Name: tension gauge tether probes for quantifying growth factor mediated integrin mechanics and adhesion
Uploaded: 2022-02-11T14:30:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion at JoVE.com

Författarna vill uppmärksamma medlemmarna i Mattheyses-laboratoriet för fruktbara diskussioner och kritik. Vi erkänner finansiering till A.L.M. från NSF CAREER 1832100 och NIH R01GM131099.

1. TGT-oligonukleotidpreparat
OBS: Detaljerna i oligonukleotidsondsyntes beskrivs här. Observera att vissa ändringar och reningssteg kan läggas ut för anpassad syntes.
<ol><li>Aktivera den primära aminen av cyklo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)] peptiden med azid-NHS-länkaren som beskrivs av Zhang et al22 genom att blanda i ett förhållande 1:1,5 (100:150 nmoler) i en slutlig volym av 10 μl dimetylformamid. Tillsätt 0,1 μl av den organiska basen trietylamin och inkubera i 12 timmar vid 4 °C.</li>
	<li>Rena produkten med hplc i omvänd fas med 0,1 M TEAA (lösningsmedel A) och 100 % acetonitril (lösningsmedel B) med en flödeshastighet på 1 ml/min och utgångstillståndet 10 % lösningsmedel B inställt på en gradient av 0,5 %/min. Kombinera de eluerade topparna (absorbans vid 203 nm) och verifiera med MALDI-TOF-masspektrometri. Produkten är cRGDfK-azid.</li>
	<li>För att generera TGT-toppsträngen, kombinera cRGDfK-azid och alkyn-21-BHQ2 oligonukleotid (TGT-toppsträng: 5Hexynyl / GTGAAATACCGCACAGATGCG / 3BHQ_2) i ett förhållande 2: 1 (͂200 μM: 100 μM) i 100 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 5 mM natriumaskorbat och 0,1 μM förformad Cu-THPTA. Låt reaktionen pågå i minst 4 timmar vid rumstemperatur (RT) eller över natten vid 4 °C.</li>
	<li>Bearbeta blandningen genom P2-avsaltningsgelen för att avlägsna överskott av färgämne, biprodukter, organiskt lösningsmedel och oreagerade reagenser. Förbered centrifugkolonnen med 650 μL förhydratiserad P2-gel genom att snurra ner den vid 18 000 x g i 1 min. Kassera genomströmningsvätskan och tillsätt reaktionsblandningen. Snurra igen vid 18 000 x g i 1 min och samla upp genomströmningen. Bringa reaktionsblandningen till en slutlig volym av 300 μL med ultrarent vatten. OBS: Förhydrera P2-gelén med vatten i 6 timmar.</li>
	<li>Rena den avsaltade reaktionsblandningen med HPLC med omvänd fas. De organiska lösningsmedel som används för denna rening inkluderar 0,1 M TEAA iH2O(lösningsmedel A) och 100% MeCN (lösningsmedel B eller den mobila fasen).<ol>
<li>Innan blandningen injiceras, balansera kolonnen med ett initialt tillstånd på 10% lösningsmedel B med en gradient på 1% / min. Justera flödet till 1 ml/min. Injicera reaktionsblandningen i HPLC-slingan med en 500 μL injektionsnål.</li>
		<li>Samla upp produkten genom att visualisera toppabsorptionen vid 260 nm för DNA och 560 nm för BHQ2-släckaren. Torka den eluerade produkten över natten i en vakuumcentrifugalkoncentrator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Använd nukleofil substitution för att koppla TGT-bottensträngen till Cy3B-NHS-ester som beskrivs i Ma et. al25. Blanda 100 μM av 56 pN TGT bottensträngen (5Biosg / TTTTTT / iUniAmM / CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT) med 50 μg Cy3B-NHS-ester förupplöst i 10 μL DMSO. Justera pH-värdet för denna blandning till 9 med 0,1 M natriumbikarbonat och bringa den slutliga volymen till 100 μL med 1x PBS. Inkubera reaktionsblandningen över natten vid RT.</li>
	<li>Rena blandningen sekventiellt med P2-gelfiltrering och HPLC med omvänd fas för att separera oreagerade reagenser, salter och organiska lösningsmedel (beskrivs i steg 1.4 och 1.5).</li>
	<li>Uppskatta koncentrationen av de renade oligonukleotidfärgämneskonjugaten genom att registrera deras absorbans vid 260 nm med hjälp av en spektrofotometer.</li>
	<li>Karakterisera de renade produkterna med MALDI-TOF-masspektrometri. Lös upp överskott av 3-hydroxipicolinsyra i TA50-lösningsmedel (50:50 v / v acetonitril och 0,1% TFA iddH2O) för att bereda den färska MALDI-matrisen. Uppskattade och uppmätta molekylvikter för de märkta produkterna är: cRGDfK-1-BHQ2 - 8157.9 (beräknad), 8160.1 (hittades); Cy3B märkt 56 pN TGT - 10272,7 (beräknat), 10295,8 (hittades).</li>
	<li>Lös upp de övre och nedre trådarna separat i nukleasfritt vatten i en koncentration mellan 30-50 μM. Använd DNase-fria pipettspetsar för att undvika förorening av beståndet. Förvaras vid 4 °C för kortvariga tillämpningar eller -20 °C för långvariga tillämpningar. Stabiliteten hos oligonukleotider påverkas inte av upprepade frys-tina cykler.</li>
</ol>2. Förberedelse av ytan
Dag 1:
<ol><li>Placera 25 mm glasöverdrag (upp till 8) i ett polytetrafluoretylenställ. Placera racket i en 50 ml borosilikatbägare som innehåller 40 ml 200 bevis etanol. Täck bägaren med paraffinfilm för att undvika att vatten tränger in och ultraljudsbehandling vid en driftsfrekvens på 35 kHz i 10-15 minuter vid RT (figur 1A).</li>
	<li>Fyll en 50 ml bägare med 40 ml Piranha-lösning som nyligen beretts genom att blanda svavelsyra och väteperoxid i förhållandet 3:1 i en pyrexbägare. Rör om med en glaspipett. Överför täckglaset till bägaren och inkubera i 30 minuter vid RT i dragskåpet för att etsa täckglasytan (figur 1B). OBS: Använd full PPE, inklusive en labbrock, handskar och skyddsglasögon, och arbeta i den kemiska dragskåpet. Tillsätt väteperoxid till syran långsamt för att förhindra överhettning av lösningen.</li>
	<li>Efter etsning, använd pincett för att överföra täckglasstället till en bägare med ultrarent vatten. Upprepa detta steg sex gånger med 15 s mellanrum för att helt neutralisera syran (figur 1C). OBS: Lämna Piranha-lösningen i den kemiska dragskåpet över natten innan du slänger den i syraavfallsbehållaren.</li>
	<li>Inspektera täckglasen visuellt för att säkerställa att ytorna ser rena ut utan mönster eller dammpartiklar på glasytan. Upprepa steg 2.1-2.4 om mönster eller damm upptäcks. OBS: Testa ytans hydrofilicitet genom att doppa behandlade täckglas i vatten och ta bort dem vertikalt. Vatten på behandlade täckglas drar sig tillbaka som ett enhetligt ark för att bilda Youngs ringar jämfört med obehandlade täckglas som bildar fläckar.</li>
	<li>Överför täckglaset till en bägare med 200 säker etanol och tvätta två gånger i 15 s för att balansera ytor till organiskt lösningsmedel. Överför täckglasstället till 200-säker etanollösning med 3% APTES i 1 timme vid RT för att silanisera täckglasen (figur 1D). Täck bägaren med paraffinfilm. OBS: APTES-deponeringsparametrar varierar beroende på ytrengöringsmetod, lösningsmedelsvattenhalt, APTES-koncentration, inkubationstider och temperatur för glödgning.</li>
	<li>Sänk ner racket i en ren bägare med 200 säker etanollösning. Upprepa denna tvätt tre gånger i 15 s vardera (figur 1E).</li>
	<li>Torka täckglasen med kvävegas (N2) med lågt utgångstryck. Placera täckglasen i en 10 cm polystyrenskål med en bit paraffinfilm som ligger platt inuti den. Se till att täckglasen är torra och separerade (figur 1F).</li>
	<li>Tillsätt 100 μL 2 mg/ml NHS-biotinlösning i DMSO till fyra täckglas placerade på paraffinfilm. Ställ en "smörgås" med de andra fyra täckglasen ovanpå (två täckglas vända mot varandra med funktionaliseringslösningen emellan) och inkubera skålen över natten vid 4 °C (figur 1G). OBS: Vid 4 °C är NHS-reagenset stabilare, vilket underlättar enhetlig ytfunktionalisering. Dessutom sparar smörgåsen reagenser. Undvik att tillsätta överflödig lösning i smörgåsen eftersom det kan läcka ut och orsaka att täckglass glider.</li>
</ol>Dag 2:
<ol start="9"><li>Ta bort skålen från 4 °C och separera de inklämda täckglasen. Rikta slipsarna i stället med den belagda ytan vänd mot varandra enligt figur 2A. Tvätta dem med 200 säker etanollösning tre gånger i 15 s vardera. Torka med N2-gas och lägg dem i en ny skål med en paraffinfilm inuti den. OBS: Att orientera täckglasen enligt anvisningarna hjälper till att identifiera den funktionaliserade ytan.</li>
	<li>Tvätta täckglasen med 1 ml 1x PBS tre gånger för att balansera dem tillbaka till vattenfasen. Tillsätt 800 μL 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS (w/v) till var och en av täckglasen och inkubera vid RT i 30 minuter för att passivera ytan och blockera icke-specifik bindning av efterföljande funktionaliseringsreagenser (figur 2B).</li>
	<li>Tvätta täckglasen tre gånger med 1 ml 1x PBS efter inkubation. Tillsätt 800 μl 1 μg/ml streptavidin i 1x PBS vid RT i 45-60 min för att funktionalisera täckglasen (figur 2C). OBS: Behåll en täckglas utan streptavidin för att verifiera passiveringseffektiviteten (valfritt). Add10 nM biotinylerade molekyler och bild med experimentella betingelser. Denna ytintensitet bör ligga nära kamerans mörka brus.</li>
	<li>Montera samtidigt med steg 2.11 TGT-sonderna (topp: bottensträng vid molförhållandet 1: 1) vid en slutlig koncentration av 50 nM i 100 μL 1 M NaCl i ett PCR-rör med hjälp av en termocykler. Dissociera strängar vid 95 °C i 5 minuter och glödga gradvis genom att sänka temperaturen till 25 °C och bibehålla den i 25 minuter (figur 2D). Undvik förlängd exponering av TGT-sonder för ljus.</li>
	<li>Efter streptavidinkubation, använd 1x PBS för att tvätta täckglasen tre gånger. Tillsätt 100 μL av de förmonterade TGT-sonderna till fyra av täckglasen och gör smörgåsar med de återstående 4 täckglasen med den funktionaliserade sidan vänd mot sonderna (åtta ytor kräver fyra rör av hybridiserade TGT-sonder). Täck med aluminiumfolie och inkubera i 1 h vid RT för att tillåta sondbindning till ytan (figur 2E).</li>
	<li>Efter inkubation, separera smörgåsarna och tvätta täckglasen med 1x PBS tre gånger. TGT-ytorna är nu redo för avbildning. Montera försiktigt täckglasen i förrenade bildkammare och tillsätt 1x PBS för att hålla ytorna hydratiserade (figur 2F). OBS: Att dra åt kamrarna för hårt kommer att knäcka ytan. Förhindra torkning av ytorna.</li>
</ol>3. Cellberedning och färgning
<ol><li>För att undersöka effekten av epidermal tillväxtfaktor (EGF) stimulering på Cos-7-mekanik, vidhäftning och cellspridning, trypsinisera Cos-7-celler med 0.05% Trypsin-EDTA i 2 minuter. Neutralisera trypsinet genom att tvätta med HBSS och centrifugera vid 800 x g i 5 min. Upprepa neutraliseringssteget en gång till.</li>
	<li>Plattceller med en densitet på 4 x 104 celler på de sammansatta TGT-ytorna i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 50 ng/ml EGF eller DMEM utan EGF. Låt cellerna spridas i 60 minuter vid 37 °C med 5 %CO2 i en cellodlingsinkubator (figur 3A). OBS: Celler inkuberas i DMEM utan serum för att undvika stimulering från tillväxtfaktorer. EGF späds ut i 10 mM ättiksyra för att göra ett lager på 1 mg / ml. Den används vid 50 ng/ml i DMEM för avbildningsexperiment.</li>
	<li>Tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS efter inkubation och fixera med 2 ml 4% paraformaldehyd i 12 minuter vid RT (figur 3B). OBS: Alla inkubationssteg utförs på en roterande skakapparat vid ~ 35 rpm för enhetlig spridning av lösningarna. Skydda TGT-ytorna från ljus genom att täcka dem tills de är redo för avbildning.</li>
	<li>Aspirera fixeringsmedlet och tvätta täckglasen fem gånger med 1x PBS med 5 minuters mellanrum vid RT. Alternativt kan du inkubera täckglasen med 50 mM NH4Cl i 1x PBS i 30 min vid 37 °C för att släcka paraformaldehydassocierad autofluorescens och tvätta tre gånger med 1x PBS med 5 minuters mellanrum (figur 3B).</li>
	<li>Tillsätt buffert A (1x PBS, 5% normalt hästserum, 5% normalt getserum, 1% BSA, 0,025% Triton X-100) och inkubera i 30 minuter vid 37 °C för att blockera och permeabilera cellerna. Tvätta tre gånger med 1x PBS med 5 minuters mellanrum (figur 3B).</li>
	<li>Placera bildkamrarna med täckglas i en fuktbehållare. Späd den primära anti-paxillinantikroppen (fokal vidhäftningsmarkör) vid 1:250 i blockerande buffert (1x PBS, 5% normalt hästserum, 5% normalt getserum, 1% BSA, 0,005% Triton x-100). Inkubera med 200 μl primär antikroppslösning per täckglas i 2 timmar vid 37 °C (figur 3B). OBS: Låt inte ytorna torka ut.</li>
	<li>Tvätta täckglasen fem gånger med 1x PBS med 5 minuters mellanrum och sätt tillbaka dem i fuktbehållaren. Märk celler samtidigt med en blandning av färgämneskonjugerad get-antikanin sekundär antikropp vid 1:800 utspädning och färgkonjugerat falloidin (aktin) vid 1:400 utspädning i 200 μL blockerande buffert per täckglas. Inkubera vid 37 °C i 60 minuter (figur 3B).</li>
	<li>Tvätta ytorna fem gånger med 1x PBS med 5 minuters mellanrum och förvara vid 4 °C tills de är klara för avbildning (figur 3B). OBS: Bildprover inom 3 dagar efter ytbehandling för att undvika signalnedbrytning.</li>
</ol>4. Bildförvärv
<ol><li>Använd ett oljedykningsmål på 60x med hög numerisk bländare (1,49) på ett inverterat mikroskop med 488, 561 och 647 TIRF-excitation, RICM-excitation, ett perfekt fokussystem och en digitalkamera.<ol>
<li>Tillsätt olja till målet, rengör täckglasbotten på provkammaren och placera provet på scenen. Fokusera på en cell och engagera det perfekta fokuset.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sätt mikroskopet i RICM-avbildningsläge med epifluorescens excitation och en GFP-filterkub med emissionsfiltret borttaget. Rikta in RICM genom att stänga och centrera epi-illumination-bländarens membran.</li>
	<li>Sätt mikroskopet i TIRF-läge med laserexcitation och en fyrpass TIRF-filterkub. Fokusera 488 nm-lasern till en liten plats i taket på rummet och öka infallsvinkeln tills den passerar den kritiska vinkeln medan du övervakar fluorescensen på kameran i live-läge. Observera en kraftig minskning av bakgrundsfluorescensen och ett enda fokusplan när den kritiska vinkeln överträffas. OBS: TIRF exciterar ett tunt område (~ 100 nm) närmast gränssnittet mellan provöverdrag och markerar öppna TGT-sonder och fokala vidhäftningar samtidigt som fluorescensen utan fokus elimineras inifrån cellen. Om TIRF inte är tillgängligt kan epi-fluorescens användas. signal-brusförhållandena kommer dock att vara lägre.</li>
	<li>Identifiera celler för avbildning med kamerans "live"-läge med RICM.</li>
	<li>Skaffa RICM-bilden och TIRF-bilder av aktin (640 nm ex), integrinspänning (561 nm ex) och paxillin (488 nm ex). Hämta bilder sekventiellt med en exponeringstid på 200 ms. OBS: Exponeringstiden är beroende av många faktorer, inklusive målet, lasereffekt, emissionsfilter och kamerakänslighet. Signalen ska vara minst 2x större än bakgrunden. Bakgrunden är runt 1000 AU så signalen bör vara minst 2000-3000 AU.</li>
	<li>Upprepa 4,4-4,5 för minst 30 celler. Ändra omslagsglas, fokus och upprepa 4.4-4.5.</li>
</ol>5. Analys av data
OBS: Utför kvantitativ bildanalys med hjälp av Fiji-programvaran och analysen med hjälp av statistikprogramvara.
<ol><li>Öppna bilduppsättningen för en cell.</li>
	<li>Skapa en mask av cellområdet (RICM-mask) genom att spåra cellens gräns i RICM-bilden med hjälp av markeringsverktyget ImageJ Freehand. Spara intresseområdet (ROI) till ROI-hanteraren (Analysera > Verktyg > ROI-hanteraren) (bild 4A1,2).</li>
	<li>Välj ett representativt område utanför cellen i integrinspänningsbilden och rita en ROI på minst 200 x 200 pixlar. Uteslut alla andra celler eller fluorescerande skräp från ROI. Mät bakgrundsfluorescensen i ROI med hjälp av mätverktyget (Analysera > mått) (figur 4A3).</li>
	<li>Subtrahera den genomsnittliga bakgrundsfluorescensen som erhölls i steg 5.2 från spänningsbilden (Process > Math > Subtrahera) (Figur 4A4).</li>
	<li>Använd RICM-masken som fastställdes i steg 5.2 för att definiera spänningssignalen i cellfotavtrycket (ROI-hanteraren > Välj > Använd mask > Redigera > Rensa utanför) (bild 4A5).</li>
	<li>Skapa en tröskelmask för spänningsbilden med Huangs metod för automatisk tröskel (Bild > Justera > tröskelvärde) (Bild 4A6). Se till att tröskelmasken bäst representerar området för den genererade integrinspänningen. Som en tumregel ställer du in tröskeln till 2x den genomsnittliga bakgrundsfluorescensen.</li>
	<li>Skapa ett urval av den tröskelbegränsade spänningsmasken (Redigera > markering > skapa) (bild 4A7).</li>
	<li>Överför den valda masken till spänningsbilden som genererades i steg 5.4 och mät den integrerade intensiteten hos öppna sonder (ROI manager > Select (Tension Mask) > Analysera > Mät > RawIntDen) (Figur 4C).</li>
	<li>Mät cellmorfometriska egenskaper, cirkularitet och bildförhållande från RICM-masken (ROI manager > Select (RICM-mask) > Apply mask > Analyze > Measure) (Bild 4B).</li>
	<li>Mät den mekaniska brotttätheten, definierad som procentandelen av cellavtrycket med spruckna sonder genom att välja spänningsmaskbilden och applicera RICM-masken (ROI manager > Select (RICM Mask) > Analysera > Mät > % Area) (Figur 4C).</li>
	<li>Exportera mätningarna för vidare analys och visualisering till statistikprogram.</li>
	<li>Upprepa 5,1-5,11 för varje cell.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lim, C. -. G., Jang, J., Kim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+machinery+for+sensing+mechanical+force.">Cellular machinery for sensing mechanical force.</a> BMB Reports. 51 (12), 623-629 (2018).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Micro)managing+the+mechanical+microenvironment.">(Micro)managing the mechanical microenvironment.</a> Integrative Biology. 3 (10), 959-971 (2011).</li><li>Vogel, V., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+matter+in+health+and+disease.+From+Cancer+to+Tissue+Engineering.">Mechanical forces matter in health and disease. From Cancer to Tissue Engineering.</a> Nanotechnology. , 233-303 (2010).</li><li>Wang, J. H. C., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+rules+cell+biology.">Mechanics rules cell biology.</a> BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 2 (1), 16 (2010).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).</li><li>Streuli, C. H., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+co-operation+between+integrins+and+other+receptor+systems.">Signal co-operation between integrins and other receptor systems.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 491-506 (2009).</li><li>Chiasson-MacKenzie, C., McClatchey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-induced+cytoskeletal+changes+drive+complex+cell+behaviors:+The+tip+of+the+iceberg.">EGFR-induced cytoskeletal changes drive complex cell behaviors: The tip of the iceberg.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li><li>Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+as+biomechanical+sensors+of+the+microenvironment.">Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 457-473 (2019).</li><li>De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+EGFR+signaling+in+tumor+microenvironment.">The role of the EGFR signaling in tumor microenvironment.</a> Journal of Cellular Physiology. 214 (3), 559-567 (2008).</li><li>Javadi, S., Zhiani, M., Mousavi, M. A., Fathi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+Epidermal+Growth+Factor+Receptors+(EGFR)+and+integrins+in+resistance+to+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors+(TKIs)+in+solid+tumors.">Crosstalk between Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR) and integrins in resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in solid tumors.</a> European Journal of Cell Biology. 99 (4), 151083 (2020).</li><li>Eliceiri, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+and+growth+factor+receptor+crosstalk.">Integrin and growth factor receptor crosstalk.</a> Circulation Research. 89 (12), 1104-1110 (2001).</li><li>Dan, L., Jian, D., Na, L., Xiaozhong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+EGFR+and+integrin+affects+invasion+and+proliferation+of+gastric+cancer+cell+line,+SGC7901.">Crosstalk between EGFR and integrin affects invasion and proliferation of gastric cancer cell line, SGC7901.</a> OncoTargets and Therapy. 5, 271-277 (2012).</li><li>Giancotti, F. G., Tarone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+control+of+cell+fate+through+joint+integrin/receptor+protein+kinase+signaling.">Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling.</a> Annual Reviews: Cell and Developmental Biology. 19, 173-206 (2003).</li><li>Ricono, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cross-talk+between+epidermal+growth+factor+receptor+and+integrin+alphavbeta5+promotes+carcinoma+cell+invasion+and+metastasis.">Specific cross-talk between epidermal growth factor receptor and integrin alphavbeta5 promotes carcinoma cell invasion and metastasis.</a> Cancer Research. 69 (4), 1383-1391 (2009).</li><li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell-generated+forces:+a+guide+to+the+available+tools.">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li><li>Hang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosensors+for+single+cell+mechanical+interrogation.">Nanosensors for single cell mechanical interrogation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 179, 113086 (2021).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+traction+forces+by+micropillar+arrays:+contribution+of+substrate+warping+to+pillar+deflection.">Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection.</a> Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li><li>Ma, V. P. -. Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Nanotechnology+as+an+Emerging+Tool+to+Study+Mechanotransduction+in+Living+Systems.">DNA Nanotechnology as an Emerging Tool to Study Mechanotransduction in Living Systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Kim, Y., Kim, K. A., Kim, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+force+sensors+to+study+the+molecular+level+forces+required+to+activate+signaling+pathways.">Double-stranded DNA force sensors to study the molecular level forces required to activate signaling pathways.</a> Journal of the Korean Physical Society. 78 (5), 386-392 (2021).</li><li>Rao, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+activation+attenuates+the+mechanical+threshold+for+integrin+tension+and+focal+adhesion+formation.">EGFR activation attenuates the mechanical threshold for integrin tension and focal adhesion formation.</a> Journal of Cell Sciences. 133 (13), (2020).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Ma, V. P. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+induced+catalytic+amplification+reaction+for+readout+of+receptor-mediated+cellular+forces.">Mechanically induced catalytic amplification reaction for readout of receptor-mediated cellular forces.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5488-5492 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+single+molecular+forces+required+to+activate+integrin+and+notch+signaling.">Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling.</a> Science. 340 (6135), 991-994 (2013).</li><li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+regulated+conformational+change+of+integrin+&#945;V&#946;3.">Force regulated conformational change of integrin &#945;V&#946;3.</a> Matrix Biology. 60-61, 70-85 (2017).</li><li>Kantlehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+coating+with+cyclic+RGD+peptides+stimulates+osteoblast+adhesion+and+proliferation+as+well+as+bone+formation.">Surface coating with cyclic RGD peptides stimulates osteoblast adhesion and proliferation as well as bone formation.</a> ChemBioChem. 1 (2), 107-114 (2000).</li><li>Kapp, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+evaluation+of+the+activity+and+selectivity+profile+of+ligands+for+RGD-binding+integrins.">A comprehensive evaluation of the activity and selectivity profile of ligands for RGD-binding integrins.</a> Scientific Reports. 7, 39805 (2017).</li><li>Kok, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+functional+evaluation+of+RGD-modified+proteins+as+alpha(v)beta(3)+integrin+directed+therapeutics.">Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as alpha(v)beta(3) integrin directed therapeutics.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 128-135 (2002).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2019).</li><li>Luca, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-Jagged+complex+structure+implicates+a+catch+bond+in+tuning+ligand+sensitivity.">Notch-Jagged complex structure implicates a catch bond in tuning ligand sensitivity.</a> Science. 355 (6331), 1320-1324 (2017).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Brockman, J. M., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+proofreading:+a+general+mechanism+to+enhance+the+fidelity+of+information+transfer+between+cells.">Mechanical proofreading: a general mechanism to enhance the fidelity of information transfer between cells.</a> Frontiers in Physics. 7, 14 (2019).</li></ol>

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Med den detaljerade steg-för-steg-proceduren som beskrivs ovan kan man förbereda TGT-ytor för att kvantifiera cellmorfologi och integrinspänning som genereras av vidhäftande celler under cellfästning och spridning efter behandling med EGF. Den enkla sonddesignen och syntesen och ytbehandlingen tillsammans med den enkla experimentella installationen gav en stabil plattform för att studera interaktionen mellan EGFR och integriner. Sammantaget validerar resultaten att ligandberoende aktivering av EGFR förbättrar cellspridning, ställer in de kraftbärande egenskaperna hos integrinreceptorer och främjar fokal vidhäftningsorganisation och mognad. Resultaten som erhållits med hjälp av TGT-sonder stöder den övergripande hypotesen att tillväxtfaktorer, såsom EGFR, fungerar som "mekano-arrangörer", vilket ökar mängden och den rumsliga organisationen av integrinspänning och reglerar orienteringen och mekaniken för fokal vidhäftningar.
Vid applicering på TGT-ytan landar cellerna, fäster och sprider sig när integrinreceptorerna (αVβ3) känner av och binder till cRGDfK-liganden. På så sätt kan TGT-sonderna brytas mekaniskt, vilket genererar fluorescens vid platsen för ligandengagemang. Avläsningen är den kumulativa "krafthistoriken" för cellen som interagerar med ytan. Det finns några vanliga problem med TGT-ytorna som kan förekomma under dessa experiment. Hög ytbakgrundsfluorescens (figur 6A,B), ojämnt ytutseende, cellernas misslyckande med att generera spänningssignal (figur 6C,D) och att celler inte sprider sig (figur 6E,F) kan bero på tekniska brister med TGT-sonden eller ytsyntesen. Lösningar på dessa vanliga problem presenteras i tabell 1.
Den enkla utformningen av TGT-sonder ger cellbiologer ett kraftfullt verktyg för att studera specifika tillväxtfaktor-integrinsignaleringsresultat isolerat utan störningar från andra cellytereceptorer genom att endast tillhandahålla specifika ligander och stimuleringar. Dessutom möjliggör TGT-sonder undersökning av spänningströskeln som understryker enskilda integrinreceptorer under celladhesion vid pN-känslighet. Alternativa metoder misslyckas med att rapportera krafter som utövas av enskilda receptorer med hög rumslig upplösning i fasta prover31. Dragkraftsmikroskopi är endast känslig för nN-krafter, en storleksordning högre än de krafter som appliceras av enskilda integrinreceptorer15, och molekylära spänningssonder mäter pN-krafter, men eftersom de är reversibla tål de inte robust fixering. Av dessa skäl är TGT-sonder ett attraktivt verktyg för att studera mekaniken för tillväxtfaktor-integrininteraktioner.
Det finns flera tekniska nyanser associerade med TGT-sonder som bör beaktas innan du utformar ett experiment. Spänningsbilden är en ögonblicksbild i tid, som representerar krafthistoriken och inte en indikator på receptor-ligand-engagemangen vid en given tidpunkt. Eftersom signalgenerering är beroende av sondelseparation är TGT-fluorescensen resultatet av öppna sonder som inte är under aktiv spänning från receptor-ligand-engagemang. Detta innebär att avläsningen för integrinspänning som erhållits på TGT-ytan är historisk och kumulativ till sin natur som representerar var det fanns krafter större än Ttol; platserna för nuvarande receptor-ligandkrafter mindre än Ttol rapporteras inte19,32. Eftersom TGT-bristning resulterar i uppsägning av receptor-ligand-engagemanget beror cellspridning på integrin-ligandinteraktioner som upplever krafter lägre änT-tol. Användaren måste därför vara försiktig när han definierar tiden efter plätering för att uppskatta de mekaniska resultaten i samband med integrinbaserade vidhäftningar. Slutligen måste betydelsen av Ttol övervägas. TGT-sonderna som används här har enT-tol på 56 pN, därT-tol är den konstanta kraften som behövs för att bryta 50% av sonderna när de appliceras på 2 s. När man överväger komplicerade biologiska system upplever TGT: er sannolikt en heterogen och mångsidig kraftgradering med varierande tidsberoenden. Om TGT: er bryts av krafter större än Ttol, skulle fluorescensen vara en underskattning av den totala spänningen. Alternativt kan krafter under Ttol som appliceras under längre varaktigheter bryta ett liknande antal sonder som höga tröskelkrafter som appliceras under kortare tider. Båda dessa scenarier kan resultera i samma fluorescensintensitetsavläsning, vilket gör det svårt att lösa den exakta spänningsstorleken eller dynamiken med hjälp av TGT-sonder33,34.
Sammantaget bör bedömningar av integrinspänning med tillväxtfaktorstimulering göras noggrant genom att utforma experiment med interna kontroller, jämföra spridningsprofiler på andra matrisbelagda ytor, göra parallella bedömningar av TGT-fluorescens i celler i närvaro eller frånvaro av tillväxtfaktorstimulering och använda TGT med olikaT-tol . TGTs möjliggör kvantifiering av rollen som tillväxtfaktorsignalering för att reglera mekaniken hos integrinreceptorer, fokal vidhäftningsdynamik och cellspridning. Detta protokoll kan användas som mall för många TGT-baserade experiment med hjälp av sonder med olikaT-tol, olika ligander, olika celltyper eller olika stimuleringsförhållanden. Alla proteiner av intresse kan märkas efter fixering, och vilken typ av kvantitativ bildanalys som helst kan implementeras. Som sådan presenterar vi en mall för många TGT-experiment.
Användningen av TGT-sonder är inte begränsad till att studera integriner utan kan utvidgas till en mängd olika cellmembranreceptorer över olika celltyper genom att modifiera liganden. TGT-sonder har använts för att undersöka krafternas roll vid reglering av olika receptorsignalkaskader, inklusive identifiering av den mekaniska rollen hos Notch-receptormekanik i embryonal utveckling och neurogenes35, krafterna som förmedlar identifiering och internalisering av antigener av B-cellreceptorer36 och den mekaniska korrekturläsningsförmågan hos T-cellsytereceptorer för att upptäcka förändringar i krafter för att öka styrkan och specificiteten hos signalöverföring37 . Tillsammans belyser dessa resultat den enorma potentialen hos TGT-sonder i en mängd olika experimentella miljöer.

Celler har den inneboende förmågan att känna av, generera och reagera på mekaniska krafter, vilket leder till förändringar i cellulär fenotyp och ombyggnad av den lokala mikromiljön 1,2. Krafter spelar en avgörande roll för att reglera många aspekter av cellbeteende, inklusive vidhäftning, migration, spridning, differentiering och sårläkning 3,4. Avvikelser i det dubbelriktade mekaniska utbytet mellan en cell och mikromiljön kan leda till sjuka tillstånd, inklusive cancer5. Många membranreceptorer är involverade i att upprätthålla cellmatrishomeostas; av dessa har integriner och epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) robust synergi 6,7. Klassiskt etablerar integriner den mekaniska länken mellan mikromiljön och intracellulär cytoskelett medan EGFR reglerar celltillväxt, proliferation och överlevnad 8,9. EGFR är ett mycket studerat terapeutiskt mål, fokuserat på reglering utifrån och in som underlättar intracellulär signalering. EGFR-integrin crosstalk har etablerats genetiskt och biokemiskt för att reglera utvecklingen av flera sjukdomar, inklusive cancer10,11. Medan studier indikerar förekomsten av EGFR-integrin-samspel, tillskrivs resultaten signalvägar bort från plasmamembranet 7,12,13,14. Effekten av EGFR, eller andra tillväxtfaktorer, på cellmekaniken förblir i stort sett outforskad delvis på grund av bristen på verktyg för att mäta cellulära krafter och signaleringsresultat. Utmaningen ligger i att identifiera lämpliga verktyg för att studera kommunikationen mellan dessa parallella signalparadigmer och för att kvantifiera deras specifika bidrag till cellmekaniken.
Flera metoder har utvecklats för att mäta krafter som genereras av celladhesionsreceptorer, och läsaren hänvisas till djupgående granskningar av dessa tekniker15,16. Kortfattat förlitar sig dragkraftsmikroskopi och mikropelarmatrisdetektering på deformationen av ett underliggande substrat för att härleda nanonewton (nN) -krafter, en storleksordning mer än enskilda receptorkrafter17,18. Enmolekyltekniker, inklusive AFM och optisk pincett, är känsliga för enstaka protein piconewton (pN) krafter men mäter bara en receptor i taget och erbjuder inte bra (eller någon) rumslig upplösning. DNA-baserade molekylära spänningssonder och TGT-sonder (spänningsmätare) erbjuder pN-kraftupplösning med diffraktionsbegränsad (eller bättre) rumslig upplösning, vilket ger dem en unik roll i att studera encellskrafter19,20 från olika celltyper, inklusive fibroblaster, cancerceller, blodplättar och immunceller 21,22,23,24 . Medan molekylära spänningssonder har ett utdragbart "fjäder" -element, idealiskt för realtidsavbildning, brister TGT-sonder irreversibelt och lämnar efter sig en fluorescerande "krafthistoria". TGT modulerar dessutom spänningströskeln för det underliggande substratet; en serie sonder med liknande kemiska sammansättningar men olika brottkrafter, eller spänningstoleranser (Ttol), kan användas för att kvantifiera den minsta spänning som krävs för fokal vidhäftningsbildning och cellspridning. TGT-sonder består av två komplementära DNA-strängar, en förankrad på ytan och den andra presenterar en ligand till cellen. Om en receptor binder liganden och utövar en kraft som är större än sondensT-tol, kommer strängarna att separeras. Ttol definieras som den konstanta kraft som behövs för att bryta 50% av sonderna i ett 2 s intervall under ideala förhållanden. I "påslagna" TGT-sonder kan en släckare på den övre strängen separeras från en fluorofor på bottensträngen. Endast där TGT-sonden har spruckit, förmodligen av krafter som är större än eller lika med Ttol, kommer en fluorescerande signal att genereras. TGT-sonder kan också fixas, vilket möjliggör enkel manipulation av biologiska system och testning av flera förhållanden. Av dessa skäl användes TGT-sonder i detta arbete.
TGT-sonder användes för att studera hur integrinberoende celladhesion och mekaniska krafter moduleras av aktiverad EGFR21. Detta arbete etablerade EGFR som en "mekano-organisatör", som ställde in fokal vidhäftningsorganisation och spänningsgenerering. Dessutom visade det sig att EGF-stimulering påverkade fördelningen och mognaden av fokala vidhäftningar och förbättrad cellspridning. Detta tillvägagångssätt kan användas i framtida studier för att undersöka hur tillväxtfaktorer påverkar mekaniska krafter i tumörprogression och dynamik. Medan rollen som EGFR-integrin-överhörning för att reglera epitelial till mesenkymal övergång är etablerad, är mekaniska krafters roll i denna process fortfarande underutforskad10.
Här presenteras ett detaljerat protokoll för dessa experiment som täcker syntes och montering av 56 pN TGT-sonder, generering av TGT-ytor på glasöverdrag, applicering av Cos-7-celler på TGT-ytan och stimulering med EGF, fixering och färgning av celler med falloidin och en anti-paxillin-antikropp, högupplöst total intern reflektionsfluorescens (TIRF) och reflektionsinterferenskontrastmikroskopi (RICM) -avbildning, och bildkvantifiering. Detta protokoll, även om det är skrivet för att undersöka EGF-stimulering av Cos-7-celler, är lätt anpassningsbart för många TGT-baserade experiment. Olika ligander,T-tol, celltyper, stimuleringsparametrar, proteiner märkta efter fixering och kvantitativ analys kan enkelt ersättas, vilket gör detta protokoll robust och allmänt användbart.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>440140</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>Maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38S</td>
			<td>Diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8878S</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A687</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Paxillin antibody [Y113]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Gel P-2</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cos-7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>Cell Culture, Passage numbers 11-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid</td>
			<td>Vivitide</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PHR1553</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10013C</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor human EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22032601</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-438-026</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurobrite DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21244</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-210-064</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-161</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16050130</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88902</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Gas Cylinder</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips - 25 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Laboratory Film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Surface Preparation/Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-070-063</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Low Form Griffin Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540G</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-310</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21335</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300-500</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEAA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0322726</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>471283</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28901</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1296293</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>85111</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, DNA Grade, DNASE, Protease free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>653950-702</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-813</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>pe Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM Cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA v-nIR Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 75D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13710</td>
			<td>Surface Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td>Quantitative Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph Pad Prism</td>
			<td>Graph Pad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo name</td>
			<td>5&#39;modification/ 3&#39; modification</td>
			<td>Sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyne-21-BHQ2</td>
			<td>5&#39; Hexynyl/ 3&#39; BHQ_2</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCG</td>
			<td>Top strand TGT probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>56 pN TGT</td>
			<td>5&#39; Biosg/TTTTTT/iUniAmM</td>
			<td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td>
			<td>Bottom strand TGT probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 pN TGT</td>
			<td>5&#39; AmMC6/ 3&#39; BioTEG</td>
			<td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td>
			<td>Bottom strand TGT probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tension gauge tether probes for quantifying growth factor mediated integrin mechanics and adhesion

Flercelliga organismer förlitar sig på interaktioner mellan membranreceptorer och kognatligander i den omgivande extracellulära matrisen (ECM) för att orkestrera flera funktioner, inklusive vidhäftning, proliferation, migration och differentiering. Mekaniska krafter kan överföras från cellen via vidhäftningsreceptorn integrin till ligander i ECM. Mängden och den rumsliga organisationen av dessa cellgenererade krafter kan moduleras av tillväxtfaktorreceptorer, inklusive epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR). De verktyg som för närvarande finns tillgängliga för att kvantifiera överhörningsmedierade förändringar i cellmekanik och relatera dem till fokala vidhäftningar, cellulär morfologi och signalering är begränsade. DNA-baserade molekylära kraftsensorer som kallas spänningsmätare (TGT) har använts för att kvantifiera dessa förändringar. TGT-sonder är unika i sin förmåga att både modulera den underliggande krafttröskeln och rapportera receptorkrafter i piconewtonskala över hela den vidhäftande cellytan med diffraktionsbegränsad rumslig upplösning. TGT-sonderna som används här förlitar sig på den irreversibla dissociationen av en DNA-duplex av receptor-ligandkrafter som genererar en fluorescerande signal. Detta möjliggör kvantifiering av cellens kumulativa integrinspänning (krafthistoria). Den här artikeln beskriver ett protokoll som använder TGT för att studera effekten av EGFR på integrinmekanik och vidhäftningsbildning. Monteringen av den mekaniska avkänningsplattformen TGT är systematiskt detaljerad och proceduren för bildkrafter, fokal vidhäftningar och cellspridning beskrivs. Sammantaget gör förmågan att modulera sondens underliggande krafttröskel, vidhäftningsliganden och typen och koncentrationen av tillväxtfaktorn som används för stimulering detta till en robust plattform för att studera samspelet mellan olika membranreceptorer vid reglering av integrinmedierade krafter.

Påslagna TGT-sonder användes för att undersöka effekten av ligandaktiverad epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) på integrinmedierad cellmekanik och vidhäftningsbildning i Cos-7-celler21. Sonderna presenterar ligandcyklisk Arg-Gly-Asp-Phe-Lys (cRGDfK)21,23,25,26, som är selektiv för integrin heterodimeren αVβ3 med endast en liten affinitet för α5β1-integriner 27,28,29,30. TGT-sonden består av ett duplex-DNA som funktionaliserats på en glasöverdragsyta via bottensträngen med hjälp av biotin-streptavidinbindning. Den övre strängen visar integrinliganden och är tillgänglig för att binda till den kognata integrinreceptorn på cellmembranet (figur 5A). Den nedre strängen är märkt med en fluorofor och den övre strängen med en släckare, vilket leder till minimal bakgrundsfluorescens när duplex TGT är intakt. Om ett integrin binder liganden och applicerar en kraft med en storlek som är större än sondensT-tol, kommer DNA-duplexen att separera vilket leder till fluorescens (figur 5A). Varje TGT-sond som inte har brutits av en mekanisk kraft kommer att förbli icke-fluorescerande. Denna kraftselektiva påslagningsfluorescens möjliggör systematisk och kvantitativ kartläggning av pN-skala integringenererade krafter vid diffraktionsbegränsad upplösning. TGT-sonder modulerar dessutom substratets spänningströskel.
Här visas ett representativt exempel på en TGT-yta med enT-tol på 56 pN. Cos-7-celler pläterades på denna TGT-yta med eller utan EGF-stimulering för att studera effekten av EGFR-aktivering med ligandstimulering på celladhesion och integrinmekanik (figur 5A,B). Cellerna inkuberades med eller utan EGF på TGT-ytorna i 60 minuter, fixerades och immunfärgades för att visa fokal vidhäftningsfördelning (paxillin) och organisationen av cytoskeletten (F-aktin) (figur 5B). Cellerna avbildades sedan med ricm- och tirf-mikroskopi. Som tydligt framgår av RICM-bilden förbättrades Cos-7-cellspridningen på 56 pN TGT-ytan signifikant med EGF-stimulering jämfört med utan stimulering. Detta kvantifierades för 50 celler i varje tillstånd genom att mäta storleken på kontaktregionen cell-substrat från RICM-bilden (figur 5C). Stimulering med EGF resulterade i en mer cirkulär morfologi, representativ för Cos-7-celler som sprider sig och växer i sin naturliga fysiologiska miljö (Figur 5D). Fluorescensen från öppna sonder är också högre med EGF-stimulering som observerats i spänningsfluorescensbilden. Den integrerade intensiteten hos öppna sonder, som är proportionell mot antalet öppna sonder, var mycket högre med EGF-stimulering jämfört med utan (figur 5B,E). Detta är en representation av alla receptor-ligand engagemang där integriner applicerade en kraft större än Ttol (56 pN).
Färgning med paxillin visade att fördelningen, antalet, mognaden (storleken) och organisationen av fokala vidhäftningar också påverkades av EGF-stimulering. Fokala vidhäftningar i EGF-stimulerade celler verkade mer mogna och radiellt orienterade jämfört med inga EGF-kontroller. F-aktin cytoskelettorganisationen förbättrades också med EGF-stimulering, enligt bedömning av falloidinfärgningen (figur 5B). Dessa kvalitativa bedömningar gjordes genom visuell jämförelse av bilder från båda behandlingsgrupperna. Kvantitativ analys av fokal vidhäftning kan göras men ligger utanför detta protokolls räckvidd. I detta experiment gav TGT-ytan en plattform för att systematiskt beskriva effekten av EGFR-aktivering på cellspridning, integrinmekanik och fokal vidhäftningsbildning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig01.jpg"> Bild 1: Schematisk för dag 1 i TGT-ytförberedelserna. (B) Etsa täckglasytan. (C) Neutralisera Piranha-lösningen. (D) Silanisera ytan för att göra reaktiva amingrupper. (E) Balansera täckglasen till den organiska fasen. (F) Torka täckglasen med en inert gas. (G) Biotinylera ytamingrupperna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig02.jpg"> Figur 2: Schematisk för dag 2 i TGT-ytbehandlingen. B) Passivera med BSA för att förhindra icke-specifik bindning av reagens i efterföljande steg. (C) Funktionalisera täckglasen med streptavidin. (D) Hybridisera sonderna i en termocykler. (E) Applicera de syntetiserade sonderna på täckglasen (F) Montera täckglaset i cellavbildningskammaren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig03.jpg"> Figur 3: Allmänt arbetsflöde som belyser de breda stegen över hela experimentkonfigurationen. (B) Flödesschema över de steg som är involverade i fixering och immunofärgning efter fastsättning och spridning på TGT-ytan. (C) Efter färgning avbildas celler på ett inverterat fluorescensmikroskop med RICM- och TIRF-mikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig04.jpg"> Figur 4: Exempel på databehandling och kvantitativ analys(A) Steg-för-steg-uppdelning av analyspipelinen som används i Fiji (ImageJ) för RICM och kvantifiering av spänningsbilder. (B) Ett representativt exempel för cellmorfometriska resultat analyserade med hjälp av ovanstående pipeline. (C) Representativa exempel för cellmekaniska resultat analyserade med hjälp av ovan nämnda pipeline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig05.jpg"> Figur 5: Exempeldata från ett TGT-experiment. Infällda projekt integriner interagerar med dess kognata ligand cRGDfK med (höger) eller utan (vänster) EGF-stimulering. (B) RICM- och TIRF-bilder av Cos-7-celler spridda på 56 pN TGT-ytan. Bilderna erhålls 60 min efterplätering med eller utan EGF-stimulering. Individuella RICM -bilder (som förvärvats), integrinspänning (gråskala), paxillin (orange het) och F-aktin (blågrön) visas med överlägg för båda stimuleringsförhållandena. Skala Bar: 10 μm. Insatsen belyser en inzoomad ROI (region av intresse) som beskriver samlokaliseringen av den genererade integrinspänningen vid platser för vidhäftningsbildning markerad av paxillin och den underliggande subcellulära cytoskelettorganisationen markerad med aktin. Skala Bar: 5 μm. (C-E) Spridningsdiagram för spridningsområdet (RICM-cellavtryck) (C), cirkularitet (D) och integrerad spänning (E) för Cos-7-celler med eller utan EGF-stimulering. Staplar anger medelvärdet ± s.d. Skillnader mellan grupperna bedömdes statistiskt med Students t-test; P < 0,0001. n = 50 celler över tre oberoende experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig06.jpg"> Bild 6: Exempel på TGT-ytor med olika möjliga problem. (A) Spännings- och RICM-bilder av en idealisk TGT-yta med monterad sond som släckts före celladhesion. (B) Spännings- och RICM-bilder av en TGT-yta där TGT-sonden saknar den övre strängen (släckaren). Spänningsbild visar enhetlig fluorescens från öppen fluorofor i bottensträngen. (C) Spännings- och RICM-bilder för celler spridda på en idealisk TGT-yta. (D) Spännings- och RICM-bilder för celler spridda på en dåligt gjord TGT-yta med begränsad passivering eller försämrad sond. (E) Spännings-, RICM- och ljusfältsbilder för celler pläterade på en idealisk yta med cRGDfK-ligand som indikerar att cRGDfK-integrininteraktioner är avgörande för cellfästning och spänningsgenerering. (F) Spännings-, RICM- och ljusfältsbilder för celler pläterade på en yta utan cRGDfK-ligand på TGT. Medan cellerna är synliga i ljusfältbilden observeras ingen cellfästning eller genererad integrinspänning. Skala Bar: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion at JoVE.com

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

TGT-ytan är en innovativ plattform för att studera tillväxtfaktor-integrin-överhörning. Den flexibla sonddesignen, vidhäftningsligandens specificitet och exakt modulering av stimuleringsförhållanden möjliggör robusta kvantitativa bedömningar av EGFR-integrin-samspel. Resultaten lyfter fram EGFR som en "mekano-organisatör" som ställer in integrinmekanik, vilket påverkar fokal vidhäftningsenhet och cellspridning.

Spänningsmätare Tether Probes för kvantifiering av tillväxtfaktormedierad integrinmekanik och vidhäftning

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

Detta protokoll är viktigt på grund av enkelheten hos TGT-sensorplattformen som används för att studera EGFR-integrin-överhörning och dess inflytande på cellens mekaniska krafter. Rao skisserade för att undersöka EGF-beroende reglering av cellmekanik. Protokollet är anpassningsbart för olika ligander, celltyper, stimuleringsparadigmer och kan kombineras med TGT med varierande spänningströsklar.Ytsyntes kan verka skrämmande till en början. Nyckeln är att vara förberedd och organiserad för att exakt utföra de invecklade stegen genom att använda en checklista för reagensberedning och beräkningar. På dag ett, placera upp till åtta 25-millimeter glasskydd glider in i ett polytetrafluoretylenställ.Placera stället i en 50-milliliter borosilikatbägare innehållande 40 ml 200-säker etanol. Ultraljudsbehandling vid en driftsfrekvens på 35 kilohertz i 10 till 15 minuter vid rumstemperatur. Fyll en 50-ml bägare med 40 ml piranha-lösning som nyligen framställts genom att blanda svavelsyra och väteperoxid i ett förhållande 3: 1 i en Pyrex-bägare och rör om med en glaspipett.Överför täckslipstället till bägaren och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur i dragskåpet för att etsa lockets glidyta. Efter etsning, överför täckstället till en bägare med ultrarent vatten med pincett. Inspektera täckslipsarna visuellt för att säkerställa att ytorna ser rena ut utan mönster eller dammpartiklar på glasytan.Överför täckstället till en bägare med 200-säker etanol och tvätta två gånger i 15 sekunder för att balansera ytor till organiskt lösningsmedel. Överför täckslipstället till 200-säker etanollösning med 3% APTES i en timme vid rumstemperatur för att silanisera täcksliparna. Sänk ner racket i en ren bägare med 200-säker etanollösning.Torka locket glider med kvävgas med lågt utgångstryck. Placera locket i en 10 centimeter polystyrenskål med en bit parrafinfilm som ligger platt inuti den. Tillsätt 100 mikroliter av två milligram per milliliter NHS-biotinlösning i DMSO till fyra täckslips placerade på paraffinfilm.Ställ en smörgås med de andra fyra täcksliporna ovanpå, med två täckslips vända mot varandra med funktionaliseringslösningen däremellan. På dag två, ta bort skålen från fyra grader Celsius och separera de inklämda täcksliporna. Undvik att repa eller skada den funktionaliserade ytan medan du separerar smörgåsen.Orientera sedan locket glider i stället med den belagda ytan vänd mot varandra. Torka med kvävgas. Placera täcksliporna i en ny skål med en parrafinfilm inuti den.Tillsätt 800 mikroliter 0,1% bovint serumalbumin i 1X PBS till varje täckblad. Inkubera täckglidningarna vid rumstemperatur i 30 minuter för att passivera ytan och blockera ospecifik bindning av efterföljande funktionaliseringsreagenser. För att funktionalisera täckglidningarna, tillsätt 800 mikroliter med ett mikrogram per milliliter streptavidin i 1X PBS vid rumstemperatur i 45 till 60 minuter.Montera TGT-sonderna i ett PCR-rör med en termocykling. Efter inkubation, tvätta locket glider tre gånger med 1X PBS. Lägg till 100 mikroliter av de förmonterade TGT-sonderna till fyra täckslips och gör smörgåsar med de återstående fyra täcksliparna med den funktionaliserade sidan vänd mot sonderna.Täck med aluminiumfolie. Efter inkubation, separera smörgåsarna och tvätta täckslipsarna med 1X PBS tre gånger. Montera försiktigt täcksliporna i förrenade bildkammare.För att undersöka effekten av epidermal tillväxtfaktorstimulering på Cos-7-mekanik, vidhäftning och cellspridning, trypsinisera Cos-7-celler med 0,05% trypsin-EDTA i två minuter. Neutralisera trypsinet genom att tvätta med HBSS och centrifugera vid 800 G i fem minuter. Plattceller med en densitet av 40 000 celler på de monterade TGT-ytorna i DMEM kompletterat med 50 nanogram per milliliter EGF eller DMEM utan EGF.Tvätta cellerna tre gånger med 1X PBS efter inkubation. Fixa med två milliliter 4% paraformaldehyd i 12 minuter vid rumstemperatur. Tvätta täckglidningarna fem gånger med 1X PBS med fem minuters mellanrum vid rumstemperatur.Eventuellt kan du inkubera täckslipsarna med 50 millimolär ammoniumklorid i 1X PBS i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Lägg till buffert A och placera bildkamrarna med täckglidningar i en fuktbehållare. Inkubera i 30 minuter vid 37 grader Celsius för att blockera och permeabilisera cellerna.Späd den primära anti-paxillinantikroppen vid 1:250 utspädningar i blockerande buffert. Inkubera med 200 mikroliter primär antikroppslösning per täckglidning i två timmar vid 37 grader Celsius. Märk celler samtidigt med en blandning av dikonjugerad sekundär antikropp av get/kanin vid spädning 1:800 och dikonjugerat falloidin vid 1:400 utspädningar i 200 mikroliter blockerande buffert per täckglidning.Tvätta ytorna fem gånger med 1X PBS med fem minuters mellanrum. För att börja, tillsätt olja till målet, rengör täckglidbotten i provkammaren och placera provet på scenen. Fokusera på en cell och engagera det perfekta fokuset.Rikta in RICM genom att stänga och centrera epi-illumination-bländarens membran. Fokusera 488-nanometerlasern till en liten plats i taket på rummet och öka infallsvinkeln tills den passerar den kritiska vinkeln, samtidigt som du övervakar fluorescensen på kameran i ett live-läge. Observera en kraftig minskning av bakgrundsfluorescensen och ett enda fokusplan när den kritiska vinkeln överträffas.Identifiera celler för avbildning med kamerans live-läge med RICM. Skaffa RICM- och TIRF-bilder av aktin vid 488-nanometer excitation, integrinspänning vid 561-nanometer excitation och paxillin vid 647-nanometer excitation. Hämta bilder sekventiellt med en exponeringstid på 200 millisekunder.Byt omslagsglidningar, fokus och upprepa. Cos-7-celler pläterades på denna TGT-yta med eller utan EGF-stimulering för att studera effekten av EGFR-aktivering med ligandstimulering på integrinmekanik. Om ett integrin binder liganden och applicerar en kraft som är större än sondens spänningströskelsumma, kommer DNA-duplexen att separeras, vilket leder till fluorescens.Varje TGT-sond som en mekanisk kraft inte har brutit kommer att förbli icke-fluorescerande. Cellerna inkuberades med eller utan EGF på TGT-ytorna i 60 minuter, fixerades och immunstifierades för att visa fokal vidhäftningsfördelning och organisationen av cytoskeletten. I RICM-bilden förbättrades Cos-7-cellspridningen på 56-piconewton TGT-ytan signifikant med EGF-stimulering jämfört med utan stimulering.Stimulering med EGF resulterade i en mer cirkulär morfologi, som representerar Cos-7-cellspridning och växande. Fluorescensen från öppna sonder är också högre med EGF-stimulering, vilket observerats i spänningsfluorescensbilden. Den integrerade intensiteten hos öppna sonder som var proportionell mot antalet öppna sonder var mycket högre med EGF-stimulering än utan stimulering.Kom alltid ihåg orienteringen av täckglidningarna och håll den funktionaliserade ytan uppåt. När du separerar smörgåsen, var försiktig så att ytan inte repas eller skadas. Efter ytsyntes kan man sondera för cytoplasmatiska proteiner som reglerar celladhesion eller mekanisk transduktion.Detta möjliggör identifiering av nedströms signalmolekyler som är involverade i orkestrering av cellmekanik vid plasmamembranet.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Analys för vidhäftningsförmåga och agar Invasion i S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

Growth Factor-Coated Bead Placering på ryggfenan framhjärnan explants

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Placering Growth Factor-Coated Pärlor på tidiga embryon Stage Kyckling

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Förbereda T Factor Cell Tillväxt från Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

En magnetisk Tether System för att undersöka Visuell och olfaktorisk Medierad Flight Control i Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Modifierad jäst-Two-Hybrid System för att identifiera proteiner Interagera med Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robust 3D DNA FISK Använda Direkt märkta prober

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematisk analys av celldelning och Expansion: kvantifiera Cellular grundval av tillväxt och provtagning Develop zoner i<em&gt; Zea mays</em&gt; blad

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analysera cellytan Adhesion Remodeling som svar på mekaniska spänningar med användning av magnetiska pärlor

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Signaling

Molekylär analys av Endothelial-mesenkymala övergången induceras av Transforming Growth Factor-β signalering

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...