Name: tension gauge tether probes for quantifying growth factor mediated integrin mechanics and adhesion
Uploaded: 2022-02-11T14:30:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne medlemmene av Mattheyses-laboratoriet for fruktbare diskusjoner og kritikker. Vi erkjenner finansiering til A.L.M. fra NSF CAREER 1832100 og NIH R01GM131099.

1. TGT oligonukleotidpreparat
MERK: Detaljene for syntesen av oligonukleotidsonden er skissert her. Vær oppmerksom på at noen modifikasjoner og rensetrinn kan outsources for tilpasset syntese.
<ol><li>Aktiver den primære aminen til cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)] peptid med azide-NHS linker som beskrevet av Zhang et al22 ved å blande inn et 1:1.5-forhold (100:150 nmoles) i et sluttvolum på 10 μL dimyleformamid. Tilsett 0,1 μL organisk basetrietylamin og inkuber i 12 timer ved 4 ° C.</li>
	<li>Rens produktet ved omvendt fase HPLC ved hjelp av 0,1 M TEAA (løsningsmiddel A) og 100% acetonitril (løsningsmiddel B) med en strømningshastighet på 1 ml / min og den opprinnelige tilstanden på 10% løsningsmiddel B satt til en gradient på 0,5% / min. Kombiner de eluterte toppene (absorbans ved 203 nm) og verifiser av MALDI-TOF massespektrometri. Produktet er cRGDfK-azide.</li>
	<li>For å generere TGT toppstrengen, kombiner cRGDfK-azide og alkyne-21-BHQ2 oligonukleotid (TGT toppstreng: 5Hexynyl /GTGAAATACCGCAGATGCG/3BHQ_2) i et 2:1-forhold (͂ 200 μM: 100 μM) i 100 μL 1x fosfat bufret saltvann (PBS) med 5 mM natriumaskorbat og 0,1 μM forhåndsformet Cu-THPTA. La reaksjonen fortsette i minst 4 timer ved romtemperatur (RT) eller over natten ved 4 °C.</li>
	<li>Behandle blandingen gjennom P2-avsaltingsgelen for å fjerne overflødig fargestoff, biprodukter, organisk løsningsmiddel og ikke-vedtatte reagenser. Forbered sentrifugekolonnen med 650 μL prehydrert P2 gel ved å spinne den ned på 18 000 x g i 1 min. Kast gjennomstrømningsvæsken og tilsett reaksjonsblandingen. Spinn igjen ved 18 000 x g i 1 min og samle gjennomstrømningen. Ta reaksjonsblandingen til et sluttvolum på 300 μL med ultrarent vann. MERK: Forhydrer P2 gelen med vann i 6 timer.</li>
	<li>Rens den avsaltede reaksjonsblandingen ved å reversere HPLC. De organiske løsningsmidlene som brukes til denne rensingen inkluderer 0,1 M TEAA i H2O (løsningsmiddel A) og 100% MeCN (løsningsmiddel B eller mobilfasen).<ol>
<li>Før du injiserer blandingen, likevekt kolonnen med en innledende tilstand på 10% løsningsmiddel B med en gradient på 1%/min. Juster strømningshastigheten til 1 ml/min. Injiser reaksjonsblandingen i HPLC-løkken med en 500 μL injeksjonsnål.</li>
		<li>Samle produktet ved å visualisere topp absorpsjon på 260 nm for DNA og 560 nm for BHQ2 quencher. Tørk det eluterte produktet over natten i en vakuum sentrifugalkonsentrator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruk nukleofil substitusjon for å koble TGT bunnstreng til Cy3B-NHS ester som beskrevet i Ma et. al25. Bland 100 μM av den 56 pN TGT bunnstrengen (5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT) med 50 μg Cy3B-NHS ester forhåndsoppløset i 10 μL DMSO. Juster pH i denne blandingen til 9 med 0,1 M natriumbikarbonat og ta det endelige volumet til 100 μL med 1x PBS. Inkuber reaksjonsblandingen over natten på RT.</li>
	<li>Rens blandingen sekvensielt ved hjelp av P2 gelfiltrering og omvendt fase HPLC for å skille ikke-utførte reagenser, salter og organiske løsningsmidler (beskrevet i trinn 1.4 og 1.5).</li>
	<li>Beregn konsentrasjonen av de rensede oligonukleotidfargekonjugatene ved å registrere absorbansen ved 260 nm ved hjelp av et spektrofotometer.</li>
	<li>Karakteriser de rensede produktene av MALDI-TOF massespektrometri. Løs opp overflødig 3-hydroksypicolinsyre i TA50-løsningsmiddel (50:50 v/v acetonitril og 0,1 % TFA i ddH2O) for å tilberede den ferske MALDI-matrisen. Estimerte og målte molekylvekter for de merkede produktene er: cRGDfK-1-BHQ2 - 8157,9 (beregnet), 8160,1 (funnet); Cy3B merket 56 pN TGT - 10272,7 (beregnet), 10295,8 (funnet).</li>
	<li>Løs opp toppen og bunnstrengene separat i nukleasefritt vann i en konsentrasjon mellom 30-50 μM. Bruk DNasefrie pipettespisser for å unngå lagerforurensning. Oppbevars ved 4 °C for korttidsbruk eller -20 °C for langvarige bruksområder. Stabiliteten til oligonukleotider påvirkes ikke av gjentatte fryse-tine sykluser.</li>
</ol>2. Overflateforberedelse
Dag 1:
<ol><li>Plasser 25 mm glassdeksler (opptil 8) i et polytetrafluoreetylenstativ. Plasser stativet i et 50 ml borosilikatbeger som inneholder 40 ml 200 etanol. Dekk begeret med parafinfilm for å unngå at vann kommer inn og sonikerer med en driftsfrekvens på 35 kHz i 10-15 min ved RT (figur 1A).</li>
	<li>Fyll et 50 ml beger med 40 ml Piranha-oppløsning som er nylaget ved å blande svovelsyre og hydrogenperoksid i et 3:1-forhold i et pyrexbeger. Rør med en glasspipette. Overfør dekslene til begeret og inkuber i 30 minutter ved RT i avtrekkshetten for å etse dekslene (figur 1B). MERK: Bruk fullt verneutstyr, inkludert labfrakk, hansker og vernebriller, og arbeid i den kjemiske avtrekkshetten. Tilsett hydrogenperoksid til syren sakte for å forhindre overoppheting av løsningen.</li>
	<li>Etter etsning, bruk pinsett for å overføre dekslene til et beger med ultrarent vann. Gjenta dette trinnet seks ganger med intervaller på 15 s for å nøytralisere syren fullstendig (figur 1C). MERK: La Piranha-oppløsningen ligge i den kjemiske avtrekkshetten over natten før du kaster den i syreavfallsbeholderen.</li>
	<li>Kontroller dekslene visuelt for å sikre at overflatene ser rene ut uten mønstre eller støvpartikler på glassoverflaten. Gjenta trinn 2.1-2.4 hvis det oppdages mønstre eller støv. MERK: Test overflatens hydrofilisitet ved å dyppe behandlede deksler i vann og fjerne dem vertikalt. Vann på behandlede deksler trekker seg tilbake som et ensartet ark for å danne Youngs ringer sammenlignet med ubehandlede deksler som danner flekker.</li>
	<li>Overfør dekslene til et beger med 200 etanol og vask to ganger i 15 s for å likevekte overflater til organisk løsningsmiddel. Overfør dekslene til en 200-bevis etanolløsning med 3 % APTES i 1 time ved RT for å simulere dekslene (figur 1D). Dekk begeret med parafinfilm. MERK: APTES-avsetningsparametere varierer avhengig av overflaterengjøringsmetode, vanninnhold i oppløsningsvæske, APTES-konsentrasjon, inkubasjonstider og temperatur for annealing.</li>
	<li>Senk stativet ned i et rent beger med 200 etanoloppløsning. Gjenta denne vasken tre ganger i 15 s hver (figur 1E).</li>
	<li>Tørk dekslene med nitrogen (N2) gass med lavt utgangstrykk. Legg dekslene i en 10 cm polystyrenfat med et stykke parafinfilm lagt flatt inne i den. Pass på at dekslene er tørre og separert (figur 1F).</li>
	<li>Tilsett 100 μL 2 mg/ml NHS-biotinoppløsning i DMSO til fire deksler plassert på parafinfilm. Sett en "sandwich" med de fire andre dekslene på toppen (to deksler vendt mot hverandre med funksjonaliseringsløsningen i mellom) og inkuber parabolen over natten ved 4 °C (figur 1G). MERK: Ved 4 °C er NHS-reagenset mer stabilt, noe som letter ensartet overflatefunksjonalisering. I tillegg sparer smørbrødet reagenser. Unngå å tilsette overflødig oppløsning i smørbrødet, da det kan lekke ut og føre til at dekslene glir.</li>
</ol>Dag 2:
<ol start="9"><li>Fjern fatet fra 4 °C og skill de sandwichede dekslene. Plasser skliene i stativet med den belagte overflaten vendt mot hverandre som vist i figur 2A. Vask dem med 200 bevis etanoloppløsning tre ganger for 15 s hver. Tørk med N2 gass og legg dem i en ny tallerken med en parafinfilm inne i den. MERK: Orientering av dekslene som indikert bidrar til å identifisere den funksjonaliserte overflaten.</li>
	<li>Vask dekslene med 1 ml 1x PBS tre ganger for å likevekte dem tilbake til den vandige fasen. Tilsett 800 μL 0,1 % bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS (m/v) i hver av coverlips og inkuber på RT i 30 minutter for å passivisere overflaten og blokkere ikke-spesifikk binding av påfølgende funksjonaliseringsreagenser (figur 2B).</li>
	<li>Etter inkubasjon, vask dekslene tre ganger med 1 ml 1x PBS. Tilsett 800 μL 1 μg/ml streptavidin i 1x PBS ved RT i 45-60 minutter for å funksjonalisere dekslene (figur 2C). MERK: Behold ett deksle uten streptavidin for å bekrefte passivasjonseffektivitet (valgfritt). Tilsett 10 nM biotinylerte molekyler og bilde ved hjelp av eksperimentelle forhold. Denne overflateintensiteten bør være nær kameraets mørke støy.</li>
	<li>Samtidig med trinn 2.11 monterer du TGT-sondene (topp: bunnstreng ved 1:1 molarforhold) ved en endelig konsentrasjon på 50 nM i 100 μL 1 M NaCl i et PCR-rør ved hjelp av en termosykler. Fjern trådene ved 95 °C i 5 minutter, og gradvis gløde ved å redusere temperaturen til 25 °C og opprettholde den i 25 minutter (figur 2D). Unngå utvidet eksponering av TGT-sonder for lys.</li>
	<li>Etter streptavidin inkubasjon, bruk 1x PBS for å vaske dekslene tre ganger. Tilsett 100 μL av de ferdigmonterte TGT-sondene i fire av dekslene og lag smørbrød ved hjelp av de resterende 4 dekslene med den funksjonaliserte siden vendt mot sondene (åtte overflater krever fire rør hybridiserte TGT-sonder). Dekk med aluminiumsfolie og inkuber i 1 time ved RT for å tillate sondebinding til overflaten (figur 2E).</li>
	<li>Etter inkubasjon, skille smørbrødene og vask dekslene med 1x PBS tre ganger. TGT-overflatene er nå klare for avbildning. Monter dekslene forsiktig i forløpte bildekamre og tilsett 1x PBS for å holde overflatene hydrert (figur 2F). MERK: Overtightening kamrene vil sprekke overflaten. Unngå tørking av overflatene.</li>
</ol>3. Celleforberedelse og farging
<ol><li>For å undersøke effekten av epidermal vekstfaktor (EGF) stimulering på Cos-7 mekanikk, vedheft og cellespredning, prøv Cos-7 celler med 0,05% Trypsin-EDTA i 2 min. Nøytraliser trypsin ved å vaske med HBSS og sentrifugere ved 800 x g i 5 minutter. Gjenta nøytraliseringstrinnet en gang til.</li>
	<li>Plateceller med en tetthet på 4 x 104 celler på de monterte TGT-overflatene i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 50 ng/ml EGF eller DMEM uten EGF. La cellene spre seg i 60 min ved 37 °C med 5 % CO2 i en cellekulturinkubator (figur 3A). MERK: Celler inkuberes i DMEM uten serum for å unngå stimulering fra vekstfaktorer. EGF fortynnes i 10 mM eddiksyre for å lage et lager på 1 mg / ml. Den brukes ved 50 ng / ml i DMEM for avbildningsforsøk.</li>
	<li>Etter inkubasjon, vask cellene tre ganger med 1x PBS og fest med 2 ml 4% paraformaldehyd i 12 min ved RT (figur 3B). MERK: Alle inkubasjonstrinn utføres på en roterende shaker ved ~ 35 rpm for jevn spredning av løsningene. Beskytt TGT-overflatene mot lys ved å dekke dem til de er klare for avbildning.</li>
	<li>Aspirer fikseringen og vask dekslene fem ganger med 1x PBS med 5 minutters intervaller ved RT. Inkuber eventuelt dekslene med 50 mM NH4Cl i 1x PBS i 30 min ved 37 °C for å slukke paraformaldehyd-assosiert autofluorescens og vask tre ganger med 1x PBS ved 5 minutters intervaller (figur 3B).</li>
	<li>Tilsett buffer A (1x PBS, 5% normalt hesteserum, 5% normalt geiteserum, 1% BSA, 0,025% Triton X-100) og inkuber i 30 min ved 37 °C for å blokkere og permeabilisere cellene. Vask tre ganger med 1x PBS med 5 minutters intervaller (figur 3B).</li>
	<li>Plasser bildekamrene med deksler i en fuktighetsbeholder. Fortynn det primære anti-paxillin-antistoffet (fokal vedheftmarkør) ved 1:250 i blokkeringsbuffer (1x PBS, 5% normalt hesteserum, 5% normalt geiteserum, 1% BSA, 0,005% Triton x-100). Inkuber med 200 μL primær antistoffoppløsning per deksler i 2 timer ved 37 °C (figur 3B). MERK: Ikke la overflatene tørke ut.</li>
	<li>Vask dekslene fem ganger med 1x PBS med 5 minutters intervaller og returner dem til fuktighetsbeholderen. Etikettceller samtidig med en blanding av fargestoff konjugert geit anti-kanin sekundært antistoff ved 1:800 fortynning og fargestoff konjugert falloidin (aktin) ved 1:400 fortynning i 200 μL blokkering buffer per dekslerlip. Inkuber ved 37 °C i 60 min (figur 3B).</li>
	<li>Vask overflatene fem ganger med 1x PBS med 5 minutters intervaller og oppbevar dem ved 4 °C til de er klare til avbildning (figur 3B). MERK: Bildeprøver innen 3 dager etter overflateforberedelse for å unngå signalforringelse.</li>
</ol>4. Bildeoppkjøp
<ol><li>Bruk et 60x-objektiv med en høy numerisk blenderåpning (1,49) på et invertert mikroskop med 488, 561 og 647 TIRF-eksitasjon, RICM-eksitasjon, et perfekt fokussystem og et digitalt kamera.<ol>
<li>Tilsett olje til målet, rengjør dekslene på bunnen av prøvekammeret, og legg prøven på scenen. Fokuser på en celle og engasjere det perfekte fokuset.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sett mikroskopet i RICM-bildemodus med epifluorescenseksitasjon og en GFP-filterkube med utslippsfilteret fjernet. Juster RICM ved å lukke og midtstille epi-belysningsåpningens membran.</li>
	<li>Sett mikroskopet i TIRF-modus med lasereksitasjon og en quad-pass TIRF-filterkube. Fokuser 488 nm laseren til et lite sted i taket på rommet og øk insensvinkelen til forbi den kritiske vinkelen mens du overvåker fluorescens på kameraet i live-modus. Vær oppmerksom på en kraftig reduksjon i bakgrunnsfluorescens og et enkelt fokusplan når den kritiske vinkelen overskrides. MERK: TIRF begeistrer et tynt område (~100 nm) nærmest prøvedekslerlipgrensesnittet som fremhever åpne TGT-sonder og fokale vedheft, samtidig som fluorescensen som ikke er i fokus, elimineres fra innsiden av cellen. Hvis TIRF ikke er tilgjengelig, kan epifluorescens brukes; Signal-til-støy-forhold vil imidlertid være lavere.</li>
	<li>Identifiser celler for avbildning ved hjelp av "live" -modusen til kameraet ved hjelp av RICM.</li>
	<li>Skaff deg RICM-bildet og TIRF-bildene av aktin (640 nm ex), integrinspenning (561 nm ex) og paxillin (488 nm ex). Hent bilder sekvensielt ved hjelp av en eksponeringstid på 200 ms. MERK: Eksponeringstiden avhenger av mange faktorer, inkludert objektiv, lasereffekt, utslippsfiltre og kamerafølsomhet. Signalet må være minst 2 ganger større enn bakgrunnen. Bakgrunnen er rundt 1000 AU, så signalet skal være minst 2000-3000 AU.</li>
	<li>Gjenta 4,4-4,5 for minst 30 celler. Endre omslag, fokus og gjenta 4,4-4,5.</li>
</ol>5. Dataanalyse
MERK: Utfør kvantitativ bildeanalyse ved hjelp av Fiji-programvaren og analysen ved hjelp av statistikkprogramvare.
<ol><li>Åpne bildesettet for én celle.</li>
	<li>Opprett en maske av celleområdet (RICM-maske) ved å spore grensen til cellen i RICM-bildet ved hjelp av markeringsverktøyet ImageJ Freehand. Lagre interesseområdet (ROI) i ROI-lederen (Analyser > Verktøy > ROI-behandling) (figur 4A1,2).</li>
	<li>Velg et representativt område utenfor cellen i det innebygde spenningsbildet, og tegn en avkastning på minst 200 x 200 piksler. Utelat andre celler eller fluorescerende rusk fra avkastningen. Mål bakgrunnsfluorescensen i avkastningen ved hjelp av måleverktøyet (Analyser > mål) (figur 4A3).</li>
	<li>Trekk den gjennomsnittlige bakgrunnsfluorescensen oppnådd i trinn 5.2 fra spenningsbildet (Prosess > Matematikk > Trekk fra) (figur 4A4).</li>
	<li>Bruk RICM-masken som ble opprettet i trinn 5.2 for å definere spenningssignalet innenfor cellefotavtrykket (ROI manager > Velg > Bruk maske > Rediger > Fjern utenfor) (figur 4A5).</li>
	<li>Opprett en terskelmaske for spenningsbildet ved hjelp av Huangs metode for automatisk terskelverdi (Bilde > Juster > terskelverdi) (figur 4A6). Kontroller at terskelmasken best representerer området for den genererte integrinske spenningen. Som en tommelfingerregel setter du terskelen til 2x gjennomsnittlig bakgrunnsfluorescens.</li>
	<li>Opprett et utvalg av den terskelsterte spenningsmasken (Rediger > markering > Opprett) (figur 4A7).</li>
	<li>Overfør den valgte masken til spenningsbildet som genereres i trinn 5.4, og mål den integrerte intensiteten til åpne sonder (ROI manager > Select (Tension Mask) > Analyze > Measure > RawIntDen) (figur 4C).</li>
	<li>Mål området for cellemorfometriske egenskaper, sirkularitet og størrelsesforhold fra RICM-masken (ROI manager > Select (RICM-maske) > Bruk maske > Analyser > mål) (figur 4B).</li>
	<li>Mål den mekaniske bruddtettheten, definert som prosentandelen av cellefotavtrykket med revne sonder ved å velge spenningsmaskebildet og bruke RICM-masken (ROI manager > Select (RICM Mask) > Analyser > Mål > %Area) (figur 4C).</li>
	<li>Eksporter målingene for videre analyse og visualisering til statistikkprogramvare.</li>
	<li>Gjenta 5,1-5,11 for hver celle.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lim, C. -. G., Jang, J., Kim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+machinery+for+sensing+mechanical+force.">Cellular machinery for sensing mechanical force.</a> BMB Reports. 51 (12), 623-629 (2018).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Micro)managing+the+mechanical+microenvironment.">(Micro)managing the mechanical microenvironment.</a> Integrative Biology. 3 (10), 959-971 (2011).</li><li>Vogel, V., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+matter+in+health+and+disease.+From+Cancer+to+Tissue+Engineering.">Mechanical forces matter in health and disease. From Cancer to Tissue Engineering.</a> Nanotechnology. , 233-303 (2010).</li><li>Wang, J. H. C., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+rules+cell+biology.">Mechanics rules cell biology.</a> BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 2 (1), 16 (2010).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).</li><li>Streuli, C. H., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+co-operation+between+integrins+and+other+receptor+systems.">Signal co-operation between integrins and other receptor systems.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 491-506 (2009).</li><li>Chiasson-MacKenzie, C., McClatchey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-induced+cytoskeletal+changes+drive+complex+cell+behaviors:+The+tip+of+the+iceberg.">EGFR-induced cytoskeletal changes drive complex cell behaviors: The tip of the iceberg.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li><li>Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+as+biomechanical+sensors+of+the+microenvironment.">Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 457-473 (2019).</li><li>De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+EGFR+signaling+in+tumor+microenvironment.">The role of the EGFR signaling in tumor microenvironment.</a> Journal of Cellular Physiology. 214 (3), 559-567 (2008).</li><li>Javadi, S., Zhiani, M., Mousavi, M. A., Fathi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+Epidermal+Growth+Factor+Receptors+(EGFR)+and+integrins+in+resistance+to+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors+(TKIs)+in+solid+tumors.">Crosstalk between Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR) and integrins in resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in solid tumors.</a> European Journal of Cell Biology. 99 (4), 151083 (2020).</li><li>Eliceiri, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+and+growth+factor+receptor+crosstalk.">Integrin and growth factor receptor crosstalk.</a> Circulation Research. 89 (12), 1104-1110 (2001).</li><li>Dan, L., Jian, D., Na, L., Xiaozhong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+EGFR+and+integrin+affects+invasion+and+proliferation+of+gastric+cancer+cell+line,+SGC7901.">Crosstalk between EGFR and integrin affects invasion and proliferation of gastric cancer cell line, SGC7901.</a> OncoTargets and Therapy. 5, 271-277 (2012).</li><li>Giancotti, F. G., Tarone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+control+of+cell+fate+through+joint+integrin/receptor+protein+kinase+signaling.">Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling.</a> Annual Reviews: Cell and Developmental Biology. 19, 173-206 (2003).</li><li>Ricono, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cross-talk+between+epidermal+growth+factor+receptor+and+integrin+alphavbeta5+promotes+carcinoma+cell+invasion+and+metastasis.">Specific cross-talk between epidermal growth factor receptor and integrin alphavbeta5 promotes carcinoma cell invasion and metastasis.</a> Cancer Research. 69 (4), 1383-1391 (2009).</li><li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell-generated+forces:+a+guide+to+the+available+tools.">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li><li>Hang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosensors+for+single+cell+mechanical+interrogation.">Nanosensors for single cell mechanical interrogation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 179, 113086 (2021).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+traction+forces+by+micropillar+arrays:+contribution+of+substrate+warping+to+pillar+deflection.">Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection.</a> Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li><li>Ma, V. P. -. Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Nanotechnology+as+an+Emerging+Tool+to+Study+Mechanotransduction+in+Living+Systems.">DNA Nanotechnology as an Emerging Tool to Study Mechanotransduction in Living Systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Kim, Y., Kim, K. A., Kim, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+force+sensors+to+study+the+molecular+level+forces+required+to+activate+signaling+pathways.">Double-stranded DNA force sensors to study the molecular level forces required to activate signaling pathways.</a> Journal of the Korean Physical Society. 78 (5), 386-392 (2021).</li><li>Rao, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+activation+attenuates+the+mechanical+threshold+for+integrin+tension+and+focal+adhesion+formation.">EGFR activation attenuates the mechanical threshold for integrin tension and focal adhesion formation.</a> Journal of Cell Sciences. 133 (13), (2020).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Ma, V. P. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+induced+catalytic+amplification+reaction+for+readout+of+receptor-mediated+cellular+forces.">Mechanically induced catalytic amplification reaction for readout of receptor-mediated cellular forces.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5488-5492 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+single+molecular+forces+required+to+activate+integrin+and+notch+signaling.">Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling.</a> Science. 340 (6135), 991-994 (2013).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60-61, 70-85 (2017).</li><li>Kantlehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+coating+with+cyclic+RGD+peptides+stimulates+osteoblast+adhesion+and+proliferation+as+well+as+bone+formation.">Surface coating with cyclic RGD peptides stimulates osteoblast adhesion and proliferation as well as bone formation.</a> ChemBioChem. 1 (2), 107-114 (2000).</li><li>Kapp, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+evaluation+of+the+activity+and+selectivity+profile+of+ligands+for+RGD-binding+integrins.">A comprehensive evaluation of the activity and selectivity profile of ligands for RGD-binding integrins.</a> Scientific Reports. 7, 39805 (2017).</li><li>Kok, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+functional+evaluation+of+RGD-modified+proteins+as+alpha(v)beta(3)+integrin+directed+therapeutics.">Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as alpha(v)beta(3) integrin directed therapeutics.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 128-135 (2002).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2019).</li><li>Luca, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-Jagged+complex+structure+implicates+a+catch+bond+in+tuning+ligand+sensitivity.">Notch-Jagged complex structure implicates a catch bond in tuning ligand sensitivity.</a> Science. 355 (6331), 1320-1324 (2017).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Brockman, J. M., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+proofreading:+a+general+mechanism+to+enhance+the+fidelity+of+information+transfer+between+cells.">Mechanical proofreading: a general mechanism to enhance the fidelity of information transfer between cells.</a> Frontiers in Physics. 7, 14 (2019).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Med den detaljerte trinnvise prosedyren som er skissert ovenfor, kan man forberede TGT-overflater for å kvantifisere cellemorfologi og integrinspenning generert av tilhengerceller under cellevedlegg og spredning etter behandling med EGF. Den enkle sondedesignen og syntesen og overflateforberedelsene sammen med det enkle eksperimentelle oppsettet ga en stabil plattform for å studere samspillet mellom EGFR og integrins. Samlet sett validerer resultatene at ligandavhengig aktivering av EGFR forbedrer cellespredning, justerer de kraftbærende egenskapene til integrinske reseptorer og fremmer fokal vedheftsorganisasjon og modning. Resultatene som oppnås ved hjelp av TGT-sonder støtter den overordnede hypotesen om at vekstfaktorer, som EGFR, fungerer som "mekano-arrangører", øker mengden og romlig organisering av integrinspenning og regulerer orienteringen og mekanikken til fokale vedheft.
Ved påføring på TGT-overflaten lander, fester og sprer cellene seg som de integrinske (αVβ3) reseptorene sanser og binder seg til cRGDfK-liganden. Ved å gjøre det kan TGT-sondene brytes mekanisk, noe som genererer fluorescens på stedet for ligandengasjement. Avlesningen er den kumulative "krafthistorikken" til cellen som samhandler med overflaten. Det er noen vanlige problemer med TGT-overflatene som kan være til stede under disse eksperimentene. Fluorescens med høy overflatebakgrunn (figur 6A,B), lappete overflateutseende, svikt i cellene for å generere spenningssignal (figur 6C, D) og svikt i celler som skal spres (figur 6E,F) kan skyldes tekniske mangler ved TGT-sonden eller overflatesyntesen. Løsninger på disse vanlige problemene er presentert i tabell 1.
Den enkle utformingen av TGT-sonder gir cellebiologer et kraftig verktøy for å studere spesifikke vekstfaktorintegrinske signalresultater isolert uten forstyrrelser fra andre celleoverflatereseptorer ved å bare gi spesifikke ligander og stimuleringer. I tillegg tillater TGT-sonder undersøkelse av spenningsterskelen som understreker individuelle integrinreseptorer under celleadhesjon ved pN-følsomhet. Alternative tilnærminger klarer ikke å rapportere krefter som utøves av individuelle reseptorer med høy romlig oppløsning i faste prøver31. Trekkraftmikroskopi er bare følsom for nN-krefter, en størrelsesorden høyere enn kreftene som brukes av individuelle integrinreseptorer15, og molekylære spenningssonder måler pN-krefter, men fordi de er reversible, tåler de ikke robust fiksering. Av disse grunnene er TGT-sonder et attraktivt verktøy for å studere mekanikken til vekstfaktorintegrininteraksjoner.
Det er flere tekniske nyanser knyttet til TGT-sonder som bør vurderes før du designer et eksperiment. Spenningsbildet er et øyeblikksbilde i tid, som representerer krafthistorikken og ikke en indikator på reseptor-ligand-engasjementene til enhver tid. Siden signalgenerering er avhengig av sondeseparasjon, er TGT-fluorescens et resultat av åpne sonder som ikke er under aktiv spenning fra reseptorligament. Dette betyr at avlesningen for integrinsk spenning oppnådd på TGT-overflaten er historisk og kumulativ i naturen som representerer hvor det var krefter større ennT-tol; plasseringen av nåværende reseptor-ligand krefter mindre enn Ttol er ikke rapportert19,32. Fordi TGT-brudd resulterer i avslutning av reseptor-ligand-engasjementet, skyldes cellespredning integrin-ligand interaksjoner som opplever krefter lavere ennT-tol. Brukeren må derfor være forsiktig når han eller hun definerer tiden etter plating for å estimere de mekaniske resultatene forbundet med integrinbaserte vedheft. Til slutt må betydningen avT-tol vurderes. TGT-sondene som brukes her har enT-tol på 56 pN, hvorT-tol er den konstante kraften som trengs for å briste 50% av sondene når de påføres i 2 s. Når du vurderer kompliserte biologiske systemer, opplever TGTs sannsynligvis en heterogen og mangfoldig kraftgradering med varierende tidsavhengigheter. Hvis TGTs er sprukket av krefter større ennT-tol, vil fluorescensen være en underestimering av den totale spenningen. Alternativt kan krefter underT-tol som brukes i lengre varigheter, sprekke et lignende antall sonder som høye terskelkrefter som brukes i kortere tider. Begge disse scenariene kan resultere i samme fluorescensintensitetsavlesning, noe som gjør det vanskelig å løse den nøyaktige spenningsstyrken eller dynamikken ved hjelp av TGT-sonder33,34.
Samlet sett bør vurderinger av integrin spenning med vekstfaktorstimulering gjøres nøye ved å designe eksperimenter med interne kontroller, sammenligne spredningsprofiler på andre matrisebelagte overflater, gjøre parallelle vurderinger av TGT-fluorescens i celler i nærvær eller fravær av vekstfaktorstimulering, og bruke TGTs med forskjellige Ttol . TGTs tillater kvantifisering av rollen som vekstfaktorsignalering i regulering av mekanikken til integrinreseptorer, fokal vedheftsdynamikk og cellespredning. Denne protokollen kan brukes som en mal for mange TGT-baserte eksperimenter ved hjelp av sonder med forskjelligT-tol, forskjellige ligander, forskjellige celletyper eller forskjellige stimuleringsforhold. Eventuelle proteiner av interesse kan merkes etter fiksering, og enhver type kvantitativ bildeanalyse kan implementeres. Som sådan presenterer vi en mal for mange TGT-eksperimenter.
Bruken av TGT-sonder er ikke begrenset til å studere integriner, men kan utvides til et mangfoldig utvalg av cellemembranreseptorer på tvers av forskjellige celletyper ved å endre liganden. TGT-sonder har blitt brukt til å undersøke kreftenes rolle i å regulere ulike reseptorsignalerende kaskader, inkludert å identifisere den mekaniske rollen til Notch-reseptormekanikk i embryonisk utvikling og nevrogenese35, kreftene som formidler identifisering og internalisering av antigener av B-cellereseptorer36, og den mekaniske bevislesingsevnen til T-celleoverflatereseptorer for å oppdage endringer i krefter for å øke styrken og spesifisiteten til signaloverføring37 . Sammen fremhever disse funnene det enorme potensialet til TGT-sonder i en rekke eksperimentelle innstillinger.

Celler har den iboende evnen til å føle, generere og reagere på mekaniske krefter, noe som fører til endringer i cellulær fenotype og ombygging av det lokale mikromiljøet 1,2. Krefter spiller en avgjørende rolle i å regulere mange aspekter av celleadferd, inkludert vedheft, migrasjon, spredning, differensiering og sårheling 3,4. Avvik i den toveis mekaniske utvekslingen mellom en celle og mikromiljøet kan føre til syke tilstander, inkludert kreft5. Tallrike membranreseptorer er involvert i å opprettholde cellematrise homeostase; av disse har integriner og epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) robust synergi 6,7. Klassisk etablerer integriner den mekaniske forbindelsen mellom mikromiljøet og intracellulært cytoskjelett, mens EGFR regulerer cellevekst, spredning og overlevelse 8,9. EGFR er et høyt studert terapeutisk mål, fokusert på utenfor-in regulering som letter intracellulær signalering. EGFR-integrinsk krysstale er etablert genetisk og biokjemisk for å regulere utviklingen av flere sykdommer, inkludert kreft10,11. Mens studier indikerer eksistensen av EGFR-integrinsk samspill, tilskrives resultatene signalveier bort fra plasmamembranen 7,12,13,14. Virkningen av EGFR, eller andre vekstfaktorer, på cellemekanikk forblir i stor grad uutforsket delvis på grunn av mangel på verktøy for å måle cellulære krefter og signalresultater. Utfordringen ligger i å identifisere passende verktøy for å studere kommunikasjonen mellom disse parallelle signalparadigmene og å kvantifisere deres spesifikke bidrag til cellemekanikk.
Flere tilnærminger er utviklet for å måle krefter generert av celleadhesjonsreseptorer, og leseren er rettet mot grundige vurderinger av disse teknikkene15,16. Kort sagt, trekkraft mikroskopi og mikro-søyle array deteksjon er avhengig av deformasjon av et underliggende substrat for å utlede nanonewton (nN) krefter, en størrelsesorden mer enn individuelle reseptorkrefter 17,18. Enkeltmolekylteknikker, inkludert AFM og optisk pinsett, er følsomme for enkeltprotein piconewton (pN) krefter, men måler bare en reseptor om gangen og tilbyr ikke god (eller noen) romlig oppløsning. DNA-baserte molekylære spenningssonder og spenningsmåler-tether (TGT)-sonder tilbyr pN-kraftoppløsning med diffraksjonsbegrenset (eller bedre) romlig oppløsning, noe som gir dem en unik rolle i å studere encellede krefter19,20 fra forskjellige celletyper, inkludert fibroblaster, kreftceller, blodplater og immunceller 21,22,23,24 . Mens molekylære spenningssonder har et uttrekkbart "fjær" -element, ideelt for sanntidsavbildning, bryter TGT irreversibelt, og etterlater seg en fluorescerende "krafthistorie". TGTer modulerer i tillegg spenningsterskelen til det underliggende substratet; en rekke sonder med lignende kjemiske sammensetninger, men forskjellige bruddkrefter, eller spenningstoleranser (T-tol), kan brukes til å kvantifisere minimumsspenningen som kreves for brennviddedannelse og cellespredning. TGT-sonder består av to komplementære DNA-tråder, den ene forankret til overflaten og den andre presenterer en ligand til cellen. Hvis en reseptor binder liganden og utøver en kraft som er større enn sondensT-tol, vil trådene bli skilt. Ttol er definert som den konstante kraften som trengs for å sprekke 50% av sondene i et intervall på 2 s under ideelle forhold. I "turn-on" TGT-sonder kan en quencher på toppstrengen skilles fra en fluorofor på bunnstrengen. Bare der TGT-sonden har blitt revet, antagelig av krefter større enn eller likT-tol, vil det genereres et fluorescerende signal. TGT-sonder kan også festes, noe som muliggjør enkel manipulering av biologiske systemer og testing av flere forhold. Av disse grunnene ble TGT-sonder brukt i dette arbeidet.
TGT-sonder ble brukt til å studere hvordan integrinavhengig celleadhesjon og mekaniske krefter moduleres ved aktivert EGFR21. Dette arbeidet etablerte EGFR som en 'mechano-arrangør', tuning focal adhesion organisasjon og spenningsgenerering. I tillegg ble det funnet at EGF-stimulering påvirket fordelingen og modenheten til fokale vedheft og forbedret cellespredning. Denne tilnærmingen kan brukes i fremtidige studier for å undersøke hvordan vekstfaktorer påvirker mekaniske krefter i tumorprogresjon og dynamikk. Mens rollen som EGFR-integrinsk krysstale i reguleringen av epitelet til mesenchymal overgang er etablert, forblir rollen som mekaniske krefter i denne prosessen underutredet10.
Her presenteres en detaljert protokoll for disse eksperimentene som dekker syntesen og monteringen av 56 pN TGT-sonder, generering av TGT-overflater på glassdeksler, påføring av Cos-7-celler på TGT-overflaten og stimulering med EGF, fiksering og farging av celler med falloidin, og et anti-paxillin-antistoff, total intern refleksjonsfluorescens med høy oppløsning (TIRF) og refleksjonsforstyrrelser kontrastmikroskopi (RICM) avbildning, og bilde kvantifisering. Denne protokollen, selv om den er skrevet for å undersøke EGF-stimulering av Cos-7-celler, er lett tilpasningsdyktig for mange TGT-baserte eksperimenter. Ulike ligander,T-tol, celletyper, stimuleringsparametere, proteiner merket etter fiksering, og kvantitativ analyse kan enkelt erstattes i, noe som gjør denne protokollen robust og mye nyttig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>440140</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>Maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38S</td>
			<td>Diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8878S</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A687</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Paxillin antibody [Y113]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Gel P-2</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cos-7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>Cell Culture, Passage numbers 11-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid</td>
			<td>Vivitide</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PHR1553</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10013C</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor human EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-438-026</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurobrite DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21244</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-210-064</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-161</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16050130</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88902</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Gas Cylinder</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips - 25 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Laboratory Film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Surface Preparation/Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-070-063</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Low Form Griffin Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540G</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-310</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21335</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300-500</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEAA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0322726</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>471283</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28901</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1296293</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>85111</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, DNA Grade, DNASE, Protease free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>653950-702</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-813</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>pe Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM Cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA v-nIR Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 75D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13710</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td>Quantitative Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph Pad Prism</td>
			<td>Graph Pad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo name</td>
			<td>5&#39;modification/ 3&#39; modification</td>
			<td>Sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyne-21-BHQ2</td>
			<td>5&#39; Hexynyl/ 3&#39; BHQ_2</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCG</td>
			<td>Top strand TGT probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>56 pN TGT</td>
			<td>5&#39; Biosg/TTTTTT/iUniAmM</td>
			<td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td>
			<td>Bottom strand TGT probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 pN TGT</td>
			<td>5&#39; AmMC6/ 3&#39; BioTEG</td>
			<td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td>
			<td>Bottom strand TGT probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tension gauge tether probes for quantifying growth factor mediated integrin mechanics and adhesion

Multicellulære organismer er avhengige av interaksjoner mellom membranreseptorer og konjakkligner i den omkringliggende ekstracellulære matrisen (ECM) for å orkestrere flere funksjoner, inkludert vedheft, spredning, migrasjon og differensiering. Mekaniske krefter kan overføres fra cellen via vedheftsreseptoren integrin til ligander i ECM. Mengden og romlig organisering av disse cellegenererte kreftene kan moduleres av vekstfaktorreseptorer, inkludert epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR). Verktøyene som for tiden er tilgjengelige for å kvantifisere krysstalemediert endring i cellemekanikk og relatere dem til fokusadhesjoner, cellulær morfologi og signalering er begrenset. DNA-baserte molekylære kraftsensorer kjent som spenningsmålerte tthers (TGTs) har blitt brukt til å kvantifisere disse endringene. TGT-sonder er unike i deres evne til både å modulere den underliggende kraftterskelen og rapportere piconewton-skalareseptorkrefter over hele den tilhengercelleoverflaten ved diffraksjonsbegrenset romlig oppløsning. TGT-sondene som brukes her, er avhengige av den irreversible dissosiasjonen av et DNA-dupleks av reseptor-ligandkrefter som genererer et fluorescerende signal. Dette tillater kvantifisering av cellens kumulative integrinske spenning (krafthistorikk). Denne artikkelen beskriver en protokoll som benytter TGTs for å studere effekten av EGFR på integrinsk mekanikk og vedheftsdannelse. Monteringen av TGT mekanisk sensorplattform er systematisk detaljert og prosedyren for bildekrefter, brennvidde og cellespredning er skissert. Samlet sett gjør evnen til å modulere sondens underliggende kraftterskel, vedheftsligen og typen og konsentrasjonen av vekstfaktor som brukes til stimulering dette til en robust plattform for å studere samspillet mellom ulike membranreseptorer i regulering av integrinmediede krefter.

Turn-on TGT-sonder ble brukt til å undersøke effekten av ligandaktivert epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) på integrinmediert cellemekanikk og vedheftsdannelse i Cos-7 celler21. Sondene presenterer den ligand sykliske Arg-Gly-Asp-Phe-Lys (cRGDfK)21,23,25,26, som er selektiv for den integrinske heterodimer αVβ3 med bare en liten affinitet for α5β1 integrins 27,28,29,30. TGT-sonden består av et dupleks-DNA som er funksjonalisert på en glassdeksletoverflate via bunnstrengen ved hjelp av biotin-streptavidinbinding. Den øverste tråden viser den integrinske liganden og er tilgjengelig for å binde seg til konjakkintegrinreseptoren på cellemembranen (figur 5A). Den nederste tråden er merket med en fluorofor og toppstrengen med en quencher, noe som fører til minimal bakgrunnsfluorescens når dupleks TGT er intakt. Hvis en integrin binder liganden og bruker en kraft med en størrelsesorden større enn sondensT-tol, vil DNA-dupleksen skilles og føre til fluorescens (figur 5A). Enhver TGT-sonde som ikke har blitt revet av en mekanisk kraft, forblir ikke-fluorescerende. Denne kraftselektive lysstoffescensen muliggjør systematisk og kvantitativ kartlegging av pN-skalaintegringenererte krefter ved diffraksjonsbegrenset oppløsning. TGT-sonder modulerer i tillegg spenningsterskelen til substratet.
Vist her er et representativt eksempel på en TGT-overflate med enT-tol på 56 pN. Cos-7-celler ble belagt på denne TGT-overflaten med eller uten EGF-stimulering for å studere virkningen av EGFR-aktivering med ligandstimulering på celleadhesjon og integrinmekanikk (figur 5A,B). Cellene ble inkubert med eller uten EGF på TGT-overflatene i 60 minutter, fast og immunfarget for å vise brennviddefordelingen (paxillin) og organiseringen av cytoskjelettet (F-aktin) (figur 5B). Cellene ble deretter avbildet ved hjelp av RICM- og TIRF-mikroskopi. Som tydelig sett i RICM-bildet, ble Cos-7 cellespredning på 56 pN TGT-overflaten betydelig forbedret med EGF-stimulering sammenlignet med uten stimulering. Dette ble kvantifisert for 50 celler i hver tilstand ved å måle størrelsen på celle-substrat kontaktområdet fra RICM-bildet (figur 5C). Stimulering med EGF resulterte i en mer sirkulær morfologi, representativ for Cos-7 celler som spredte seg og vokste i sitt naturlige fysiologiske miljø (figur 5D). Fluorescensen fra åpne sonder er også høyere med EGF-stimulering som observert i spenningsfluorescensbildet. Den integrerte intensiteten av åpne sonder, som er proporsjonal med antall åpne sonder, var mye høyere med EGF-stimulering sammenlignet med uten (figur 5B,E). Dette er en representasjon av alle reseptor-ligand engasjementer der integrins anvendt en kraft større enn Ttol (56 pN).
Farging med paxillin viste at fordelingen, antallet, modningen (størrelsen) og organiseringen av fokaladhesjoner også ble påvirket av EGF-stimulering. Fokale vedheft i EGF-stimulerte celler virket mer modne og radialt orientert sammenlignet med ingen EGF-kontroller. F-aktincytoskeletal organisering ble også forbedret med EGF-stimulering, vurdert ved falloidinfarging (figur 5B). Disse kvalitative vurderingene ble gjort ved visuell sammenligning av bilder fra begge behandlingsgruppene. Kvantitativ analyse av fokal vedheft kan gjøres, men er utenfor omfanget av denne protokollen. I dette eksperimentet ga TGT-overflaten en plattform for systematisk å detaljere effekten av EGFR-aktivering på cellespredning, integrinmekanikk og fokal vedheftsdannelse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk for dag 1 av TGT overflateforberedelse. (A) Rengjør dekslene. (B) Ets dekslene. (C) Nøytraliser Piranha-løsningen. (D) Silanisere overflaten for å lage reaktive amingrupper. (E) Likevekt dekslene til den organiske fasen. (F) Tørk dekslene med en inert gass. (G) Biotinylere overflateamingruppene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig02.jpg"> Figur 2: Skjematisk for dag 2 av TGT overflatepreparatet. (A) Rengjør og tørk dekslene for å fjerne eventuell gjenværende biotin fra dagen før. (B) Passivisere med BSA for å forhindre ikke-spesifikk binding av reagens i senere trinn. (C) Funksjonaliser dekslene med streptavidin. (D) Hybridiser sondene i en termosyklus. (E) Påfør de syntetiserte sondene på dekslene (F) Monter dekslene i celleavbildningskammeret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig03.jpg"> Figur 3: Generell arbeidsflyt som fremhever de brede trinnene på tvers av hele det eksperimentelle oppsettet. (A) Prosess for celleavløsning og plating på TGT-overflaten i basale medier (DMEM) med eller uten EGF-stimulering. (B) Flytskjema over trinnene som er involvert i fiksering og immunfarging etter festing og spredning på TGT-overflaten. (C) Etter farging er celler avbildet på et invertert fluorescensmikroskop med RICM og TIRF mikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig04.jpg"> Figur 4: Eksempel på databehandling og kvantitativ analyse. (A) Trinnvis nedbryting av analyserørledningen som brukes i Fiji (ImageJ) for RICM og bilde kvantifisering av spenningsbilder. (B) Et representativt eksempel for cellemorfometriske resultater analysert ved hjelp av rørledningen ovenfor. (C) Representative eksempler på cellemekaniske resultater analysert ved hjelp av ovennevnte rørledning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig05.jpg"> Figur 5: Eksempeldata fra et TGT-eksperiment. (A) Diagram som fremhever kontaktsonen ved cellemembran-TGT-overflategrensesnittet. Inset prosjekter integrins samhandler med sin cognate ligand cRGDfK med (høyre) eller uten (venstre) EGF stimulering. (B) RICM- og TIRF-bilder av Cos-7-celler spredt på 56 pN TGT-overflaten. Bildene er oppnådd 60 min etter plating med eller uten EGF stimulering. Individuelle RICM-bilder (som anskaffet), integrinspenning (gråtone), paxillin(oransje hot) og F-aktin (blågrønn) vises med overlegg for begge stimuleringsforholdene. Skala Bar: 10 μm. Innfellingen fremhever en innzoomet avkastning (interesseområde) som beskriver colokaliseringen av den genererte integrinske spenningen på steder med vedheftsdannelse preget av paxillin, og den underliggende subcellulære cytoskeletale organisasjonen preget av aktin. Skala Bar: 5 μm. (C-E) Spred tomter for spredningsområdet (RICM cellefotavtrykk) (C), sirkularitet (D) og integrert spenning (E) for Cos-7 celler med eller uten EGF-stimulering. Stolper indikerer gjennomsnittlig ± s.d. Forskjeller mellom gruppene ble vurdert statistisk med Studentens t-test; P < 0.0001. n = 50 celler på tvers av tre uavhengige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig06.jpg"> Figur 6: Eksempel på TGT-overflater med ulike mulige problemer. (A) Spennings- og RICM-bilder av en ideell TGT-overflate med montert sonde slukket før celleadhesjon. (B) Spennings- og RICM-bilder av en TGT-overflate der TGT-sonden mangler toppstrengen (quencher). Spenningsbildet viser jevn fluorescens fra åpen fluorofor i bunnstrengen. (C) Spennings- og RICM-bilder for celler spredt på en ideell TGT-overflate. (D) Spennings- og RICM-bilder for celler spredt på en dårlig laget TGT-overflate med begrenset passivisering eller degradert sonde. (E) Spennings-, RICM- og brightfield-bilder for celler belagt på en ideell overflate med cRGDfK-ligand som indikerer at cRGDfK-integrin interaksjoner er avgjørende for cellevedlegg og spenningsgenerering. (F) Spennings-, RICM- og brightfield-bilder for celler belagt på en overflate uten cRGDfK-ligand på TGT. Mens cellene er synlige i brightfield-bildet, observeres ingen cellevedlegg eller generert integrin spenning. Skala Bar: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion at JoVE.com

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

TGT overflate er en innovativ plattform for å studere vekstfaktor-integrin crosstalk. Den fleksible sondedesignen, spesifisiteten til adhesjonsligaden og presis modulering av stimuleringsforhold tillater robuste kvantitative vurderinger av EGFR-integrinsk samspill. Resultatene fremhever EGFR som en 'mechano-arrangør' tuning integrin mekanikk, påvirker fokal vedheft montering og celle spredning.

Spenningsmåler tether sonder for kvantifisering vekstfaktor mediert integrin mekanikk og vedheft

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

Denne protokollen er betydelig på grunn av enkelheten i TGT-sensorplattformen som brukes til å studere EGFR-integrinsk krysstale og dens innflytelse på cellemekaniske krefter. Rao skissert for å undersøke EGF-avhengig regulering av cellemekanikk. Protokollen er tilpasningsdyktig for forskjellige ligander, celletyper, stimuleringsparadigmer, og kan kombineres med TGTer med varierende spenningsterskler.Overflatesyntese kan virke skremmende med det første. Nøkkelen er å være forberedt og organisert for å nøyaktig utføre de intrikate trinnene ved å bruke en sjekkliste for reagensforberedelse og beregninger. På dag én, plasser opptil åtte 25 millimeter glassdeksel glir inn i et polytetrafluoreetylenstativ.Plasser stativet i et 50 milliliter borosilikatbeger som inneholder 40 milliliter 200-bevis etanol. Soniker med en driftsfrekvens på 35 kilohertz i 10 til 15 minutter ved romtemperatur. Fyll et 50 milliliter beger med 40 milliliter piranha-oppløsning fersk tilberedt ved å blande svovelsyre og hydrogenperoksid i et 3:1-forhold i et Pyrex-beger og rør med en glasspipette.Overfør dekselsklistativet til begeret og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur i avtrekkshetten for å etse dekselets glideflate. Etter etsning, overfør dekselsklistativet til et beger med ultrarent vann med pinsett. Kontroller dekselslippene visuelt for å sikre at overflatene ser rene ut uten mønstre eller støvpartikler på glassoverflaten.Overfør dekselsklistativet til et beger med 200-bevis etanol og vask to ganger i 15 sekunder for å likevekte overflater til organisk løsningsmiddel. Overfør dekselsklistativet til en 200-bevis etanolløsning med 3 % APTES i en time ved romtemperatur for å simulere dekselslippene. Senk stativet ned i et rent beger med 200-bevis etanolløsning.Tørk dekselslippene med nitrogengass med lavt utgangstrykk. Plasser dekselet glir inn i en 10 centimeter polystyrenfat med et stykke parrafinfilm lagt flatt inne i den. Tilsett 100 mikroliter to milligram per milliliter NHS-biotinløsning i DMSO til fire dekselslipper plassert på parafinfilm.Sett et smørbrød med de fire andre dekselslippene på toppen, med to dekselslipper vendt mot hverandre med funksjonaliseringsløsningen i mellom. På dag to fjerner du parabolen fra fire grader Celsius og skiller de sandwichede dekselslippene. Unngå riper eller skade den funksjonaliserte overflaten mens du skiller smørbrødet.Plasser deretter dekselet i stativet med den belagte overflaten vendt mot hverandre. Tørk med nitrogengass. Legg dekselet i en ny tallerken med en parrafinfilm inni.Legg til 800 mikroliter med 0,1 % bovint serumalbumin i 1X PBS på hver omslagsslipp. Inkuber dekselet glir ved romtemperatur i 30 minutter for å passivisere overflaten og blokkere ikke-spesifikk binding av etterfølgende funksjonaliseringsreagenser. For å funksjonalisere dekselslippene, tilsett 800 mikroliter av ett mikrogram per milliliter streptavidin i 1X PBS ved romtemperatur i 45 til 60 minutter.Monter TGT-sondene i et PCR-rør ved hjelp av en termosirkulerer. Etter inkubasjon, vask dekselet tre ganger med 1X PBS. Tilsett 100 mikroliter av de forhåndsmonterte TGT-sondene i fire dekselslipper og lag smørbrød ved hjelp av de resterende fire dekselslippene med den funksjonaliserte siden vendt mot sondene.Dekk med aluminiumsfolie. Etter inkubasjon, separer smørbrødene og vask dekselslippene med 1X PBS tre ganger. Monter forsiktig dekselets glidninger i forhåndsrengjorte bildekamre.For å undersøke effekten av den epidermale vekstfaktorstimuleringen på Cos-7-mekanikk, vedheft og cellespredning, kan du prøve Cos-7 celler med 0,05% trypsin-EDTA i to minutter. Nøytraliser trypsin ved å vaske med HBSS og sentrifugere ved 800 G i fem minutter. Plateceller med en tetthet på 40 000 celler på de monterte TGT-overflatene i DMEM supplert med 50 nanogram per milliliter EGF eller DMEM uten EGF.Etter inkubasjon, vask cellene tre ganger med 1X PBS. Fest med to milliliter 4% paraformaldehyd i 12 minutter ved romtemperatur. Vask dekselet glir fem ganger med 1X PBS med fem minutters intervaller ved romtemperatur.Alternativt kan du inkubere dekselslippene med 50 millimolar ammoniumklorid i 1X PBS i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Tilsett buffer A og plasser bildekamrene med dekselslipper i en fuktighetsbeholder. Inkuber i 30 minutter ved 37 grader Celsius for å blokkere og permeabilisere cellene.Fortynn det primære anti-paxillin-antistoffet ved 1:250 fortynning i blokkeringsbuffer. Inkuber med 200 mikroliter primær antistoffoppløsning per dekselslipp i to timer ved 37 grader Celsius. Merk celler samtidig med en blanding av dikonjugert geit/anti-kanin sekundært antistoff ved 1:800 fortynning og dikonjugert falloidin ved 1:400 fortynning i 200 mikroliter blokkeringsbuffer per dekselslipp.Vask overflatene fem ganger med 1X PBS med fem minutters intervaller. For å begynne med, legg olje til målet, rengjør dekselsklibunnen på prøvekammeret, og legg prøven på scenen. Fokuser på en celle og engasjere det perfekte fokuset.Juster RICM ved å lukke og midtstille epi-belysningsåpningens membran. Fokuser 488-nanometerlaseren til et lite sted i taket på rommet og øk forekomstens vinkel til forbi den kritiske vinkelen, mens du overvåker fluorescens på kameraet i live-modus. Vær oppmerksom på en kraftig reduksjon i bakgrunnsfluorescens og et enkelt fokusplan når den kritiske vinkelen overskrides.Identifiser celler for avbildning ved hjelp av live-modusen til kameraet ved hjelp av RICM. Skaff ricm og TIRF bilder av aktin ved 488-nanometer eksitasjon, integrin spenning ved 561-nanometer eksitasjon, og paxillin ved 647-nanometer eksitasjon. Hent bilder sekvensielt ved hjelp av en eksponeringstid på 200 millisekunder.Endre dekselslipper, fokuser og gjenta. Cos-7 celler ble belagt på denne TGT-overflaten med eller uten EGF-stimulering for å studere effekten av EGFR-aktivering med ligandstimulering på integrinmekanikk. Hvis en integrin binder liganden og bruker en kraft som er større enn spenningsterskeltotalen til sonden, vil DNA-dupleksen skille seg, noe som fører til fluorescens.Enhver TGT-sonde som en mekanisk kraft ikke har sprukket, forblir ikke-fluorescerende. Cellene ble inkubert med eller uten EGF på TGT-overflatene i 60 minutter, fast og immunostert for å vise brennviddefordelingen og organiseringen av cytoskjelettet. I RICM-bildet ble Cos-7 cellespredning på 56-piconewton TGT-overflaten betydelig forbedret med EGF-stimulering sammenlignet med uten stimulering.Stimulering med EGF resulterte i en mer sirkulær morfologi, som representerer Cos-7 cellespredning og vekst. Fluorescensen fra åpne sonder er også høyere med EGF-stimulering, som observert i spenningsfluorescensbildet. Den integrerte intensiteten av åpne sonder proporsjonal med antall åpne sonder var mye høyere med EGF-stimulering enn uten stimulering.Husk alltid retningen på dekselslippene, og hold den funksjonaliserte overflaten vendt oppover. Når du skiller smørbrødet, må du være forsiktig slik at overflaten ikke riper eller er skadet. Etter overflatesyntese kan man sonde for cytoplasmatiske proteiner som regulerer celleadhesjon eller mekanisk transduksjon.Dette gjør det mulig å identifisere nedstrøms signalmolekyler involvert i orkestrering av cellemekanikk ved plasmamembranen.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Modifisert Gjær-Two-Hybrid System for å identifisere proteiner i samspill med Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robust 3D DNA FISH Bruke Direkte merkede prober

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematisk analyse av celledeling og Expansion: Kvantifisering Cellular Grunnlag for Vekst og prøvetaking Utviklingssoner i<em&gt; Zea mays</em&gt; Blader

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analysere Cell Surface Adhesjon Ombygging i Response til Mekanisk Tension Bruke magnetiske kuler

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Signaling

Molekylær analyse av Endothelial-mesenchymal overgang av omforming vekst faktor-β signalisering

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...