Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Forfatteren anerkender Dr. Christian Derntl fra Institut for Bioteknologi og Mikrobiologi ved TU Wien og Institut for Medicin III, Division of Nephrology and Dialysis ved Medical University of Vienna, især Dr. Markus Wahrmann for teknisk og videnskabelig støtte. Proteinekspression i pattedyrceller blev støttet af Institut for Bioteknologi ved University of Natural Resources and Life Sciences (BOKU) Wien. Forfatteren ønsker at udtrykke sin dybe anerkendelse til Dr. Nico Dankbar fra XanTec bioanalytics i Düsseldorf, Tyskland, for nyttige videnskabelige diskussioner om udførelse af SPR-bindende assays.

Til denne undersøgelse er et CVN-lille ubiquitinlignende modifikator (SUMO) fusionsprotein blevet anvendt i enzymbundne immunosorbentassays i stedet for CV-N og er egnet til cellebaserede assays. Rekombinant influenza A-virus HA H3-protein i fuld længde opnås kommercielt (se Materialetabel) eller udtrykkes i pattedyrs HEK293-cellelinjer og baculovirusinficerede insektceller i henhold til standardprotokoller12. Wuhan-1 spike-protein udtrykkes i pattedyrs HEK293-celler. Syntesen ...

CV-N's bindingsaffinitet er korreleret med antallet af funktionelle bindingssteder [2H på domæner B og 2L på domæne(r) A, når de konstrueres som domænebyttet dimer]. En variant med en ændret bindingsaffinitet (CVN2L0-V2, en homodimerisk stabil fold af CV-N bestående af en disulfidbro-knock-out) udtrykkes i E. coli, renses og testes positivt for binding til HA-protein (H3N2) ved anvendelse af SPR10 og viser en konformationsændring ved binding af HA med enten H eller L kulhydratbin...

Tetherin-associeret antiviral aktivitet induceres af interferon-α, og det omfatter proteinbaserede tethers, der fører til tilbageholdelse af fuldt dannede virioner på inficerede celleoverflader1. Nødvendigheden af tetheringlycosylering ved hæmning af virusfrigivelse er fortsat usikker, hvilket indebærer betydningen af glykosyleringsmønstre på rekombinant udtrykte glycaner til in vitro-undersøgelser 1,2, hvilket afhænger af konformationen af (i tilfælde af influenzavirus) overfladeudtrykt influenzahæmagglutinin HA 3,4 . Det er blevet bemærket, at modifikation af oligosaccharid bundet til N-bundet glykosylering er tilstrækkelig til tetherinmedieret begrænsning af HIV type-1-frigivelse2, mens dimerisering spiller en væsentlig rolle i forebyggelsen af virusfrigivelse og derved involverer transmembrandomænet eller glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI) -anker til tøjring af de spirende virioner5 . Unikke funktioner er beskrevet for human og murine tetherin til at blokere flere indhyllede vira, retrovirus og filovirus. BST-2/tetherin er et interferoninducerbart antiviralt protein af den medfødte immunitet1,6, der virker med bredspektret antiviral aktivitet og modarbejdes af kuvertglycoproteiner5 for enten at translokere tetherin eller forstyrre strukturen af tetherin6. For eksempel er overfladeudtrykt kuvertglycoprotein HA og neuraminidase på influenza A-virus velkendte for tetherinantagonisme på en stammespecifik måde7, hvilket letter genkendelsen af værtsreceptorbindingssteder8. Glykanmålretningsantistoffer undersøges i støkiometrien af deres interaktioner med de hurtigt tilpassede glycanskærme på HA, hvilket resulterer i bindingsaffinitet til influenza A H3N2 og H1N1 undertype4.
For at belyse bindingsmekanismerne mellem antivirale midler og viruskuvertspidser, dvs. kulhydratligander og komplementære immunologiske og spektroskopiske metoder, syntetiseres mono-, di- og tri-mannose-dele kemisk. De mannosylerede peptider dannes via azidoglycosylering af glycosyl {beta}-peracetater til 1,2-transglycosylazider transformation9, der efterligner de typisk fundne N-acetylglucosamin og høj-mannose oligosaccharider på overfladen af livstruende vira. Triazolbioisosterer anvendes til at efterligne bindinger, der danner den mannosylerede rest af HA-peptid10 og lette stedspecifikke interaktioner med antivirale CV-N-derivater omkring det andet N-bundne glykosyleringssted på HA-hoveddomænet (HA-top med 4 N-bundne glycaner N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Interaktioner mellem glutaminsyre (Glu) og arginin (Arg) og den resulterende helixdipol manifesterede god stabilitet af både modelpeptider og proteiner, men visualiseres ved hjælp af SPR. Hvis sammenlignet med at genkende et enkelt kemisk syntetiseret glykosyleringssted på HA10 ved direkte at hæmme receptorbinding på glycandelene, viser det sig, at en højere affinitet af en fire-site muteret Fc-struktur til dens receptor fremkalder effektorfunktioner in vivo, hvilket afslører, at den ikke-relaterede sammensætning af N-bundne glycaner bundet til Fc-mutant er mekanisk bestemt13.
CV-N viser antiviral aktivitet mod HIV 14,15, influenza16 og Ebola-virus, som medieres af nanomolær binding til oligosaccharidmodifikationer med høj mannose på kuvert spike-proteiner12,17,18,19. Influenza HA-binding til et kulhydratbindingssted med høj affinitet (H) i CV-N eller to Hs i kovalent bundet dimerisk CVN2 bestemmes til at have ligevægtsdissociationskonstanter (K D) = henholdsvis 5,7 nM (figur 1A) og KD = 2,7 nM. Både CV-N og CVN2 har en anden en eller to kulhydratbindingssteder med lav affinitet (L) s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 binder til 2H CVN2 med affiniteter i det nedre nanomolære område (KD = 26 nM). CV-N WT binding til Ebola GP1,2 og HA udviser affiniteter fra K D = 34 nM til KD = 5,7 nM (A / New York / 55/04)12. Lektiner, såsom CV-N, som specifikt er målrettet mod glycaner med høj mannose på de virale konvolutter, hæmmer yderligere replikation af hepatitis C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus og mæslingevirus22.
Det lille CV-N-molekyle er blevet undersøgt grundigt i mere end 20 år, da det funktionaliserer for at binde en bred vifte af vira for at hæmme viral indgang16,18. Strukturelle analyser og bindende affinitetsassays indikerer tværbinding af to L'er i en domænebyttet CVN2-dimer ved bivalent binding i det mikromolære område for at øge aviditeten til virale kuvertglycoproteiner10,19. Selektiv binding af Manα1-2Manα på Man(8) D1D3-arme og Man(9) omfatter to bindingssteder med forskellige affiniteter placeret på modsatte proteinprotomerer20 og derved når nanomolære bindingsaffiniteter (figur 1B). CVN2 betragtes således som et pseudoantistof vedrørende dets anvendelse til at binde epitoper på HIV gp120, svarende til virusneutraliserende antistoffer17. Heri er forfatteren interesseret i at undersøge den potentielle binding af CVN2 til SARS-CoV-2-spidsen via dets receptorbindende domæne (RBD). Bindingskurver af immobiliseret humant angiotensinkonverterende enzym (ACE)-2 med SARS-CoV-2 RBD resulterer i KD = 4,7 nM for denne biologisk relevante bindingsinteraktion23.
I modsætning hertil genkender udvalgte immunglobulinklasser specifikke og konsistente strukturelle proteinmønstre, som giver et substrat til affinitetsmodning i de membranforankrede HA-regioner24. CV-N viser meget potent aktivitet i næsten alle influenza A- og B-vira16, og det er et bredt neutraliserende antiviralt middel. Vores viden er ufuldstændig om placeringen af målrettede epitoper på stammen af HA1 og HA2, der muligvis involverer epitopstrukturer til glycan-målretning ved stærkt neutraliserende antistoffer og sammenlignet med lektinbinding25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> Figur 1: Skematisk repræsentation af SPR-bindingsassay for CV-N til viruskuvertspidser. (A) SPR-analyse for CV-N-binding til ligand: HA-protein i fuld længde (90 kDa). Kinetisk datasæt (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM), der viser dobbeltrefereret binding i realtid til influenza HA A/New York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variant V2 binding til immobiliseret ligand DM inden for et koncentrationsområde på 500 nM til 16 μM. Sekvens: L-rester er fremhævet med gult. H-rester er fremhævet med gråt. E58 og R73 er en erstatning for cysteiner i vildtypeproteinet og gør V2 til en stabil proteinfold med tre i stedet for fire disulfidbindinger <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Mens glycanskjoldet på den membrandistale HA-topdel inducerer binding med høj affinitet til CV-N 12, er CVN2-binding til HA ved siden af en disulfidbro af HA-topdelen yderligere blevet observeret på dens steder med lav affinitet10,12. Forskellige polære interaktioner og interaktionssteder identificeres i kulhydratbinding af CV-N. Disse interaktioner verificeres ved at generere knock-out-varianter i bindingsstedet for at korrelere bindingsaffiniteter til in silico forudsagt glykosylering12. Projektet sigter således mod at sammenligne tidligere testede kemisk mannosylerede HA-peptider i bindingsaffinitet og specificitet med korte peptidsekvenser fra SARS-relaterede 2019-nCoV-pigge og SARS-CoV-2, naturligt forekommende modificeret af et lille antal forskellige N-bundne glykosyleringssteder og O-bundet glykosylering. Ved hjælp af kryo-elektronmikroskopi og bindende assays rapporterer Pinto og kolleger et monoklonalt antistof, S309, der potentielt genkender en epitop på SARS-CoV-2 spike-protein indeholdende en konserveret glycan i Sarbecovirus-undergenus uden at konkurrere med receptorbinding26. Protokollen for denne undersøgelse beskriver, hvordan design, udtryk og karakterisering af CV-N-varianter er vigtige for at studere, hvordan CV-N og CVN2 binder til glykosylerede proteiner og syntetiske mannosylerede peptider ved hjælp af SPR-teknologien10,12.
Tandembundet dimer CVN2L027 og bindingsstedsvarianter (V2-V5) udtrykkes rekombinant, og varianter er med disulfidbindingserstatninger (C58E og C73R) (figur 2A). Der fremstilles også en mutant med en enkeltpunktsmutation E41A, fordi denne position er blevet set som en intermolekylær krydskontaktrest. Denne mutant er et andet interessant molekyle til SPR-bindingsmålinger mellem lektin- og højmannoseoligosaccharider, der dechifrerer bindingsdomæner og tillader sammenligning med den dimere form. Den domænebyttede krystalstruktur af CVN2 viser en fleksibel linker, der strækker sig mellem 49 og 54 rester. De to domæner kan fortsætte med at bevæge sig rundt om hængslet som stive legemer og udvikle enten en monomer gennem intramolekylære domæneinteraktioner (domæne A -rester 1-39; 90-101- med domæne B -rester 40-89) eller en dimer ved intermolekylær domænebytte [domæne A (af den første monomer) med domæne B (af den anden) og domæne B (af den første monomer) med domæne A (af den anden kopi)]. Der er ingen tætte interaktioner mellem de to protomerers A- og B-domæner, bortset fra Glu4128. Genet for CV-N kan udvikles ved hjælp af en gentagen PCR-metode med 40-mer syntetiserede oligoer29 og subklones derefter i NdeI- og BamHI-stederne i pET11a til transformation (elektroporation) til elektrokompetente celler som beskrevet af Keeffe, J.R.27. Proteinet, der bruges til at opnå den respektive krystalstruktur (PDB ID 3S3Y), inkluderer et N-terminal 6-histidinrensningsmærke efterfulgt af et Faktor Xa protease-spaltningssted. Site-rettet mutagenese bruges til at lave punktmutationer, skifte kodoner og indsætte eller slette enkelte eller flere baser eller kodoner til aminosyreudveksling. Disse transformationer giver uvurderlig indsigt i proteinfunktion og struktur. Rekombinant udtrykt og oprenset CV-N, CVN2 og CVN3 er blevet biofysisk godt undersøgt20,21,27, er billige at producere og bruges derfor til at karakterisere bindende assays til glycaner immobiliseret på SPR-sensorchips. Konventionel enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) giver mindre reproducerbarhed vedrørende immobiliseringsteknikken for glycanligander og omdanner realtidsbinding af forskellige bindingsstedsvarianter, som er vist for SPR, til endepunktsassays.
Binding-affinitetsvariant CVN2L0-V2 (en intakt fold af homodimerisk CV-N med en disulfidbrosubstitution10) udtrykkes med et His-tag i Escherichia coli (E. coli), renset over Ni-NTA-søjle under anvendelse af affinitetskromatografi og testet for binding til HA (H3N2), monomannosyleret HA-peptid og dimannosyleret HA-peptid ved anvendelse af SPR. Kemisk mannosylerede peptider eller HA- og S-protein er alle ligander og amin koblet til den hydrofile chipoverflade via reaktive estere eller biotin-streptavidin protein engineering. Den samme procedure for sekventielle kørsler anvendes på disse ligander, idet forskellige fortyndinger af CV-N og varianter af CV-N (og CVN2) injiceres for at opnå kinetisk information til molekylære interaktionsanalyser som beskrevet nedenfor30. RBD-immobiliseret SPR-sensorchip bruges til bindingsundersøgelser af CV-N til S-peptider, og affiniteter sammenlignes med SARS-CoV-2-binding med den humane ACE2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

Overfladeplasmonresonans (SPR) bruges til at måle hæmagglutinin (HA) binding til domænebyttet Cyanovirin-N (CV-N) dimer og til at overvåge interaktioner mellem mannosylerede peptider og CV-N's bindingssted med høj affinitet. Virus kuvertspidser gp120, HA og Ebola glycoprotein (GP) 1,2 er blevet rapporteret at binde både bindingssteder med høj og lav affinitet på dimerisk CVN2. Dimannosyleret HA-peptid er også bundet på de to bindingssteder med lav affinitet til et konstrueret molekyle af CVN2, som bærer et sted med høj affinitet for den respektive ligand og muteret for at erstatte en stabiliserende disulfidbinding i kulhydratbindingslommen, hvilket bekræfter multivalent binding. HA-binding er vist til et bindingssted med høj affinitet af pseudo-antistof CVN2 ved en dissociationskonstant (KD) på 275 nM, der yderligere neutraliserer human immundefektvirus type 1 (HIV-1) gennem oligomerisering. Korrelation af antallet af disulfidbroer i domænebyttet CVN2, som reduceres fra 4 til 2 ved at erstatte cystiner i polære restpar af glutaminsyre og arginin, resulterer i reduceret bindingsaffinitet til HA. Blandt de stærkeste interaktioner er Ebola GP1,2 bundet af CVN2 med to bindingssteder med høj affinitet i det nedre nanomolære område ved hjælp af konvolutglycan uden et transmembrandomæne. I denne undersøgelse måles bindingen af det multispecifikke monomere CV-N til alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein ved K D = 18,6 μM sammenlignet med nanomolær KD til de andre virusspidser og via dets receptorbindende domæne i det midterste μ-molære område.

Et dimerisk domænebyttet CVN2L0-molekyle testes for binding til HA-topregionen i tre separate SPR-eksperimenter, og bindingsaffinitet præsenteres i KD-værdier. Domæne B antages at omfatte H-bindingssteder, som påvirkes ved at erstatte en disulfidbinding i ionrester, og domæne A danner L10,18. Enkeltinjektioner af CVN2L0 og varianterne V2 (tre disulfidbroer) og V5 (to disulfidbroer) testes først for binding til den HA-koblede sensorchip for at es...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Den nuværende protokol beskriver nye værktøjer til SPR-bindingsassays til undersøgelse af CV-N-binding til HA, S-glycoprotein, relaterede hybrid-type glycaner og oligosaccharider med høj mannose. SPR bruges til at bestemme KD til binding af enten dimerisk eller monomer CV-N til disse glycaner.

Ingeniør antivirale midler via overfladeplasmonresonans

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

Overfladeplasmonresonansspektroskopi er blevet etableret til bestemmelse af proteinligand på en medium gennemstrømningsmåde. Forskellige affiniteter for bindingsstedsvarianter af det samme molekyle præsenteres, nemlig for jernbindende høje manerer oligosaccharider på vira. SPR er en etiketfri teknik til at studere makromolekylær binding i realtid af overflade immobiliserede receptorer.Multisite-interaktioner genkendes i den kinetiske analyse ved konkurrencedygtig binding uafhængigt af størrelsen af de specifikke områder inden for forskning, der bruger SPR, er lægemiddeludvikling til at søge efter hæmmere eller antistofkarakterisering. Kinetiske konstanter og affiniteter beregnes direkte ud fra sensorresponsen. Til at begynde med overføres 100 mikroliter af opløsningen på LB-agarplader og spredes forsigtigt ved hjælp af en steril cellespreder.Start en række prøvereaktioner ved hjælp af flere koncentrationer af dobbeltstrenget DNA-skabelon, der spænder fra fem til 50 nanogram, mens primerkoncentrationen holdes konstant. Tilsæt derefter DpnI-restriktionsenzymet under mineralolieoverlejringen og inkuber straks ved 37 grader Celsius i en time for at fordøje forældrenes supercoiled dobbeltstrengede DNA. For at optø XL1-Blue Supercompetent Cells skal cellerne afleveres i et forkølet, lille, rundt bundrør.Overfør derefter en mikroliter af det DpnI-behandlede enkeltstrengede DNA fra hver kontrol- og prøvereaktion til separate alikvoter af de superkompetente celler, der syntetiserer den komplementære streng. Efter at have hvirvlet transformationsreaktionerne forsigtigt for at blande, inkuberes reaktionerne på is i 30 minutter. Påfør varmepuls på transformationsreaktionerne ved 42 grader Celsius i 45 sekunder, og læg derefter reaktionerne på is i to minutter.Tilsæt derefter 0,5 ml NZY + bouillon og inkuber transformationsreaktionerne ved 37 grader Celsius med omrystning ved 225 til 250 o / min i en time. Derefter plades det korrekte volumen af hver transformationsreaktion på LB Ampicillin Agar-plader som vist tidligere. For en frøkultur podes en lille mængde ampicillin indeholdende LB-medier med en enkelt koloni fra den transformerede plade.Ved hjælp af natten til dag inokuleres ekspressionskulturen med tilsætningsstoffer, herunder 10 millimolar magnesiumchlorid, 10 millimolar magnesiumsulfat og 20 millimolar glucose, fortynding af frøkulturen til en ved 100. Derefter vokser celler med kraftig omrystning ved 37 grader Celsius til en absorberende 600 nanometer mellem 0,4 og 0,6, før cellerne afkøles til 20 grader Celsius og induceres med en millimolar IPTG og vokser natten over. Høst derefter cellerne ved centrifugering ved 4.000 g i 15 minutter ved fire grader Celsius og kassér supernatanten.Efter at have resuheret cellepellet i fosfatbufferet saltvandsbuffer, nylig tilflugt ved 4.000 g i 15 minutter ved fire grader Celsius. Kassér derefter supernatanten med en pipette. Derefter resuspenderes den resterende pellet i 10 ml lysisbuffer og inkuberes suspensionen i en time ved 37 grader Celsius.Derefter adskilles opløselige og uopløselige fraktioner ved centrifugering ved 4.000 g i 15 minutter ved fire grader Celsius. Derudover skal du bruge HIS-Select Ni2+Affinity Gel i 14 ml rør til at binde og resuspendere hans mærkede rekombinant udtrykte cyanovirin-N i bufferopløsninger med henholdsvis 20 millimolar imidazol og 250 millimolar imidazol. Inkuberes i batch i mindst 30 minutter mellem disse trin.Tilsætning af elueringsbufferen indeholdende 250 millimolar imidazol til elulært protein. Overfør proteinopløsningerne til centrifugeringsrør med et 10 kilo Dalton afskæringsfilter og koncentrer dem ved centrifugering i 10 minutter ved 4.500 g og fire grader Celsius. Der tilsættes SPR-løbebuffer til en fortyndingsfaktor på en til 10 og centrifuge fire gange til det oprindelige volumen i 10 minutter ved 4.500 g og fire grader Celsius.Derefter bestemmes proteinkoncentrationen ved 280 nanometer ved hjælp af et NanoDrop UV-synligt spektrofotometer baseret på den beregnede udryddelseskoefficient for hovedproteinet CVN2L0, der viser en størrelse på 23.474 Dalton. Til dobbeltkanals SPR-systemet skal du bruge HBSCP plus som løbende buffer, 10 millimolar glycinsaltsyre med pH 1,5 til 1,6 som regenereringsbuffer og tænde instrumentafgasseren, autosampleren og pumpen. Vask derefter hele systemet med dobbelt destilleret vand i en time.Slip derefter nedsænkningsolie på detektoren og monter en glassensorchip belagt med en tynd guldfilm. Og på oversiden, funktionaliseret med carboxymethyl dextran hydrogel direkte på detektoren under tre-port flowcellen. Fastgør derefter indstillingen ved at trække håndteringen ned.For at immobilisere de proteinholdige ligander til sensorchips skal du åbne en kørselstabel ved at klikke på Form i menulinjen og køre tabeleditor i den integrerede SPP auto link-software. Vælg og klik derefter på Grundlæggende immobilisering fra listen over tilgængelige kørselstabeller og følg trinene i den eksperimentelle procedure på computerskærmen. Klik derefter på Sample Set Editor i formularafsnittet for at udfylde reagenslisten for to stativer placeret i autosampleren til yderligere analyse.Klik på Autosampler Direct Control som et værktøj i menulinjen for at bringe stativerne frem eller tilbage og vælge fire grader Celsius som driftstemperatur. Start pumpen for at tilføre dobbeltdestilleret vand ved at klikke på værktøjer og pumpe direkte kontrol. Og optag data ved at klikke på SPR Instrument Direct Control.Og hver gang skal du starte i det nyligt viste vindue. Når du har tilføjet koblingsreagenserne i 300 mikroliter hætteglas, skal du sætte dem i autosamplerstativerne og starte kørselstabellen ved at klikke på Kør. For den enkle protein-protein-interaktion, efter genopfyldning af pumpen ved 25.000 mikroliter pr. Minut, udfør baselinejustering i 30 sekunder.Der tillades den efterfølgende baselinejustering med dobbeltdestilleret vand i 1,5 minutter, før den aktiverede spånoverflade slukkes med et molært ethanolaminhydrochlorid, pH 8,5. Skift derefter rørene fra væskeprøvetageren til afgasseren fra dobbeltdestilleret vand ind i flasken med HBS-EP + Klik på Form, rul ned og skift til efterbehandling ved at klikke på denne driftstilstand. Klik derefter på Tilføj for at vælge bindingskurver, der genereres over tid i dataplatformen for hver flowcelle, og eksporter overlayet som en scrubberfil.Klik derefter på Filer for at åbne fillagringsindstillingerne og få svarkurver ved at justere venstre og højre kurver og trække signaler fra den anden referencekanal fra ligandkanalens. Enkeltinjektioner af CVN2L0 og varians V2 og V5 blev først testet for binding til hæmagglutininkoblet sensorchip for at estimere bindingskapaciteten ved hjælp af autosampleren og kørende tabeleditor. Gentagne injektioner blev automatiseret i forskellige koncentrationer i det nanomolære og mikromolære område i systemet over tid, hvilket viste, at der ikke blev opnået mætning på spånoverfladen eller ligevægtsbinding.Koncentration versus respons blev plottet for CVN-vildtypebinding til RBD, idet man antog specifik målretning af muligvis konserverede kulhydrater på RBD S1-underenheden med svagere affinitet med en dissociationshastighedskonstant på 260 mikromol. Det samme affinitetsplot for CVN2L0-V4-binding til DM bliver ikke længere analyserbart på grund af udskiftning af disulfidbindinger, der interfererer med binding med høj affinitet til små glycosylerede peptider og giver et højere respons end responsmaksimumværdien. CVN-vildtypebinding til RBD på SARS-CoV-2 viser binding til S-protein og RBD med en dissociationsraskonstant på henholdsvis 18,6 mikromol og 260 mikromol.Selvom SPR-respons for analysandkoncentrationer resulterer i høje responsenheder og typiske SPR-sensorgrammer for CVN-vildtype og E41A-binding. Mutanten er imidlertid ustabil, når den fortyndes. SPR biosensing adresserer høj affinitet og lav affinitetsbinding af oprensede proteiner og dets varianter til ligander.I vores tilfælde glycoproteiner, der udnytter optisk udlæsning og dobbeltkanalstrømningssystemet på sensorchipoverfladen. Enzym, der er immunosorbentassay, er en alternativ immunologisk metode, der genkender proteinepitoper, men også giver data om koncentrationen af peptider og små molekyler ud af komplekse matricer. Test af rekombinant udtrykte proteiner ved SPR-bindende assays inkorporerede biosensing af bekræftende ændringer, hvilket er nyttigt til verifikation og forudsigelse af proteinstabilitet ved beregningsproteinside.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance elastografi metode til evaluering af manipuleret væv Construct Vækst

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Fastgørelse Biologiske Prober til silica Optiske biosensorer Anvendelse silankoblingsmidler

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse for SENP1 Protease Kinetics Bestemmelse

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillarkraft Litografi for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Selvrapportering Stilladser for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

ECM Protein Nanofibers og nanostrukturer Engineered Brug Surface-initierede Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Overflade Potentiel Måling af Bakterier Brug Kelvin Probe force mikroskopi

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering af Intrinsic Vaskularisering i en<em&gt; In vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...