, ville fluorescensen være en undervurdering af den samlede spænding. Alternativt kan kræfter underT-tol anvendt i længere varigheder sprænge et tilsvarende antal sonder som høje tærskelkræfter anvendt i kortere tid. Begge disse scenarier kan resultere i den samme fluorescensintensitetsudlæsning, hvilket gør det vanskeligt at løse den nøjagtige spændingsstørrelse eller dynamik ved hjælp af TGT-sonder33,34.
Samlet set bør vurderinger af integrinspænding med vækstfaktorstimulering foretages omhyggeligt ved at designe eksperimenter med interne kontroller, sammenligne spredningsprofiler på andre matrixbelagte overflader, foretage parallelle vurderinger af TGT-fluorescens i celler i nærvær eller fravær af vækstfaktorstimulering og anvende TGT'er med forskelligeT-tol . TGT'er tillader kvantificering af vækstfaktorsignaleringens rolle i reguleringen af integrinreceptorernes mekanik, fokal adhæsionsdynamik og cellespredning. Denne protokol kan bruges som skabelon til mange TGT-baserede eksperimenter ved hjælp af sonder med forskelligeT-tol, forskellige ligander, forskellige celletyper eller forskellige stimuleringsbetingelser. Eventuelle proteiner af interesse kan mærkes efter fiksering, og enhver form for kvantitativ billedanalyse kan implementeres. Som sådan præsenterer vi en skabelon til adskillige TGT-eksperimenter.
Brugen af TGT-sonder er ikke begrænset til at studere integriner, men kan udvides til en bred vifte af cellemembranreceptorer på tværs af forskellige celletyper ved at modificere liganden. TGT-sonder er blevet brugt til at undersøge kræfternes rolle i reguleringen af forskellige receptorsignalkaskader, herunder identifikation af Notch-receptormekanikkens mekaniske rolle i embryonal udvikling og neurogenese35, de kræfter, der formidler identifikation og internalisering af antigener af B-cellereceptorer36, og T-celleoverfladereceptorernes mekaniske korrekturlæsningsevne til at detektere ændringer i kræfter for at øge styrken og specificiteten af signaloverførsel37 . Tilsammen fremhæver disse resultater det enorme potentiale i TGT-sonder i en række eksperimentelle indstillinger.

Celler har den iboende evne til at sanse, generere og reagere på mekaniske kræfter, hvilket fører til ændringer i cellulær fænotype og ombygning af det lokale mikromiljø 1,2. Kræfter spiller en afgørende rolle i reguleringen af mange aspekter af celleadfærd, herunder adhæsion, migration, spredning, differentiering og sårheling 3,4. Afvigelser i den tovejs mekaniske udveksling mellem en celle og mikromiljøet kan føre til syge tilstande, herunder kræft5. Talrige membranreceptorer er involveret i opretholdelse af cellematrixhomeostase; af disse har integriner og epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) robust synergi 6,7. Klassisk etablerer integriner den mekaniske forbindelse mellem mikromiljøet og intracellulært cytoskelet, mens EGFR regulerer cellevækst, proliferation og overlevelse 8,9. EGFR er et højt undersøgt terapeutisk mål, der fokuserer på udefra-ind-regulering, der letter intracellulær signalering. EGFR-integrin crosstalk er blevet etableret genetisk og biokemisk for at regulere udviklingen af flere sygdomme, herunder kræft10,11. Mens undersøgelser indikerer eksistensen af EGFR-integrin-samspil, tilskrives resultaterne signalveje væk fra plasmamembranen 7,12,13,14. Virkningen af EGFR eller andre vækstfaktorer på cellemekanik forbliver stort set uudforsket delvis på grund af manglen på værktøjer til måling af cellulære kræfter og signalresultater. Udfordringen ligger i at identificere passende værktøjer til at studere kommunikationen mellem disse parallelle signalparadigmer og kvantificere deres specifikke bidrag til cellemekanik.
Flere tilgange er blevet udviklet til at måle kræfter genereret af celleadhæsionsreceptorer, og læseren henvises til dybdegående gennemgang af disse teknikker15,16. Kort fortalt er trækkraftmikroskopi og mikrosøjlearraydetektion afhængig af deformation af et underliggende substrat for at udlede nanonewton (nN) kræfter, en størrelsesorden mere end individuelle receptorkræfter17,18. Enkeltmolekyleteknikker, herunder AFM og optisk pincet, er følsomme over for enkeltprotein piconewton (pN) kræfter, men måler kun en receptor ad gangen og tilbyder ikke god (eller nogen) rumlig opløsning. DNA-baserede molekylære spændingssonder og spændingsmåler tether (TGT) sonder tilbyder pN-kraftopløsning med diffraktionsbegrænset (eller bedre) rumlig opløsning, hvilket giver dem en unik rolle i studiet af enkeltcellekræfter 19,20 fra forskellige celletyper, herunder fibroblaster, kræftceller, blodplader og immunceller 21,22,23,24 . Mens molekylære spændingssonder har et udvideligt "fjeder" -element, ideelt til billeddannelse i realtid, brister TGT-sonder irreversibelt og efterlader en fluorescerende "krafthistorie". TGT'er modulerer desuden spændingstærsklen for det underliggende substrat; en række sonder med lignende kemiske sammensætninger, men forskellige brudkræfter eller spændingstolerancer (T tol), kan brugestil at kvantificere den minimale spænding, der kræves til fokal vedhæftningsdannelse og cellespredning. TGT-sonder består af to komplementære DNA-strenge, den ene forankret til overfladen og den anden præsenterer en ligand for cellen. Hvis en receptor binder liganden og udøver en kraft større end sondensT-tol, adskilles trådene. Ttol defineres som den konstante kraft, der er nødvendig for at briste 50% af sonderne i et 2 s interval under ideelle forhold. I "turn-on" TGT-sonder kan en quencher på den øverste streng adskilles fra en fluorofor på bundstrengen. Kun hvor TGT-sonden er blevet brudt, formodentlig med kræfter større end eller lig med Ttol, vil der blive genereret et fluorescerende signal. TGT-sonder kan også fastgøres, hvilket giver mulighed for nem manipulation af biologiske systemer og test af flere forhold. Af disse grunde blev TGT-sonder anvendt i dette arbejde.
TGT-sonder blev anvendt til at undersøge, hvordan integrinafhængig celleadhæsion og mekaniske kræfter moduleres af aktiveret EGFR21. Dette arbejde etablerede EGFR som en 'mechano-organisator', tuning fokal vedhæftningsorganisation og spændingsgenerering. Derudover blev det konstateret, at EGF-stimulering påvirkede fordelingen og modenheden af fokale adhæsioner og forbedret cellespredning. Denne tilgang kan bruges i fremtidige undersøgelser til at undersøge, hvordan vækstfaktorer påvirker mekaniske kræfter i tumorprogression og dynamik. Mens EGFR-integrin-krydstales rolle i reguleringen af epitelet til mesenkymal overgang er etableret, forbliver de mekaniske kræfters rolle i denne proces underudforsket10.
Her præsenteres en detaljeret protokol for disse eksperimenter, der dækker syntese og samling af 56 pN TGT-sonder, generering af TGT-overflader på glasdæksler, anvendelse af Cos-7-celler på TGT-overfladen og stimulering med EGF, fiksering og farvning af celler med phalloidin og et anti-paxillin-antistof, højopløsnings total intern refleksionsfluorescens (TIRF) og refleksionsinterferenskontrastmikroskopi (RICM) billeddannelse, og billedkvantificering. Denne protokol, selvom den er skrevet for at undersøge EGF-stimulering af Cos-7-celler, kan let tilpasses til mange TGT-baserede eksperimenter. Forskellige ligander,T-tol, celletyper, stimuleringsparametre, proteiner mærket efter fiksering og kvantitativ analyse kan let erstattes i, hvilket gør denne protokol robust og meget nyttig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>440140</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>Maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38S</td>
			<td>Diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8878S</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A687</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Paxillin antibody [Y113]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Gel P-2</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cos-7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>Cell Culture, Passage numbers 11-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid</td>
			<td>Vivitide</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PHR1553</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10013C</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor human EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-438-026</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurobrite DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21244</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-210-064</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-161</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16050130</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88902</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Gas Cylinder</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips - 25 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Laboratory Film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Surface Preparation/Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-070-063</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Low Form Griffin Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540G</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-310</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21335</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300-500</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEAA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0322726</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>471283</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28901</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1296293</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>85111</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, DNA Grade, DNASE, Protease free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>653950-702</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-813</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>pe Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM Cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA v-nIR Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 75D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13710</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td>Quantitative Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph Pad Prism</td>
			<td>Graph Pad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo name</td>
			<td>5&#39;modification/ 3&#39; modification</td>
			<td>Sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyne-21-BHQ2</td>
			<td>5&#39; Hexynyl/ 3&#39; BHQ_2</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCG</td>
			<td>Top strand TGT probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>56 pN TGT</td>
			<td>5&#39; Biosg/TTTTTT/iUniAmM</td>
			<td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td>
			<td>Bottom strand TGT probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 pN TGT</td>
			<td>5&#39; AmMC6/ 3&#39; BioTEG</td>
			<td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td>
			<td>Bottom strand TGT probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tension gauge tether probes for quantifying growth factor mediated integrin mechanics and adhesion

Multicellulære organismer er afhængige af interaktioner mellem membranreceptorer og beslægtede ligander i den omgivende ekstracellulære matrix (ECM) for at orkestrere flere funktioner, herunder adhæsion, proliferation, migration og differentiering. Mekaniske kræfter kan overføres fra cellen via adhæsionsreceptorintegrin til ligander i ECM. Mængden og den rumlige organisering af disse cellegenererede kræfter kan moduleres af vækstfaktorreceptorer, herunder epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR). De værktøjer, der i øjeblikket er tilgængelige til at kvantificere krydstalemedierede ændringer i cellemekanik og relatere dem til fokale adhæsioner, cellulær morfologi og signalering, er begrænsede. DNA-baserede molekylære kraftsensorer kendt som spændingsmålerbindinger (TGT'er) er blevet anvendt til at kvantificere disse ændringer. TGT-sonder er unikke i deres evne til både at modulere den underliggende krafttærskel og rapportere piconewtonskalareceptorkræfter over hele den vedhængende celleoverflade ved diffraktionsbegrænset rumlig opløsning. TGT-sonderne, der anvendes her, er afhængige af den irreversible dissociation af en DNA-duplex af receptor-ligandkræfter, der genererer et fluorescerende signal. Dette muliggør kvantificering af cellens kumulative integrinspænding (krafthistorie). Denne artikel beskriver en protokol, der anvender TGT'er til at studere virkningen af EGFR på integrinmekanik og vedhæftningsdannelse. Samlingen af den mekaniske TGT-sensorplatform er systematisk detaljeret, og proceduren for billedkræfter, fokale adhæsioner og cellespredning er skitseret. Samlet set gør evnen til at modulere sondens underliggende krafttærskel, adhæsionsliganden og typen og koncentrationen af vækstfaktor, der anvendes til stimulering, dette til en robust platform til undersøgelse af samspillet mellem forskellige membranreceptorer i regulering af integrinmedierede kræfter.

Turn-on TGT-sonder blev brugt til at undersøge effekten af ligandaktiveret epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) på integrinmedieret cellemekanik og adhæsionsdannelse i Cos-7-celler21. Sonderne præsenterer ligandcykliske Arg-Gly-Asp-Phe-Lys (cRGDfK)21,23,25,26, som er selektiv for den integrinske heterodimer αVβ3 med kun en lille affinitet for α5β1 integriner 27,28,29,30. TGT-sonden består af et duplex-DNA, der er funktionaliseret på en glasdækslipoverflade via bundstrengen ved hjælp af biotin-streptavidinbinding. Den øverste streng viser integrinliganden og er tilgængelig til at binde til den beslægtede integrinereceptor på cellemembranen (figur 5A). Den nederste streng er mærket med en fluorofor og den øverste streng med en quencher, hvilket fører til minimal baggrundsfluorescens, når duplex TGT er intakt. Hvis en integrin binder liganden og anvender en kraft med en størrelse større end sondensT-tol, vil DNA-duplexet adskille, hvilket fører til fluorescens (figur 5A). Enhver TGT-sonde, der ikke er blevet brudt af en mekanisk kraft, forbliver ikke-fluorescerende. Denne kraftselektive tændingsfluorescens muliggør systematisk og kvantitativ kortlægning af pN-skala integringenererede kræfter ved diffraktionsbegrænset opløsning. TGT-sonder modulerer desuden substratets spændingstærskel.
Vist her er et repræsentativt eksempel på en TGT-overflade med enT-tol på 56 pN. Cos-7-celler blev belagt på denne TGT-overflade med eller uden EGF-stimulering for at studere virkningen af EGFR-aktivering med ligandstimulering på celleadhæsion og integrinmekanik (figur 5A, B). Cellerne blev inkuberet med eller uden EGF på TGT-overfladerne i 60 minutter, fikseret og immunfarvet for at vise den fokale vedhæftningsfordeling (paxillin) og organiseringen af cytoskelettet (F-actin) (figur 5B). Cellerne blev derefter afbildet ved hjælp af RICM og TIRF mikroskopi. Som det tydeligt ses på RICM-billedet, blev Cos-7-cellespredning på 56 pN TGT-overfladen signifikant forbedret med EGF-stimulering sammenlignet med uden stimulering. Dette blev kvantificeret for 50 celler i hver tilstand ved at måle størrelsen af celle-substratkontaktområdet fra RICM-billedet (figur 5C). Stimulering med EGF resulterede i en mere cirkulær morfologi, der var repræsentativ for Cos-7-celler, der spredte sig og voksede i deres naturlige fysiologiske miljø (figur 5D). Fluorescensen fra åbne sonder er også højere med EGF-stimulering som observeret i spændingsfluorescensbilledet. Den integrerede intensitet af åbne sonder, som er proportional med antallet af åbne sonder, var meget højere med EGF-stimulering sammenlignet med uden (figur 5B, E). Dette er en repræsentation af alle receptor-ligand engagementer, hvor integriner påførte en kraft større end Ttol (56 pN).
Farvning med paxillin viste, at fordeling, antal, modning (størrelse) og organisering af fokale adhæsioner også blev påvirket af EGF-stimulering. Fokale adhæsioner i EGF-stimulerede celler forekom mere modne og radialt orienterede sammenlignet med ingen EGF-kontroller. F-actin cytoskeletal organisation blev også forbedret med EGF-stimulering, som vurderet ved phalloidinfarvning (figur 5B). Disse kvalitative vurderinger blev foretaget ved visuel sammenligning af billeder fra begge behandlingsgrupper. Kvantitativ analyse af fokal vedhæftning kan udføres, men ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. I dette eksperiment gav TGT-overfladen en platform til systematisk at detaljere effekten af EGFR-aktivering på cellespredning, integrinmekanik og fokal vedhæftningsdannelse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk for dag 1 i TGT-overfladebehandling. (A) Rengør dækslerne. (B) Æts dækslens overflade. (C) Neutraliser Piranha-opløsningen. (D) Silanisere overfladen for at lave reaktive amingrupper. (E) Ligevægt dækslips til den organiske fase. F) Dækslipsene tørres med en inaktiv gas. (G) Biotinylat overfladeamingrupperne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk for dag 2 i TGT-overfladebehandling. (A) Rengør og tør dækslerne for at fjerne eventuelle resterende biotin fra dagen før. (B) Passivér med BSA for at forhindre ikke-specifik binding af reagens i efterfølgende trin. (C) Funktionaliser dækslipsene med streptavidin. (D) Hybridiser sonderne i en termocyklist. (E) Påfør de syntetiserede sonder på dækslipsene (F) Saml dækslippen i cellebilledkammeret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig03.jpg"> Figur 3: Generel arbejdsgang, der fremhæver de brede trin på tværs af hele forsøgsopsætningen. (A) Proces til celleafmontering og plettering på TGT-overfladen i basale medier (DMEM) med eller uden EGF-stimulering. (B) Rutediagram over de trin, der er involveret i fiksering og immunfarvning efter fastgørelse og spredning på TGT-overfladen. (C) Efter farvning afbildes celler på et omvendt fluorescensmikroskop med RICM- og TIRF-mikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig04.jpg"> Figur 4: Eksempel på databehandling og kvantitativ analyse. (A) Trin-for-trin opdeling af den analysepipeline, der anvendes i Fiji (ImageJ) til RICM og kvantificering af spændingsbilleder. (B) Et repræsentativt eksempel på cellemorfometriske resultater analyseret ved hjælp af ovenstående pipeline. (C) Repræsentative eksempler på cellemekaniske resultater analyseret ved hjælp af ovennævnte rørledning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig05.jpg"> Figur 5: Eksempeldata fra et TGT-eksperiment. (A) Diagram, der fremhæver kontaktzonen ved cellemembran-TGT-overfladegrænsefladen. Indsatte projekter integriner, der interagerer med sin beslægtede ligand cRGDfK med (højre) eller uden (venstre) EGF-stimulering. (B) RICM- og TIRF-billeder af Cos-7-celler spredt på 56 pN TGT-overfladen. Billederne er hentet 60 min efterbelægning med eller uden EGF-stimulering. Individuelle RICM (som erhvervet), integrinspænding (gråtoner), paxillin (orange hot) og F-actin (blågrøn) billeder vises med overlays for begge stimuleringsbetingelser. Skala Bar: 10 μm. Indsatsen fremhæver en zoomet ROI (interesseregion), der beskriver koloniseringen af den genererede integrinspænding på steder med adhæsionsdannelse præget af paxillin og den underliggende subcellulære cytoskeletale organisation præget af actin. Skala Bar: 5 μm. (C-E) Spredningsdiagrammer for spredningsområdet (RICM-cellefodaftryk) (C), cirkularitet (D) og integreret spænding (E) for Cos-7-celler med eller uden EGF-stimulering. Søjler angiver middelværdi ± s.d. Forskelle mellem grupperne blev vurderet statistisk med Student's t-test; P < 0,0001. n = 50 celler på tværs af tre uafhængige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig06.jpg"> Figur 6: Eksempel på TGT-overflader med forskellige mulige problemer. (A) Spændings- og RICM-billeder af en ideel TGT-overflade med samlet sonde slukket før celleadhæsion. (B) Spændings- og RICM-billeder af en TGT-overflade, hvor TGT-sonden mangler den øverste streng (quencher). Spændingsbillede viser ensartet fluorescens fra åben fluorofor i bundstrengen. (C) Spændings- og RICM-billeder til celler spredt på en ideel TGT-overflade. (D) Spændings- og RICM-billeder for celler spredt på en dårligt fremstillet TGT-overflade med begrænset passivering eller nedbrudt sonde. (E) Spændings-, RICM- og brightfieldbilleder for celler belagt på en ideel overflade med cRGDfK-ligand, der indikerer cRGDfK-integrin-interaktioner, er afgørende for cellebinding og spændingsgenerering. (F) Spændings-, RICM- og brightfieldbilleder for celler belagt på en overflade uden cRGDfK-ligand på TGT. Mens cellerne er synlige i brightfield-billedet, observeres der ingen cellebinding eller genereret integrinspænding. Skala Bar: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion at JoVE.com

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

TGT overflade er en innovativ platform til at studere vækstfaktor-integrin crosstalk. Det fleksible sondedesign, vedhæftningsligandens specificitet og præcise modulering af stimuleringsbetingelser muliggør robuste kvantitative vurderinger af EGFR-integrin-samspil. Resultaterne fremhæver EGFR som en 'mechano-organizer' tuning integrin mekanik, der påvirker fokal vedhæftningssamling og cellespredning.

Spændingsmåler tether prober til kvantificering af vækstfaktor medieret integrin mekanik og vedhæftning

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

Denne protokol er vigtig på grund af enkelheden i TGT-sensorplatformen, der bruges til at studere EGFR-integrin crosstalk og dens indflydelse på cellemekaniske kræfter. Rao skitserede at undersøge EGF-afhængig regulering af cellemekanik. Protokollen kan tilpasses til forskellige ligander, celletyper, stimuleringsparadigmer og kan kombineres med TGT'er med varierende spændingstærskler.Overfladesyntese kan virke skræmmende i starten. Nøglen er at være forberedt og organiseret til præcist at udføre de indviklede trin ved at anvende en tjekliste til reagensforberedelse og beregninger. På dag ét skal du placere op til otte 25 millimeter glasdæksel glider ind i et polytetrafluorethylenstativ.Anbring stativet i et 50 ml borosilikatbægerglas indeholdende 40 ml 200-bevis ethanol. Sonikere med en driftsfrekvens på 35 kilohertz i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur. Et 50 ml bægerglas fyldes med 40 ml piranha-opløsning, der er frisklavet ved at blande svovlsyre og hydrogenperoxid i forholdet 3:1 i et Pyrex-bægerglas og omrøres med en glaspipette.Dækstativet hældes i bægerglasset, og der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i stinkhætten for at ætse dækslipfladen. Efter ætsning overføres dæksnapstativet til et bægerglas med ultrarent vand med pincet. Undersøg visuelt dækslet for at sikre, at overfladerne ser rene ud uden mønstre eller støvpartikler på glasoverfladen.Dækstativet overføres til et bægerglas med 200-bevis ethanol, og vask to gange i 15 sekunder for at afbalancere overfladerne til organisk opløsningsmiddel. Overfør dækslet til 200-bevis ethanolopløsning med 3% APTES i en time ved stuetemperatur for at silanisere dækslipsene. Stativet nedsænkes i et rent bægerglas med 200-bevis ethanolopløsning.Tør dækslet glider ved hjælp af nitrogengas med lavt udgangstryk. Anbring dækslet i en 10 centimeter polystyrenskål med et stykke parrafinfilm lagt fladt inde i det. Tilsæt 100 mikroliter af to milligram pr. milliliter NHS-biotinopløsning i DMSO til fire dæksedler anbragt på paraffinfilm.Sæt en sandwich med de fire andre dækslips ovenpå, med to dækslips vendt mod hinanden med funktionaliseringsløsningen imellem. På dag to skal du fjerne skålen fra fire grader Celsius og adskille de sandwichede dæksedler. Undgå at ridse eller beskadige den funktionaliserede overflade, mens du adskiller sandwichen.Orienter derefter dækslet i stativet med den belagte overflade vendt mod hinanden. Tør med nitrogengas. Læg dækslet i en ny skål med en parrafinfilm inde i den.Der tilsættes 800 mikroliter 0,1 % bovint serumalbumin i 1X PBS til hver dækseddel. Inkuber dækslet glider ved stuetemperatur i 30 minutter for at passivisere overfladen og blokere uspecifik binding af efterfølgende funktionaliseringsreagenser. For at funktionalisere dæksedlerne tilsættes 800 mikroliter af et mikrogram pr. milliliter streptavidin i 1X PBS ved stuetemperatur i 45 til 60 minutter.Saml TGT-sonderne i et PCR-rør ved hjælp af en termocyklist. Efter inkubation vaskes dækslet tre gange med 1X PBS. Tilsæt 100 mikroliter af de formonterede TGT-sonder til fire dæksedler, og lav sandwich ved hjælp af de resterende fire dæksedler med den funktionaliserede side vendt mod sonderne.Dæk med aluminiumsfolie. Efter inkubation skal du adskille sandwicherne og vaske dæksedlerne med 1X PBS tre gange. Saml forsigtigt dækslet i forrensede billedkamre.For at undersøge effekten af den epidermale vækstfaktorstimulering på Cos-7-mekanik, adhæsion og cellespredning, prøv at prøve Cos-7-celler med 0,05% trypsin-EDTA i to minutter. Neutraliser trypsin ved vask med HBSS og centrifugering ved 800 G i fem minutter. Pladeceller med en tæthed på 40.000 celler på de samlede TGT-overflader i DMEM suppleret med 50 nanogram pr. milliliter EGF eller DMEM uden EGF.Efter inkubation vaskes cellerne tre gange med 1X PBS. Fix med to milliliter 4% paraformaldehyd i 12 minutter ved stuetemperatur. Dækslet vaskes fem gange med 1X PBS med fem minutters mellemrum ved stuetemperatur.Eventuelt inkuberes dæksedlerne med 50 millimolar ammoniumchlorid i 1X PBS i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Tilsæt buffer A, og anbring billedkamrene med dækslips i en fugtighedsbeholder. Inkuberes i 30 minutter ved 37 grader Celsius for at blokere og permeabilisere cellerne.Det primære anti paxillinantistof fortyndes ved 1:250 fortyndinger i blokerende buffer. Inkuberes med 200 mikroliter primær antistofopløsning pr. dækslip i to timer ved 37 grader Celsius. Mærk celler samtidigt med en blanding af dikonjugeret gede/antikanin sekundært antistof ved 1:800 fortynding og dikonjugeret phalloidin ved 1:400 fortyndinger i 200 mikroliter blokerende buffer pr. dækslip.Overfladerne vaskes fem gange med 1X PBS med fem minutters mellemrum. Til at begynde med tilsættes olie til målet, rengør dækslet nederst i prøvekammeret, og læg prøven på scenen. Fokuser på en celle og engager det perfekte fokus.Juster RICM'en ved at lukke og centrere epi-belysningsåbningsmembranen. Fokuser laseren på 488 nanometer til et lille sted på loftet i rummet, og øg indfaldsvinklen indtil forbi den kritiske vinkel, mens du overvåger fluorescens på kameraet i live-tilstand. Overhold en kraftig reduktion i baggrundsfluorescens og et enkelt fokusplan, når den kritiske vinkel overskrides.Identificer celler til billeddannelse ved hjælp af kameraets live-tilstand ved hjælp af RICM. Erhverv RICM- og TIRF-billederne af actin ved 488-nanometer excitation, integrinspænding ved 561-nanometer excitation og paxillin ved 647-nanometer excitation. Få billeder sekventielt ved hjælp af en eksponeringstid på 200 millisekunder.Skift dæksedler, fokuser og gentag. Cos-7-celler blev belagt på denne TGT-overflade med eller uden EGF-stimulering for at studere virkningen af EGFR-aktivering med ligandstimulering på integrinmekanik. Hvis en integrin binder liganden og anvender en kraft, der er større end sondens spændingstærskel, vil DNA-duplexet adskille sig, hvilket fører til fluorescens.Enhver TGT-sonde, som en mekanisk kraft ikke har bristet, forbliver ikke-fluorescerende. Cellerne blev inkuberet med eller uden EGF på TGT-overfladerne i 60 minutter, fikseret og immunostained for at vise den fokale vedhæftningsfordeling og organiseringen af cytoskelettet. På RICM-billedet blev Cos-7-cellespredning på 56-piconewton TGT-overfladen signifikant forbedret med EGF-stimulering sammenlignet med uden stimulering.Stimulering med EGF resulterede i en mere cirkulær morfologi, der repræsenterer Cos-7 cellespredning og vækst. Fluorescensen fra åbne sonder er også højere med EGF-stimulering, som observeret i spændingsfluorescensbilledet. Den integrerede intensitet af åbne sonder proportional med antallet af åbne sonder var meget højere med EGF-stimulering end uden stimulering.Husk altid retningen af dækslerne, så den funktionaliserede overflade vender opad. Når du adskiller sandwichen, skal du være forsigtig, så overfladen ikke ridses eller beskadiges. Efter overfladesyntese kan man sondere for cytoplasmatiske proteiner, der regulerer celleadhæsion eller mekanisk transduktion.Dette muliggør identifikation af nedstrøms signalmolekyler involveret i orkestrering af cellemekanik ved plasmamembranen.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Modificeret Gær-Two-Hybrid system til at identificere Proteiner Interaktion med Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robust 3D DNA FISH Brug Direkte mærkede prober

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematisk Analyse af celledeling og Expansion: Kvantificering af Cellular Grundlag for vækst og Sampling Developmental zoner i<em&gt; Zea mays</em&gt; Blade

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analyse Cell Surface Vedhæftning Remodeling i Reaktion på Mekanisk Tension Brug magnetiske perler

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Signaling

Molekylær analyse af endotel-mesenchymale overgang induceret af Transforming Growth Factor-β signalering

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...