Name: tension gauge tether probes for quantifying growth factor mediated integrin mechanics and adhesion
Uploaded: 2022-02-11T14:30:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion at JoVE.com

המחברים מבקשים להכיר את חברי המעבדה של מתייס לדיונים ולביקורות פוריים. אנו מכירים במימון ל- A.L.M. מ- NSF CAREER 1832100 ו- NIH R01GM131099.

<ol>
	<li>Lim, C. -. G., Jang, J., Kim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+machinery+for+sensing+mechanical+force.">Cellular machinery for sensing mechanical force.</a> BMB Reports. 51 (12), 623-629 (2018).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Micro)managing+the+mechanical+microenvironment.">(Micro)managing the mechanical microenvironment.</a> Integrative Biology. 3 (10), 959-971 (2011).</li><li>Vogel, V., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+matter+in+health+and+disease.+From+Cancer+to+Tissue+Engineering.">Mechanical forces matter in health and disease. From Cancer to Tissue Engineering.</a> Nanotechnology. , 233-303 (2010).</li><li>Wang, J. H. C., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+rules+cell+biology.">Mechanics rules cell biology.</a> BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 2 (1), 16 (2010).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).</li><li>Streuli, C. H., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+co-operation+between+integrins+and+other+receptor+systems.">Signal co-operation between integrins and other receptor systems.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 491-506 (2009).</li><li>Chiasson-MacKenzie, C., McClatchey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-induced+cytoskeletal+changes+drive+complex+cell+behaviors:+The+tip+of+the+iceberg.">EGFR-induced cytoskeletal changes drive complex cell behaviors: The tip of the iceberg.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li><li>Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+as+biomechanical+sensors+of+the+microenvironment.">Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 457-473 (2019).</li><li>De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+EGFR+signaling+in+tumor+microenvironment.">The role of the EGFR signaling in tumor microenvironment.</a> Journal of Cellular Physiology. 214 (3), 559-567 (2008).</li><li>Javadi, S., Zhiani, M., Mousavi, M. A., Fathi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+Epidermal+Growth+Factor+Receptors+(EGFR)+and+integrins+in+resistance+to+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors+(TKIs)+in+solid+tumors.">Crosstalk between Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR) and integrins in resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in solid tumors.</a> European Journal of Cell Biology. 99 (4), 151083 (2020).</li><li>Eliceiri, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+and+growth+factor+receptor+crosstalk.">Integrin and growth factor receptor crosstalk.</a> Circulation Research. 89 (12), 1104-1110 (2001).</li><li>Dan, L., Jian, D., Na, L., Xiaozhong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+EGFR+and+integrin+affects+invasion+and+proliferation+of+gastric+cancer+cell+line,+SGC7901.">Crosstalk between EGFR and integrin affects invasion and proliferation of gastric cancer cell line, SGC7901.</a> OncoTargets and Therapy. 5, 271-277 (2012).</li><li>Giancotti, F. G., Tarone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+control+of+cell+fate+through+joint+integrin/receptor+protein+kinase+signaling.">Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling.</a> Annual Reviews: Cell and Developmental Biology. 19, 173-206 (2003).</li><li>Ricono, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cross-talk+between+epidermal+growth+factor+receptor+and+integrin+alphavbeta5+promotes+carcinoma+cell+invasion+and+metastasis.">Specific cross-talk between epidermal growth factor receptor and integrin alphavbeta5 promotes carcinoma cell invasion and metastasis.</a> Cancer Research. 69 (4), 1383-1391 (2009).</li><li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell-generated+forces:+a+guide+to+the+available+tools.">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li><li>Hang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosensors+for+single+cell+mechanical+interrogation.">Nanosensors for single cell mechanical interrogation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 179, 113086 (2021).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+traction+forces+by+micropillar+arrays:+contribution+of+substrate+warping+to+pillar+deflection.">Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection.</a> Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li><li>Ma, V. P. -. Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Nanotechnology+as+an+Emerging+Tool+to+Study+Mechanotransduction+in+Living+Systems.">DNA Nanotechnology as an Emerging Tool to Study Mechanotransduction in Living Systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Kim, Y., Kim, K. A., Kim, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+force+sensors+to+study+the+molecular+level+forces+required+to+activate+signaling+pathways.">Double-stranded DNA force sensors to study the molecular level forces required to activate signaling pathways.</a> Journal of the Korean Physical Society. 78 (5), 386-392 (2021).</li><li>Rao, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+activation+attenuates+the+mechanical+threshold+for+integrin+tension+and+focal+adhesion+formation.">EGFR activation attenuates the mechanical threshold for integrin tension and focal adhesion formation.</a> Journal of Cell Sciences. 133 (13), (2020).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Ma, V. P. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+induced+catalytic+amplification+reaction+for+readout+of+receptor-mediated+cellular+forces.">Mechanically induced catalytic amplification reaction for readout of receptor-mediated cellular forces.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5488-5492 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+single+molecular+forces+required+to+activate+integrin+and+notch+signaling.">Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling.</a> Science. 340 (6135), 991-994 (2013).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60-61, 70-85 (2017).</li><li>Kantlehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+coating+with+cyclic+RGD+peptides+stimulates+osteoblast+adhesion+and+proliferation+as+well+as+bone+formation.">Surface coating with cyclic RGD peptides stimulates osteoblast adhesion and proliferation as well as bone formation.</a> ChemBioChem. 1 (2), 107-114 (2000).</li><li>Kapp, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+evaluation+of+the+activity+and+selectivity+profile+of+ligands+for+RGD-binding+integrins.">A comprehensive evaluation of the activity and selectivity profile of ligands for RGD-binding integrins.</a> Scientific Reports. 7, 39805 (2017).</li><li>Kok, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+functional+evaluation+of+RGD-modified+proteins+as+alpha(v)beta(3)+integrin+directed+therapeutics.">Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as alpha(v)beta(3) integrin directed therapeutics.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 128-135 (2002).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2019).</li><li>Luca, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-Jagged+complex+structure+implicates+a+catch+bond+in+tuning+ligand+sensitivity.">Notch-Jagged complex structure implicates a catch bond in tuning ligand sensitivity.</a> Science. 355 (6331), 1320-1324 (2017).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Brockman, J. M., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+proofreading:+a+general+mechanism+to+enhance+the+fidelity+of+information+transfer+between+cells.">Mechanical proofreading: a general mechanism to enhance the fidelity of information transfer between cells.</a> Frontiers in Physics. 7, 14 (2019).</li></ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

בעזרת הפרוצדורה המפורטת שלב אחר שלב שתוארה לעיל, ניתן להכין משטחי TGT לכימות המורפולוגיה של התאים ומתח האינטגרין הנוצרים על ידי תאים דביקים במהלך חיבור התא והתפשטותם לאחר הטיפול ב-EGF. תכנון הגשושית הפשוט והסינתזה והכנת פני השטח יחד עם מערך הניסוי הפשוט סיפקו פלטפורמה יציבה לחקר האינטראקציה של EGFR ואינטגרין. באופן כללי, התוצאות מאמתות כי הפעלה תלוית ליגנד של EGFR משפרת את התפשטות התאים, מכווננת את תכונות נושאות הכוח של קולטני אינטגרין, ומקדמת את ארגון ההדבקה וההבשלה של המוקד. התוצאות המתקבלות באמצעות בדיקות TGT תומכות בהשערה הכוללת כי גורמי גדילה, כגון EGFR, פועלים כ'מארגני מכאנו', מה שמגדיל את הכמות והארגון המרחבי של מתח האינטגרין ומווסת את האוריינטציה והמכניקה של הידבקויות מוקדיות.
עם היישום על פני השטח של TGT, התאים נוחתים, מתחברים ומתפשטים כאשר קולטני האינטגרין (αVβ3) חשים ונקשרים לליגנד cRGDfK. בכך ניתן לקרוע את בדיקות ה-TGT באופן מכני, וליצור פלואורסצנציה באתר של מעורבות ליגנד. הקריאה היא "היסטוריית הכוח" המצטברת של התא המקיים אינטראקציה עם פני השטח. ישנן כמה בעיות נפוצות עם משטחי TGT שיכולים להיות נוכחים במהלך ניסויים אלה. פלואורסצנציה של רקע גבוה על פני השטח (איור 6A,B), מראה פני שטח מטושטש, כישלון של התאים ביצירת אות מתח (איור 6C,D) וכישלון של תאים להתפשט (איור 6E,F) עשויים לנבוע מחסרונות טכניים בבדיקת TGT או בסינתזת פני השטח. פתרונות לבעיות נפוצות אלה מוצגים בטבלה 1.
התכנון הפשוט של בדיקות TGT מספק לביולוגים של התא כלי רב עוצמה לחקר תוצאות איתות ספציפיות של גורמי גדילה-אינטגרין בבידוד ללא הפרעה מקולטנים אחרים על פני התא על ידי מתן ליגנדות וגירויים ספציפיים בלבד. בנוסף, בדיקות TGT מאפשרות לחקור את סף המתח המדגיש את קולטני האינטגרין הבודדים במהלך הידבקות התא ברגישות ל-pN. גישות חלופיות אינן מדווחות על כוחות המופעלים על ידי קולטנים בודדים בעלי רזולוציה מרחבית גבוהה בדגימות קבועות31. מיקרוסקופיית כוח המתיחה רגישה רק לכוחות nN, סדר גודל גבוה יותר מהכוחות המופעלים על ידי קולטני אינטגרין בודדים15, ובדיקות מתח מולקולריות מודדות כוחות pN, אך מכיוון שהן הפיכות, הן אינן עומדות בקיבוע בחוזקה. מסיבות אלה, בדיקות TGT הן כלי אטרקטיבי לחקר המכניקה של אינטראקציות גורם גדילה-אינטגרין.
ישנם מספר ניואנסים טכניים הקשורים בדיקות TGT שיש לקחת בחשבון לפני תכנון ניסוי. תמונת המתח היא תמונת מצב בזמן, המייצגת את היסטוריית הכוחות ואינה אינדיקציה למפגשי הקולטן-ליגנד בכל נקודת זמן נתונה. מאחר ויצירת האותות תלויה בהפרדת גשושיות, הפלואורסצנציה של TGT נובעת מבדיקות פתוחות שאינן נמצאות תחת מתח פעיל כתוצאה ממעורבות קולטן-ליגנד. משמעות הדבר היא שהקריאה למתח האינטגרין המתקבלת על פני השטח של TGT היא היסטורית ומצטברת באופיה ומייצגת היכן היו כוחות גדולים יותר מ-Ttol; המיקומים של כוחות הקולטן-ליגנד הנוכחיים הקטנים מ-Ttol אינם מדווחים על19,32. מאחר שקרע TGT גורם לסיום המעורבות של הקולטן-ליגנד, התפשטות התאים נובעת מאינטראקציות אינטגרין-ליגנד שחוות כוחות נמוכים יותר מ-Ttol. לפיכך, על המשתמש להיזהר בעת הגדרת הזמן שלאחר הציפוי כדי להעריך את התוצאות המכניות הקשורות להידבקויות מבוססות אינטגרין. לבסוף, יש לקחת בחשבון את המשמעות של Ttol. לגשושיות ה-TGT המועסקות כאן ישT tol של 56 pN, כאשר Ttol הוא הכוח הקבוע הדרוש כדי לקרוע 50% מהגשושיות כאשר הן מיושמות במשך 2 שניות. כאשר בוחנים מערכות ביולוגיות מסובכות, TGTs ככל הנראה חווים הדרגתיות כוח הטרוגנית ומגוונת עם תלות משתנה בזמן. אם TGTs ייקרעו על ידי כוחות גדולים יותר מ-Ttol, הפלואורסצנציה תהיה הערכת חסר של המתח הכולל. לחלופין, כוחות מתחתל-T tol המופעלים לפרקי זמן ארוכים יותר יכולים לקרוע מספר דומה של בדיקות ככוחות סף גבוהים המופעלים לתקופות קצרות יותר. שני תרחישים אלה עשויים לגרום לאותה קריאת עוצמת פלואורסצנציה, מה שמקשה על פתרון עוצמת המתח או הדינמיקה המדויקת באמצעות בדיקות TGT33,34.
באופן כללי, הערכות של מתח אינטגרין עם גירוי גורם גדילה צריכות להיעשות בזהירות על ידי תכנון ניסויים עם בקרות פנימיות, השוואת פרופילי התפשטות על משטחים אחרים המצופים מטריצה, ביצוע הערכות מקבילות של פלואורסצנציה TGT בתאים בנוכחות או בהיעדר גירוי גורם גדילה, ושימוש ב- TGTs עם Ttol שונה . TGTs מאפשרים כימות של תפקיד האיתות של גורם גדילה בוויסות המכניקה של קולטני אינטגרין, דינמיקת הידבקות מוקדית והתפשטות תאים. פרוטוקול זה יכול לשמש כתבנית לניסויים רבים מבוססי TGT באמצעות בדיקות עם Ttol שונים, ליגנדות שונות, סוגי תאים שונים או תנאי גירוי שונים. ניתן לסמן כל חלבונים בעלי עניין לאחר קיבוע, וניתן ליישם כל סוג של ניתוח תמונה כמותי. ככזה, אנו מציגים תבנית לניסויים רבים של TGT.
השימוש בבדיקות TGT אינו מוגבל לחקר האינטגרינים, אלא ניתן להרחיב אותו למגוון רחב של קולטני קרום תאים על פני סוגי תאים שונים על ידי שינוי הליגנד. בדיקות TGT שימשו לחקר תפקידם של כוחות בוויסות מפלים שונים של איתות קולטנים, כולל זיהוי התפקיד המכני של מכניקת קולטני Notch בהתפתחות עוברית ונוירוגנזה35, הכוחות המתווכים זיהוי והפנמה של אנטיגנים על ידי קולטני תאי B36, ויכולת קריאת ההוכחה המכנית של קולטני פני השטח של תאי T כדי לזהות שינויים בכוחות להגברת העוצמה והספציפיות של העברת האות37 . יחד, ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל העצום של בדיקות TGT במגוון מסגרות ניסוי.

לתאים יש את היכולת הפנימית לחוש, ליצור ולהגיב לכוחות מכניים, מה שמוביל לשינויים בפנוטיפ התאי ולשיפוץ של המיקרו-סביבה המקומית 1,2. לכוחות יש תפקיד מכריע בוויסות היבטים רבים של התנהגות התאים, כולל הידבקות, נדידה, התפשטות, התמיינות וריפוי פצעים 3,4. סטיות בחילופין מכני דו-כיווני בין תא למיקרו-סביבה עלולות להוביל למצבים חולים, כולל סרטן5. קולטני ממברנה רבים מעורבים בשמירה על הומאוסטזיס של מטריצת תאים; מתוכם, לאינטגרינים ולקולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR) יש סינרגיה חזקה 6,7. באופן קלאסי, אינטגרין מבסס את הקשר המכני בין המיקרו-סביבה לבין השלד התוך-תאי בעוד ש-EGFR מווסת את גדילת התאים, התפשטותםוהישרדותם 8,9. EGFR היא מטרה טיפולית שנחקרה מאוד, המתמקדת בוויסות חיצוני-פנימי המאפשר איתות תוך-תאי. EGFR-integrin crosstalk הוקם גנטית וביוכימית כדי לווסת את ההתקדמות של מחלות מרובות, כולל סרטן10,11. בעוד שמחקרים מצביעים על קיומם של יחסי גומלין בין EGFR-integrin, התוצאות מיוחסות למסלולי איתות הרחק מממברנת הפלזמה 7,12,13,14. ההשפעה של EGFR, או גורמי גדילה אחרים, על מכניקת התאים נותרה במידה רבה בלתי נחקרת, בין השאר בשל היעדר כלים למדידת כוחות תאיים ותוצאות איתות. האתגר טמון בזיהוי כלים מתאימים לחקר התקשורת בין פרדיגמות האיתות המקביליות הללו ולכימות תרומתן הספציפית למכניקת התא.
מספר גישות פותחו למדידת כוחות הנוצרים על ידי קולטני הידבקות תאים, והקורא מופנה לסקירות מעמיקות של טכניקות אלה15,16. בקצרה, מיקרוסקופיית כוח המתיחה וזיהוי מערך מיקרו-עמודים מסתמכים על דפורמציה של מצע בסיסי כדי להסיק כוחות ננו-ניוטון (nN), סדר גודל גדול יותר מכוחות קולטן בודדים17,18. טכניקות של מולקולה בודדת, כולל AFM ופינצטה אופטית, רגישות לכוחות פיקונוואטון (pN) של חלבון יחיד, אך מודדות רק קולטן אחד בכל פעם ואינן מציעות רזולוציה מרחבית טובה (או בכלל). בדיקות מתח מולקולרי מבוססות דנ"א וגשושיות קשירה של מד מתח (TGT) מציעות רזולוציית כוח pN עם רזולוציה מרחבית מוגבלת עקיפה (או טובה יותר), מה שמעניק להן תפקיד ייחודי בחקר כוחות חד-תאיים19,20 מסוגי תאים מגוונים, כולל פיברובלסטים, תאים סרטניים, טסיות דם ותאי מערכת החיסון 21,22,23,24 . בעוד שלגשושיות המתח המולקולרי יש אלמנט "קפיץ" הניתן להרחבה, אידיאלי להדמיה בזמן אמת, בדיקות TGT נקרעות באופן בלתי הפיך, ומותירות אחריהן "היסטוריית כוח" פלואורסצנטית. TGTs מווסתים בנוסף את סף המתח של המצע הבסיסי; ניתן להשתמש בסדרה של בדיקות בעלות הרכבים כימיים דומים אך כוחות קרע שונים, או סובלנות למתח (Ttol), כדי לכמת את המתח המינימלי הנדרש להיווצרות הידבקות מוקדית והתפשטות תאים. בדיקות TGT מורכבות משני גדילי דנ"א משלימים, האחד מעוגן לפני השטח והשני מציג ליגנד לתא. אם קולטן קושר את הליגנד ומפעיל כוח גדול יותר מטולה-T של הגשושית, הגדילים יופרדו. Ttol מוגדר ככוח הקבוע הדרוש כדי לקרוע 50% מהגשושיות במרווח של 2 שניות בתנאים אידיאליים. בבדיקות TGT "מופעלות", ניתן להפריד קוונצ'ר על הגדיל העליון מפלואורופור על הגדיל התחתון. רק כאשר גשושית ה-TGT נקרעה, ככל הנראה על ידי כוחות גדולים או שווים ל-Ttol, ייווצר אות פלואורסצנטי. ניתן גם לתקן בדיקות TGT, מה שמאפשר מניפולציה קלה של מערכות ביולוגיות ובדיקות של מצבים מרובים. מסיבות אלה, בדיקות TGT שימשו בעבודה זו.
בדיקות TGT שימשו כדי לחקור כיצד הידבקות תאים תלויי אינטגרין וכוחות מכניים מווסתים על ידי EGFR21 מופעל. עבודה זו ביססה את EGFR כ'מארגן מכאנו', כוונון ארגון הידבקות מוקדית ויצירת מתח. בנוסף, נמצא כי גירוי EGF השפיע על התפלגותם ובשלותם של הידבקויות מוקדיות והגביר את התפשטות התאים. גישה זו יכולה לשמש במחקרים עתידיים כדי לחקור כיצד גורמי גדילה משפיעים על כוחות מכניים בהתקדמות הגידול ובדינמיקה שלו. בעוד שהתפקיד של הצלבת EGFR-integrin בוויסות המעבר האפיתליאלי למזנכימלי נקבע, תפקידם של כוחות מכניים בתהליך זה נותר תחת חקירה10.
כאן, מוצג פרוטוקול מפורט לניסויים אלה המכסה סינתזה והרכבה של 56 בדיקות PN TGT, יצירת משטחי TGT על כיסויי זכוכית, יישום של תאי Cos-7 על משטח TGT וגירוי עם EGF, קיבוע והכתמה של תאים עם פאלואידין, ונוגדן אנטי-פקסילין, פלואורסצנציית השתקפות פנימית כוללת ברזולוציה גבוהה (TIRF) והדמיית מיקרוסקופיה של הפרעות השתקפות (RICM), וכימות תמונות. פרוטוקול זה, למרות שנכתב כדי לחקור גירוי EGF של תאי Cos-7, ניתן להתאמה בקלות עבור ניסויים רבים מבוססי TGT. ניתן להחליף בקלות ליגנדות שונות, Ttol, סוגי תאים, פרמטרים של גירוי, חלבונים המסומנים לאחר קיבוע וניתוח כמותי, מה שהופך את הפרוטוקול הזה לחזק ושימושי באופן נרחב.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>440140</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>Maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38S</td>
			<td>Diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8878S</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A687</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Paxillin antibody [Y113]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Gel P-2</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cos-7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>Cell Culture, Passage numbers 11-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid</td>
			<td>Vivitide</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PHR1553</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10013C</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor human EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-438-026</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurobrite DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21244</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-210-064</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-161</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16050130</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88902</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Gas Cylinder</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips - 25 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Laboratory Film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Surface Preparation/Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-070-063</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Low Form Griffin Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540G</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-310</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21335</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300-500</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEAA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0322726</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>471283</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28901</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1296293</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>85111</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, DNA Grade, DNASE, Protease free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>653950-702</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-813</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>pe Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM Cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA v-nIR Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 75D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13710</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td>Quantitative Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph Pad Prism</td>
			<td>Graph Pad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo name</td>
			<td>5&#39;modification/ 3&#39; modification</td>
			<td>Sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyne-21-BHQ2</td>
			<td>5&#39; Hexynyl/ 3&#39; BHQ_2</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCG</td>
			<td>Top strand TGT probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>56 pN TGT</td>
			<td>5&#39; Biosg/TTTTTT/iUniAmM</td>
			<td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td>
			<td>Bottom strand TGT probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 pN TGT</td>
			<td>5&#39; AmMC6/ 3&#39; BioTEG</td>
			<td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td>
			<td>Bottom strand TGT probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tension gauge tether probes for quantifying growth factor mediated integrin mechanics and adhesion

אורגניזמים רב-תאיים מסתמכים על אינטראקציות בין קולטני ממברנה לבין ליגנדות קוגנטיות במטריצה החוץ-תאית הסובבת (ECM) כדי לתאם פונקציות מרובות, כולל הידבקות, התפשטות, נדידה והתמיינות. כוחות מכניים יכולים להיות מועברים מהתא דרך קולטן ההדבקה integrin לליגנדות ב- ECM. הכמות והארגון המרחבי של כוחות אלה הנוצרים על ידי תאים יכולים להיות מווסתים על ידי קולטני גורם גדילה, כולל קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR). הכלים הקיימים כיום לכימות שינויים בתיווך crosstalk במכניקת התאים ולקשר אותם להידבקויות מוקדיות, מורפולוגיה תאית ואיתות מוגבלים. חיישני כוח מולקולרי מבוססי דנ"א המכונים קשירת מד מתח (TGTs) שימשו לכימות השינויים הללו. גשושיות TGT הן ייחודיות ביכולתן גם לווסת את סף הכוח הבסיסי וגם לדווח על כוחות קולטן בקנה מידה של פיקונוואטון על פני כל פני התא הדביק ברזולוציה מרחבית מוגבלת עקיפה. בדיקות ה-TGT המשמשות כאן מסתמכות על דיסוציאציה בלתי הפיכה של דופלקס דנ"א על ידי כוחות קולטן-ליגנד המייצרים אות פלואורסצנטי. זה מאפשר כימות של מתח האינטגרין המצטבר (היסטוריית הכוח) של התא. מאמר זה מתאר פרוטוקול המשתמש ב- TGTs כדי לחקור את ההשפעה של EGFR על מכניקת האינטגרין ויצירת הידבקות. ההרכבה של פלטפורמת החישה המכנית TGT מפורטת באופן שיטתי ומתווה את הנוהל לכוחות תמונה, הידבקויות מוקד והתפשטות תאים. באופן כללי, היכולת לווסת את סף הכוח הבסיסי של הגשושית, את ליגנד ההדבקה ואת הסוג והריכוז של גורם הגדילה המשמש לגירוי הופכים את זה לפלטפורמה חזקה לחקר יחסי הגומלין בין קולטני ממברנה מגוונים בוויסות כוחות בתיווך אינטגרין.

בדיקות TGT מופעלות שימשו כדי לחקור את ההשפעה של קולטן גורם גדילה אפידרמלי המופעל על ידי ליגנד (EGFR) על מכניקת תאים בתיווך אינטגרין ויצירת הידבקות בתאי Cos-721. הגשושיות מציגות את הליגנד מחזורי Arg-Gly-Asp-Phe-Lys (cRGDfK)21,23,25,26, שהוא סלקטיבי עבור ההטרודימר האנטגרין αVβ3 עם זיקה קטנה בלבד ל-α5β1 אינטגרין 27,28,29,30. בדיקת ה-TGT מורכבת מדנ"א דו-צדדי המתפקד על משטח כיסוי זכוכית דרך הגדיל התחתון באמצעות קשירת ביוטין-סטרפטווידין. הגדיל העליון מציג את ליגנד האינטגרין וזמין להיקשר לקולטן האינטגרין הקוגנטי בקרום התא (איור 5A). הגדיל התחתון מסומן בפלואורופור ובחוט העליון עם קוונצ'ר, מה שמוביל לפלואורסצנציה מינימלית ברקע כאשר ה-TGT הדו-צדדי שלם. אם אינטגרין קושר את הליגנד ומפעיל כוח בעל גודל גדול יותר מטול ה-T של הגשושית, דופלקס הדנ"א ייפרד ויוביל לפלואורסצנציה (איור 5A). כל גשושית TGT שלא נקרעה על ידי כוח מכני תישאר לא פלואורסצנטית. פלואורסצנציה סלקטיבית זו מאפשרת מיפוי שיטתי וכמותי של כוחות שנוצרו על ידי אינטגרין בקנה מידה pN ברזולוציה מוגבלת עקיפה. בדיקות TGT גם מווסתות את סף המתח של המצע.
מוצגת כאן דוגמה מייצגת של משטח TGT עםטול T של 56 pN. תאי Cos-7 צופו על משטח TGT זה עם או בלי גירוי EGF כדי לחקור את ההשפעה של הפעלת EGFR באמצעות גירוי ליגנד על הידבקות תאים ומכניקה של אינטגרין (איור 5A,B). התאים דוגרו עם או בלי EGF על משטחי ה-TGT במשך 60 דקות, קבועים ומוכתמים באופן חיסוני כדי להציג את התפלגות ההדבקה המוקדית (פקסילין) ואת הארגון של השלד הציטוסקלטון (F-actin) (איור 5B). לאחר מכן צולמו התאים באמצעות מיקרוסקופיית RICM ו-TIRF. כפי שניתן לראות בבירור בתמונת RICM, התפשטות תאי Cos-7 על פני השטח של 56 pN TGT שופרה באופן משמעותי עם גירוי EGF בהשוואה ללא גירוי. זה כומת עבור 50 תאים בכל מצב על ידי מדידת גודל אזור המגע בין התא למצע מתמונת RICM (איור 5C). גירוי עם EGF הביא למורפולוגיה מעגלית יותר, המייצגת את תאי Cos-7 מתפשטים וגדלים בסביבתם הפיזיולוגית הטבעית (איור 5D). הפלואורסצנציה מגשושיות פתוחות גבוהה יותר גם עם גירוי EGF כפי שנצפה בתמונת הפלואורסצנציה של המתח. העוצמה המשולבת של הגשושיות הפתוחות, שהיא פרופורציונלית למספר הגשושיות הפתוחות, הייתה גבוהה בהרבה עם גירוי EGF בהשוואה ללא (איור 5B,E). זהו ייצוג של כל ההתקשרויות של קולטן-ליגנד שבהן האינטגרינים הפעילו כוח גדול יותר מ-Ttol (56 pN).
צביעה בפקסילין הראתה כי ההתפלגות, המספר, ההבשלה (גודל) והארגון של הידבקויות מוקדיות הושפעו גם הם מגירוי EGF. הידבקויות מוקדיות בתאים מגורה EGF נראו בוגרות יותר ומכוונות רדיאליות בהשוואה ללא פקדי EGF. ארגון השלד של F-אקטין שופר גם הוא עם גירוי EGF, כפי שהוערך על ידי צביעת הפאלואידין (איור 5B). הערכות איכותניות אלה נעשו על ידי השוואה חזותית של תמונות משתי קבוצות הטיפול. ניתוח כמותי של הידבקות מוקדית יכול להיעשות אך הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה. בניסוי זה, משטח ה-TGT סיפק פלטפורמה לפרט באופן שיטתי את ההשפעה של הפעלת EGFR על התפשטות תאים, מכניקת אינטגרין ויצירת הידבקות מוקדית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig01.jpg"> איור 1: סכמטי ליום 1 של הכנת פני השטח של TGT. (A) נקה את הכיסויים. (ב) לחרוט את משטח הכיסוי. (ג) לנטרל את פתרון הפיראנה. (D) סילאניזציה של פני השטח כדי ליצור קבוצות אמינים תגובתיות. (E) לאזן את הכיסויים לפאזה האורגנית. (F) לייבש את הכיסויים בגז אינרטי. (G) ביוטינילט את קבוצות האמין שעל פני השטח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig02.jpg"> איור 2: סכמטי ליום 2 של הכנת משטח ה-TGT. (A) נקו ויבשו את הכיסויים כדי להסיר כל שאריות ביוטין מהיום הקודם. (ב) לעבור עם BSA כדי למנוע קשירה לא ספציפית של מגיב בשלבים הבאים. (C) לתפקד את הכיסויים עם סטרפטווידין. (D) הכלאה של הגשושיות ברכיבה תרמית. (E) להחיל את הגשושיות המסונתזות על הכיסויים (F) להרכיב את הכיסוי בתא ההדמיה של התא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig03.jpg"> איור 3: זרימת עבודה כללית המדגישה את השלבים הרחבים לאורך כל מערך הניסוי. (B) תרשים זרימה של השלבים המעורבים בקיבוע ובכתם חיסוני לאחר ההצמדה וההתפשטות על משטח ה-TGT. (C) לאחר ההכתמה, התאים מצטלמים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מיקרוסקופ RICM ו-TIRF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig04.jpg"> איור 4: דוגמה לעיבוד נתונים וניתוח כמותי. (A) פירוט שלב אחר שלב של צינור הניתוח המשמש בפיג'י (ImageJ) לכימות תמונת RICM ומתח. (B) דוגמה מייצגת לתוצאות מורפומריות של תאים שנותחו באמצעות הצינור הנ"ל. (C) דוגמאות מייצגות לתוצאות מכניות של תאים שנותחו באמצעות הצינור הנ"ל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig05.jpg"> איור 5: נתונים לדוגמה מניסוי TGT. (A) דיאגרמה המדגישה את אזור המגע בממשק פני השטח של קרום התא-TGT. Inset מקרינה אינטגרין באינטראקציה עם הליגנד הקוגנטי שלה cRGDfK עם (מימין) או בלי גירוי EGF (שמאלי). (B) תמונות RICM ו-TIRF של תאי Cos-7 מתפשטות על פני השטח של 56 pN TGT. התמונות מתקבלות 60 דקות לאחר הציפוי עם או בלי גירוי EGF. תמונות RICM בודדות (כפי שנרכשו), מתח אינטגרין (גווני אפור), פקסילין (כתום חם) ו-F-אקטין (כחול-ירוק) מוצגות עם שכבות-על לשני תנאי הגירוי. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. הכניסה מדגישה ROI מוגדל (אזור עניין) המפרט את הקולוקליזציה של מתח האינטגרין שנוצר באתרים של היווצרות הידבקות המסומנים על ידי פקסילין, ואת הארגון הציטוסקטלי התת-תאי הבסיסי המסומן על ידי אקטין. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. (ג-ה) חלקות פיזור עבור אזור ההתפשטות (טביעת הרגל של תאי RICM) (C), מעגליות (D) ומתח משולב (E) עבור תאי Cos-7 עם או בלי גירוי EGF. פסים מציינים ממוצע ± s.d. ההבדלים בין הקבוצות הוערכו סטטיסטית עם מבחן ה-t של הסטודנט; עמ' < 0.0001. n = 50 תאים בשלושה ניסויים עצמאיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig06.jpg"> איור 6: משטחי TGT לדוגמה עם בעיות אפשריות שונות. (A) תמונות מתח ו-RICM של משטח TGT אידיאלי עם גשושית מורכבת ומרווה לפני הידבקות התא. (B) מתח ותמונות RICM של משטח TGT שבו הגשושית TGT חסרה את הגדיל העליון (quencher). תמונת מתח מראה פלואורסצנציה אחידה מפלואורופור פתוח בגדיל התחתון. (C) תמונות מתח ו-RICM לתאים המתפשטות על משטח TGT אידיאלי. (D) מתח ותמונות RICM לתאים מתפשטות על משטח TGT עשוי בצורה גרועה עם פסיבציה מוגבלת או גשושית מושפלת. (E) תמונות מתח, RICM ושדה בהיר עבור תאים המצופים על משטח אידיאלי עם ליגנד cRGDfK המציין כי אינטראקציות cRGDfK-integrin חיוניות לחיבור תאים וליצירת מתח. (F) תמונות מתח, RICM ו-brightfield עבור תאים המצופים על משטח ללא ליגנד cRGDfK ב-TGT. בעוד שהתאים נראים בתמונת השדה הבהיר, לא נצפה חיבור תאי או מתח אינטגרין שנוצר. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion at JoVE.com

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

משטח TGT הוא פלטפורמה חדשנית לחקר גורם גדילה-אינטגרין crosstalk. תכנון הבדיקה הגמיש, הספציפיות של ליגנד ההדבקה והמודולציה המדויקת של תנאי הגירוי מאפשרים הערכות כמותיות חזקות של יחסי הגומלין בין EGFR-integrin. התוצאות מדגישות את EGFR כ'מכנו-מארגן' המכוון את מכניקת האינטגרין, ומשפיע על מכלול הידבקות המוקד ועל התפשטות התאים.

מד מתח קשירה בדיקות לכימות גורם גדילה מתווך מכניקת אינטגרין והדבקה

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

פרוטוקול זה משמעותי בשל הפשטות של פלטפורמת חיישני TGT המשמשת לחקר הצלבת EGFR-integrin והשפעתה על הכוחות המכניים של התא. ראו התווה לחקור את הוויסות התלוי ב-EGF של מכניקת התאים. הפרוטוקול ניתן להתאמה עבור ליגנדות שונות, סוגי תאים, פרדיגמות גירוי, וניתן להצמיד אותו ל-TGTs בעלי סף מתח משתנה.סינתזת פני השטח עשויה להיראות מאיימת בהתחלה. המפתח הוא להיות מוכן ומאורגן כדי לבצע במדויק את השלבים המורכבים על ידי שימוש ברשימת תיוג להכנת ריאגנט וחישובים. ביום הראשון, מניחים עד שמונה כיסויי זכוכית בקוטר 25 מ"מ מחליקים לתוך מתלה פוליטטראפלואורואתילן.הניחו את המדף בכוס בורוסיליקט 50 מיליליטר המכילה 40 מיליליטר של אתנול עמיד בפני 200 איש. Sonicate בתדר הפעלה של 35 קילוהרץ במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. מלאו של 50 מיליליטר ב-40 מיליליטר של תמיסת פיראנה שהוכנה זה עתה על ידי ערבוב חומצה גופרתית ומי חמצן ביחס של 3:1 בכוס Pyrex וערבוב עם פיפטה מזכוכית.מעבירים את מתלה החלקת הכיסוי לתוך הכוס ומדגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במכסה האדים כדי לחרוט את משטח החלקת הכיסוי. לאחר התחריט, העבירו את מתלה החלקת הכיסוי לכוס עם מים אולטרה-אפורים עם פינצטה. בדקו באופן חזותי את תלושי הכיסוי כדי לוודא שהמשטחים נראים נקיים ללא דפוסים או חלקיקי אבק על פני השטח של הזכוכית.מעבירים את מתלה החלקת הכיסוי לכוס עם אתנול עמיד בפני 200 ושוטפים פעמיים למשך 15 שניות כדי ליישר את המשטחים לממס אורגני. העבר את מתלה החלקות הכיסוי לתמיסת אתנול חסינת 200 עם 3% APTES למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסלף את תלושי הכיסוי. טבלו את המדף בכוס נקייה עם תמיסת אתנול חסינת 200.ייבשו את החלקות הכיסוי באמצעות גז חנקן בלחץ יציאה נמוך. מניחים את הכיסוי מחליק לתוך צלחת פוליסטירן באורך 10 ס"מ עם פיסת סרט פאראפין מונחת שטוחה בתוכה. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של שני מיליגרם למיליליטר תמיסת NHS-ביוטין ב-DMSO לארבעה תלושי כיסוי המונחים על סרט פרפין.הניחו כריך עם ארבעת החלקות הכיסוי האחרות למעלה, כאשר שתי החלקות כיסוי פונות זו לזו עם תמיסת הפונקציונליזציה באמצע. ביום השני, מוציאים את המנה מארבע מעלות צלזיוס ומפרידים את תלושי הכיסוי הסנדוכים. יש להימנע מגירוד או פגיעה במשטח המתפקד בעת הפרדת הכריך.לאחר מכן, כיוונו את החלקות הכיסוי במדף כאשר המשטח המצופה פונה זה לזה. יבש עם גז חנקן. מניחים את הכיסוי בצלחת חדשה עם סרט פאראפין בתוכו.הוסיפו 800 מיקרוליטרים של אלבומין סרום בקר 0.1% ב-1X PBS לכל עטיפה. דגירה של החלקות הכיסוי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להעביר את פני השטח ולחסום קשירה לא ספציפית של ריאגנטים פונקציונליים הבאים. כדי לתפקד את תלושי הכיסוי, הוסיפו 800 מיקרוליטרים של מיקרוגרם אחד למיליליטר של סטרפטווידין ב-1X PBS בטמפרטורת החדר למשך 45 עד 60 דקות.הרכיבו את בדיקות ה-TGT בצינור PCR באמצעות תרמוציקלר. לאחר הדגירה, לשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם 1X PBS. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של בדיקות ה-TGT שהורכבו מראש לארבעה תלושי כיסוי והכינו סנדוויצ'ים באמצעות ארבעת החלקות הכיסוי הנותרות כאשר הצד הפונקציונלי פונה לגשושיות.מכסים בנייר אלומיניום. לאחר הדגירה, הפרידו את הכריכים ושטפו את תלושי הכיסוי עם 1X PBS שלוש פעמים. הרכיבו בזהירות את החלקות הכיסוי לתוך תאי הדמיה מנוקים מראש.כדי לחקור את ההשפעה של גירוי גורם הגדילה האפידרמלי על מכניקת Cos-7, הידבקות והתפשטות תאים, נסה את השימוש בתאי Cos-7 עם 0.05% טריפסין-EDTA למשך שתי דקות. נטרלו את הטריפסין על ידי שטיפה עם HBSS וצנטריפוגה ב-800 גרם למשך חמש דקות. תאי צלחת בצפיפות של 40, 000 תאים על משטחי ה-TGT המורכבים ב-DMEM בתוספת 50 ננוגרם למיליליטר EGF או DMEM ללא EGF.לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1X PBS. יש לתקן עם שני מיליליטרים של 4% פרפורמלדהיד במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את החלקות הכיסוי חמש פעמים עם PBS 1X במרווחים של חמש דקות בטמפרטורת החדר.לחלופין, דגירו את תלושי הכיסוי עם אמוניום כלוריד 50 מילימולרי ב-1X PBS למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים חיץ A ומניחים את תאי ההדמיה עם החלקות כיסוי במיכל לחות. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לחסום ולחלחל את התאים.דיללו את הנוגדן העיקרי נגד פקסילין ב-1:250 דילולים במאגר החסימה. דגירה עם 200 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים ראשונית לתלוש כיסוי למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. סמן את התאים בו-זמנית עם תערובת של נוגדן משני עז/אנטי-ארנב מצומד בשעה 1:800 דילול ופאלואידין מצומד בשעה 1:400 דילולים ב-200 מיקרוליטרים של חיץ חוסם לכל החלקת כיסוי.שטפו את המשטחים חמש פעמים עם 1X PBS במרווחים של חמש דקות. כדי להתחיל, להוסיף שמן למטרה, לנקות את החלקה כיסוי התחתון של תא הדגימה, ולהניח את הדגימה על הבמה. התמקדו בתא והתמקדו באופן מושלם.יישרו את ה-RICM על ידי סגירה ומרכוז של הסרעפת עם מפתח הצמצם epi-illumination. מקד את הלייזר 488 ננומטר לנקודה קטנה בתקרת החדר והגדיל את זווית ההיארעות עד מעבר לזווית הקריטית, תוך ניטור פלואורסצנטיות במצלמה במצב חי. שימו לב לירידה חדה בפלואורסצנציה ברקע ובמישור מיקוד יחיד כאשר הזווית הקריטית עולה עליה.זהה תאים להדמיה באמצעות המצב החי של המצלמה באמצעות RICM. רכשו את תמונות ה-RICM וה-TIRF של אקטין בעירור של 488 ננומטר, מתח אינטגרין בעירור של 561 ננומטר, ופקסילין בעירור של 647 ננומטר. השג תמונות ברצף באמצעות זמן חשיפה של 200 אלפיות השנייה.החליפו את תלושי הכיסוי, התמקדו וחזרו על הפעולה. תאי Cos-7 צופו על משטח TGT זה עם או בלי גירוי EGF כדי לחקור את ההשפעה של הפעלת EGFR עם גירוי ליגנד על מכניקת האינטגרין. אם אינטגרין קושר את הליגנד ומפעיל כוח גדול יותר מסך סף המתח של הבדיקה, דופלקס הדנ"א ייפרד, מה שיוביל לפלואורסצנציה.כל גשושית TGT שכוח מכני לא נקרע תישאר לא פלואורסצנטית. התאים דוגרו עם או בלי EGF על משטחי ה-TGT במשך 60 דקות, תוקנו וטופלו באופן חיסוני כדי להציג את התפלגות ההדבקה המוקדית ואת ארגון השלד של הציטוסקלטון. בתמונת ה-RICM, התפשטות תאי Cos-7 על פני השטח של 56-piconewton TGT שופרה באופן משמעותי עם גירוי EGF בהשוואה ללא גירוי.גירוי עם EGF הביא למורפולוגיה מעגלית יותר, המייצגת את התפשטות תאי Cos-7 וגדלים. הפלואורסצנציה מבדיקות פתוחות גבוהה יותר גם עם גירוי EGF, כפי שנצפה בתמונת הפלואורסצנציה של המתח. העוצמה המשולבת של בדיקות פתוחות פרופורציונלית למספר הגשושיות הפתוחות הייתה גבוהה בהרבה עם גירוי EGF מאשר ללא גירוי.זכרו תמיד את הכיוון של החלקות הכיסוי, תוך שמירה על המשטח המתפקד פונה כלפי מעלה. כאשר מפרידים את הכריך, היו עדינים כך שהמשטח לא נשרט או ניזוק. לאחר סינתזת פני השטח, ניתן לחקור חלבונים ציטופלסמיים המווסתים את הידבקות התא או את ההתמרה המכניקה.זה מאפשר זיהוי של מולקולות איתות במורד הזרם המעורבות בתיאום מכניקת התאים בקרום הפלזמה.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

פקטור מצופה צמיחה השמה ביד על Explants forebrain הגבי

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

הכנת פקטור T צמיחת תאים מן Splenocytes עכברוש

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

מערכת מגנטית לקשור לחקור חזותית חוש הריח בקרת טיסה מתווך תסיסנית

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה<em&gt; Zea Mays</em&gt; מותיר

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Signaling

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...