Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
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作者感谢维也纳工业大学生物技术和微生物学系和维也纳医科大学肾脏病学和透析学系第三医学系的Christian Derntl博士，特别是Markus Wahrmann博士的技术和科学支持。哺乳动物细胞中的蛋白质表达得到了维也纳自然资源与生命科学大学（BOKU）生物技术系的支持。作者希望对来自德国杜塞尔多夫XanTec生物分析的Nico Dankbar博士表示深深的感谢，感谢他对进行SPR结合测定的有益科学讨论。

在本研究中，CVN小泛素样修饰剂（SUMO）融合蛋白已用于酶联免疫吸附测定而不是CV-N，适用于基于细胞的测定。根据标准方案12，商业获得重组全长甲型流感病毒HA H3蛋白（见材料表）或在哺乳动物HEK293细胞系和杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。武汉-1刺突蛋白在哺乳动物HEK293细胞中表达。单甘露糖基化肽（MM）和二甘露糖基化肽（DM）的合成允许检测CVN2和单甘露糖基?...

CV-N的结合亲和力与功能结合位点的数量相关[当工程为结构域交换二聚体时，结构域B上为2H，结构域A为2L]。在大肠杆菌中表达具有改变的结合亲和力的变体（CVN2L0-V2，CV-N的同源二聚体稳定折叠，包括二硫键敲除），纯化，并使用SPR10对HA蛋白（H3N2）结合进行阳性测试，并且在HA与H或L碳水化合物结合位点和KD1 = 49 nM和KD2 = 8μM38时显示出构象...

Tetherin相关的抗病毒活性由干扰素-α诱导，它包含基于蛋白质的Tether，导致完全形成的病毒粒子保留在感染的细胞表面1。Tetherin糖基化在抑制病毒释放方面的必要性仍然不确定，这意味着糖基化模式对重组表达聚糖的重要性对于体外研究1，2，这取决于（在流感病毒的情况下）表面表达的流感血凝素HA3，4的构象.已经注意到，与N-连接糖基化相关的寡糖的修饰足以限制HIV-1型释放2，而二聚化在防止病毒释放中起着至关重要的作用，因此涉及跨膜结构域或糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚，用于拴系出芽病毒粒子5.描述了人和鼠系留蛋白的独特功能，以阻断多种包膜病毒、逆转录病毒和丝状病毒。BST-2/tetherin是一种先天免疫1，6的干扰素诱导抗病毒蛋白，具有广谱抗病毒活性，并被包膜糖蛋白5拮抗以易位系留蛋白或破坏Tetherin6的结构。例如，表面表达的包膜糖蛋白HA和神经氨酸酶对甲型流感病毒的拮抗作用是众所周知的，以菌株特异性方式7，促进宿主受体结合位点8的识别。在与HA上快速定制的聚糖屏蔽相互作用的化学计量学中研究聚糖靶向抗体，从而与甲型H3N2和H1N1亚型4结合亲和力。
为了阐明抗病毒药物与病毒包膜尖峰（即碳水化合物配体）之间的结合机制，以及互补的免疫学和光谱学方法，对单甘露糖、二甘露糖和三甘露糖部分进行了化学合成。甘露糖基化肽是通过糖基{β}-过乙酸酯的叠氮基化为1，2-反式糖基叠氮化物转化9而创建的，模仿了在危及生命的病毒表面上通常发现的N-乙酰氨基葡萄糖和高甘露糖低聚糖。三唑生物等排体用于模拟形成 HA 肽10 甘露糖基化残基的键，并促进与 HA 头结构域上第二个 N 连接糖基化点周围的抗病毒 CV-N 衍生物的位点特异性相互作用（HA 顶部有 4 个 N-连接聚糖 N54、N97、N181、N301）8，11，12.谷氨酸（Glu）和精氨酸（Arg）之间的相互作用以及由此产生的螺旋偶极子表现出模型肽和蛋白质的良好稳定性，但使用SPR可视化。如果与通过直接抑制聚糖部分上的受体结合来识别HA10上的单个化学合成糖基化位点相比，则显示四位点突变Fc结构与其受体的更高亲和力可在体内引发效应功能，揭示连接到Fc突变体的N-连接聚糖的不相关组成有待机械确定13。
CV-N 显示出针对 HIV 14，15、流感 16 和埃博拉病毒的抗病毒活性，这是通过纳摩尔结合包膜刺突蛋白12，17，18，19 上的高甘露糖寡糖修饰介导的。确定流感HA与CV-N中的一个高亲和力碳水化合物结合位点（H）或共价连接的二聚体CVN2中的两个Hs结合分别具有平衡解离常数（K D）= 5.7 nM（图1A）和KD = 2.7 nM。CV-N和CVN2都含有另外一个或两个低亲和力碳水化合物结合位点（L）s12，17，20，21。埃博拉GP1，2与CVN2的2H结合，亲和力在较低的纳摩尔范围（KD = 26 nM）。与埃博拉GP1，2和HA结合的CV-N WT表现出从K D = 34 nM到KD = 5.7 nM的亲和力（A/New York/55/04）12。凝集素，如CV-N，专门针对病毒包膜上的高甘露糖聚糖，进一步抑制丙型肝炎病毒、SARS-CoV、疱疹病毒、马尔堡病毒和麻疹病毒22的复制。
CV-N小分子已经彻底研究了20多年，因为它的功能可以结合多种病毒以抑制病毒进入16，18。结构分析和结合亲和力测定表明，通过微摩尔范围内的二价结合，在结构域交换的CVN2二聚体中交联两个L，以增强对病毒包膜糖蛋白10，19的亲和力。Manα1-2Manα在Man（8）D1D3臂上的选择性结合，Man（9）包括位于相反蛋白质原型体20上的两个具有不同亲和力的结合位点，从而达到纳摩尔结合亲和力（图1B）。因此，CVN2被认为是一种假抗体，因为它在HIV gp120上结合表位的应用，类似于病毒中和抗体17。在本文中，作者有兴趣研究CVN2通过其受体结合域（RBD） 与 SARS-CoV-2尖峰的潜在结合。固定化人血管紧张素转换酶 （ACE）-2 与 SARS-CoV-2 RBD 的结合曲线导致这种生物学相关的结合相互作用的 KD = 4.7 nM23。
相比之下，选定的免疫球蛋白类别可识别特定且一致的结构蛋白模式，这些模式为膜锚定的HA区域赋予亲和力成熟的底物24。CV-N在几乎所有甲型和乙型流感病毒中都显示出高效的活性16，它是一种广泛的中和抗病毒剂。我们对HA1和HA2茎上靶向表位位置的了解不完整，这些表位可能涉及通过高度中和抗体靶向聚糖的表位结构，并与凝集素结合25相比。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> 图 1：CV-N 与病毒包膜尖峰的 SPR 结合测定示意图。 （A）用于CV-N与配体结合的SPR测定：HA全长蛋白（90kDa）。动力学数据集（5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、0 nM）显示与甲型流感HA/纽约/55/04（H3N2）的实时双重参照结合。（B）CVN2L0变体V2与固定配体DM结合，浓度范围为500nM至16μM。 序：L残基以黄色突出显示。H 残基以灰色突出显示。E58和R73是野生型蛋白中半胱氨酸的替代品，使V2成为稳定的蛋白质折叠，具有三个而不是四个二硫键 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的大图。</a>
虽然膜-远端 HA 顶部的聚糖屏蔽诱导与 CV-N 12 的高亲和力结合，但在其低亲和力位点10，12 进一步观察到CVN2 与 HA 顶部二硫键相邻的 HA 结合。通过CV-N在碳水化合物结合中鉴定各种极性相互作用和相互作用位点。通过在结合位点生成敲除变体来验证这些相互作用，以将结合亲和力与计算机预测的糖基化相关联12。因此，该项目旨在比较先前测试的化学甘露糖基化HA肽与SARS相关2019-nCoV尖峰和SARS-CoV-2的短肽序列的结合亲和力和特异性，这些短肽序列由少量不同的N-连接糖基化位点和O-连接糖基化修饰。使用冷冻电子显微镜和结合测定，Pinto及其同事报告了一种单克隆抗体S309，该抗体可能识别SARS-CoV-2刺突蛋白上的表位，该表位含有沙贝病毒亚属内的保守聚糖，而不会与受体附着竞争26。本研究的方案描述了设计、表达和表征 CV-N 变体对于使用 SPR 技术研究 CV-N 和 CVN2 如何与糖基化蛋白质和合成甘露糖基化肽结合的重要性10，12.
串联连接的二聚体CVN2L027和结合位点变体（V2-V5）重组表达，变体具有二硫键替代物（C58E和C73R）（图2A）。此外，制备具有单点突变E41A的突变体，因为该位置已被视为分子间交叉接触残基。这种突变体是另一种有趣的分子，用于凝集素和高甘露糖寡糖之间的SPR结合测量，破译结合结构域，并允许与二聚体形式进行比较。CVN2的结构域交换晶体结构显示出一个灵活的接头，其延伸在49到54个残基之间。这两个结构域可以作为刚体继续围绕铰链移动，通过分子内结构域相互作用（结构域A-残基1-39;90-101-与结构域B-残基40-89）或通过分子间结构域交换产生二聚体[域A（第一个单体）与结构域B（第二个），以及域B（第一个单体）与结构域A（第二个拷贝）]。除了Glu4128之外，两个原型的A和B结构域之间没有密切的相互作用。CV-N的基因可以使用重复PCR方法与40-mer合成的寡核苷酸29进行开发，然后亚克隆到pET11a的NdeI和BamHI位点中，以转化为（电穿孔）为电感受态细胞，如Keeffe，J.R.27所述。该蛋白质用于实现各自的晶体结构（PDB ID 3S3Y），包括一个N-末端6-组氨酸纯化标签，后跟一个因子Xa蛋白酶切割位点。定点诱变用于进行点突变、切换密码子以及插入或删除单个或多个碱基或密码子以进行氨基酸交换。这些转化为蛋白质功能和结构提供了宝贵的见解。重组表达和纯化的CV-N、CVN2和CVN3已经过生物物理研究20，21，27，生产成本低廉，因此用于表征固定在SPR传感器芯片上的聚糖的结合测定。传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）在聚糖配体的固定化技术方面提供了较低的重现性，并将各种结合位点变体的实时结合（如SPR所示）转化为终点测定。
结合亲和变体CVN2L0-V2（具有二硫键取代10的同源二聚体CV-N的完整折叠）在大肠杆菌（大肠杆菌）中用His标签表达，在Ni-NTA 柱上应用亲和色谱纯化，并使用SPR测试与HA（H3N2），单甘露糖基化HA肽和二甘露糖基化HA肽的结合。 化学甘露糖基化肽或HA和S蛋白都是配体和胺偶联到亲水芯片表面通过反应性酯或生物素-链霉亲和素蛋白工程。将相同的顺序运行程序应用于这些配体，注入CV-N的各种稀释液和CV-N（和CVN2）的变体，以获得分子相互作用分析的动力学信息，如下所述30。RBD固定化SPR传感器芯片用于CV-N与S肽的结合研究，并将亲和力与SARS-CoV-2与人ACE2的结合进行比较。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

表面等离子体共振（SPR）用于测量血凝素（HA）与结构域交换的氰基蛋白-N（CV-N）二聚体的结合，并监测甘露糖基化肽与CV-N高亲和力结合位点之间的相互作用。据报道，病毒包膜加标 gp120、HA 和埃博拉糖蛋白 （GP） 1，2 可结合二聚体 CVN2 上的高亲和力和低亲和力结合位点。二甘露糖基化的HA肽也在两个低亲和力结合位点与CVN2的工程分子结合，CVN2具有相应配体的高亲和力位点并发生突变以取代碳水化合物结合口袋中的稳定二硫键，从而确认多价结合。HA与假抗体CVN2的一个高亲和力结合位点显示，解离常数（KD）为275 nM，通过寡聚化进一步中和人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）。将结构域交换的CVN2中的二硫键数量从4个减少到2个，通过将胱氨酸取代为谷氨酸和精氨酸的极性残基对，导致与HA的结合亲和力降低。在最强的相互作用中，埃博拉GP1，2与CVN2结合，使用没有跨膜结构域的包膜聚糖在较低的纳摩尔范围内具有两个高亲和力结合位点。在本研究中，多特异性单体CV-N与严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）糖蛋白的结合在K D = 18.6μM处测量，与纳摩尔KD与其他病毒尖峰相比，并通过其在中摩尔范围内的受体结合域在μ中摩尔范围内。

在三个独立的SPR实验中测试二聚结构域交换的CVN2L0分子是否与HA顶部区域结合，并以KD值表示结合亲和力。假设结构域B包含H结合位点，其通过取代二硫键进入离子残基而受到影响，并且结构域A形成L10，18。首先测试CVN2L0和变体V2（三个二硫键）和V5（两个二硫键）的单次进样是否与HA耦合传感器芯片结合，以估计结合能力，然后再使用自动进样器...

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Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

本协议描述了用于SPR结合测定的新工具，以检查CV-N与HA，S糖蛋白，相关杂交型聚糖和高甘露糖寡糖的结合。SPR用于测定将二聚体或单体CV-N与这些聚糖结合的KD 。

通过表面等离子体共振 设计 抗病毒药物

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

已经建立了表面等离子体共振光谱，用于以中等通量方式测定蛋白质配体。提出了对同一分子结合位点变体的不同亲和力，即铁结合高方式低聚糖对病毒的亲和力。SPR是一种无标记技术，用于研究表面固定化受体的实时大分子结合。在动力学分析中，多位点相互作用通过竞争性结合进行识别，而与大小无关 使用SPR的研究的特定领域是药物开发，以寻找抑制剂或抗体表征。动力学常数和亲和力直接从传感器响应中计算出来。首先，在LB-琼脂平板上转移100微升溶液，并使用无菌细胞扩散器轻轻涂抹。使用多种浓度的双链DNA模板开始一系列样品反应，范围从5到50纳克，同时保持引物浓度恒定。然后在矿物油覆盖层下方添加DpnI限制性内切酶，并立即在37摄氏度下孵育一小时，以消化亲本超螺旋双链DNA。要解冻XL1-Blue超感受态细胞，请将细胞等分到预冷的小圆底管中。接下来，从每个对照和样品反应中转移一微升DpnI处理的单链DNA，以分离合成互补链的超感受态细胞的等分试样。小心旋转转化反应混合后，将反应在冰上孵育30分钟。在42摄氏度下对转化反应施加热脉冲45秒，然后将反应放在冰上两分钟。然后加入0.5毫升NZY+肉汤，在37摄氏度下孵育转化反应，以225至250RPM振荡一小时。之后，如前所述，将每个转化反应的正确体积铺在LB氨苄青霉素琼脂平板上。对于种子培养物，用转化板中的单个菌落接种少量含有LB的氨苄青霉素培养基。使用过夜培养物，用包括10毫摩尔氯化镁，10毫摩尔硫酸镁和20毫摩尔葡萄糖在内的添加剂接种表达培养物，将种子培养物稀释至100倍。接下来，在 37 摄氏度下剧烈摇动培养细胞至 0.4 至 0.6 之间的吸收剂 600 纳米，然后将细胞冷却至 20 摄氏度并用一毫摩尔 IPTG 诱导并生长过夜。然后通过在4摄氏度下以4， 000g离心15分钟来收获细胞，并丢弃上清液。将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水缓冲液中后，最近在4，000g下在4摄氏度下避难15分钟。然后用移液管弃去上清液。接下来，将剩余的沉淀重悬于10毫升裂解缓冲液中，并将悬浮液在37摄氏度下孵育一小时。然后在4摄氏度下以4， 000g离心15分钟来分离可溶性和不溶性级分。此外，在 14 毫升管中使用 HIS-Select Ni2+亲和凝胶，分别用 20 毫摩尔咪唑和 250 毫摩尔咪唑将其标记的重组表达的氰基蛋白-N 结合并重悬于缓冲溶液中。在这些步骤之间分批孵育至少 30 分钟。加入含有250毫摩尔咪唑的洗脱缓冲液以洗脱蛋白质。将蛋白质溶液转移到带有10千克道尔顿截止过滤器的离心管中，并通过在4，500g和4摄氏度下离心10分钟来浓缩它们。将SPR电泳缓冲液加入1至10的稀释因子，并在4，500g和4摄氏度下将4次离心至初始体积10分钟。然后，使用NanoDrop紫外可见分光光度计确定280纳米处的蛋白质浓度，该消光系数基于主要蛋白质CVN2L0的计算消光系数，显示大小为23， 474道尔顿。对于双通道SPR系统，使用HBSCP plus作为电泳缓冲液，pH 1.5至1.6的10毫摩尔甘氨酸盐酸作为再生缓冲液，并打开仪器脱气器，自动进样器和泵。然后用双蒸水清洗整个系统一小时。接下来，将浸油滴到探测器上，并安装涂有薄金膜的玻璃传感器芯片。而在上侧，用羧甲基葡聚糖水凝胶功能化后直接到三端口流通池下方的检测器上。然后通过下拉手柄来修复设置。要将蛋白质配体固定到传感器芯片上，请单击菜单栏中的“表格”打开运行表，然后在集成的SPP自动链接软件中运行表编辑器。然后从可用运行表列表中选择并单击基本固定，并按照计算机屏幕上的实验程序步骤进行操作。接下来，单击表单部分中的样品集编辑器，填写放置在自动进样器中的两个架子的试剂列表，以便进一步分析。单击菜单栏中的自动进样器直接控制作为工具，将样品架向前或带回原位，并选择 4 摄氏度作为工作温度。启动泵，通过单击工具和泵直接控制注入双蒸水。并通过单击SPR仪器直接控制来记录数据。每次，从新出现的窗口开始。将偶联试剂添加到 300 μL 小瓶中后，将它们放入自动进样器架中，然后单击 Run 启动运行表。对于简单的蛋白质 - 蛋白质相互作用，以每分钟25， 000微升的速度重新填充泵后，进行基线调整30秒。允许随后用双蒸水进行基线调整 1.5 分钟，然后用一摩尔乙醇胺盐酸盐（pH 8.5）淬灭活化的芯片表面。然后使用HBS-EP+将管子从液体采样器切换到脱气器，从双蒸水切换到瓶中，单击表单，向下滚动，然后单击此操作模式更改为后处理。然后单击“添加”（Add），为每个流通池选择数据平台中随时间推移生成的结合曲线，并将叠加层导出为洗涤器文件。接下来，单击“文件”以打开文件保存选项，并通过对齐左右曲线并从配体通道的信号中减去第二个参考通道的信号来获得响应曲线。首先测试CVN2L0和方差V2和V5的单次进样是否与血凝素偶联传感器芯片结合，以使用自动进样器和运行表编辑器估计结合能力。随着时间的推移，在系统中以纳摩尔和微摩尔范围内的各种浓度自动重复进样，证明芯片表面没有达到饱和度或平衡结合。假设 RBD S1 亚基上可能保守的碳水化合物具有较弱的亲和力，解离速率常数为 260 μmol，则绘制 CVN 野生型与 RBD 结合的浓度与反应的关系图。CVN2L0-V4与DM结合的相同亲和力图不再可分析，因为二硫化物键的替换干扰了与小糖基化肽的高亲和力结合，并产生高于响应最大值的响应。CVN在SARS-CoV-2上与RBD的野生型结合显示出与S蛋白和RBD的结合，解离狂暴常数分别为18.6微摩尔和260微摩尔。尽管分析物浓度的SPR响应导致CVN野生型和E41A结合的高响应单元和典型的SPR传感器图。然而，突变体在稀释时不稳定。SPR生物传感正在解决纯化蛋白质及其变体与配体的高亲和力和低亲和力结合问题。在我们的例子中，糖蛋白利用光学读数和传感器芯片表面上的双通道流动系统。酶作为免疫吸附测定是一种替代免疫学方法，可识别蛋白质表位，但也提供复杂基质中肽和小分子浓度的数据。通过SPR结合测定测试重组表达的蛋白质，结合确认变化的生物传感，这对于通过计算蛋白质侧验证和预测蛋白质稳定性很有用。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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科研

生物工程

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