Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

De auteur erkent Dr. Christian Derntl van de afdeling Biotechnologie en Microbiologie aan de TU Wien en de afdeling Geneeskunde III, afdeling Nefrologie en Dialyse aan de Medische Universiteit van Wenen, in het bijzonder Dr. Markus Wahrmann voor technische en wetenschappelijke ondersteuning. Eiwitexpressie in zoogdiercellen werd ondersteund door de afdeling Biotechnologie van de Universiteit voor Natuurlijke Hulpbronnen en Levenswetenschappen (BOKU) Wenen. De auteur wil haar diepe erkentelijkheid betuigen aan Dr. Nico Dankbar van XanTec bioanalytics in Düsseldorf, Duitsland, voor nuttige wetenschappelijke discussies over het uitvoeren van de SPR-bindingstests.

Voor deze studie is een CVN-klein ubiquitine-achtig modifier (SUMO) fusie-eiwit gebruikt in enzymgebonden immunosorbente assays in plaats van CV-N en is geschikt voor celgebaseerde assays. Recombinant influenza A-virus HA H3-eiwit over de volledige lengte wordt commercieel verkregen (zie materiaaltabel) of tot expressie gebracht in hek293-cellijnen van zoogdieren en met baculovirus geïnfecteerde insectencellen volgens standaardprotocollen12. Wuhan-1 spike eiwit komt tot expressie...

De bindingsaffiniteit van CV-N is gecorreleerd met het aantal functionele bindingsplaatsen [2H op domeinen B en 2L op domein(en) A wanneer ontworpen als domein-swapped dimer]. Een variant met een veranderde bindingsaffiniteit (CVN2L0-V2, een homodimere stabiele vouw van CV-N bestaande uit een disulfidebrug knock-out) wordt uitgedrukt in E. coli, gezuiverd en positief getest op binding aan HA-eiwit (H3N2) met behulp van SPR10, en vertoont een conformatieverandering bij binding van HA met H...

Tetherin-geassocieerde antivirale activiteit wordt geïnduceerd door interferon-α, en het omvat op eiwitten gebaseerde tethers, die leiden tot het behoud van volledig gevormde virionen op geïnfecteerde celoppervlakken1. De noodzaak van tetherineglycosylering bij de remming van virusafgifte blijft onzeker, wat impliceert dat glycosylatiepatronen op recombinant tot expressie gebrachte glycanen voor in vitro studies 1,2, die afhankelijk is van de conformatie van (in het geval van influenzavirus) oppervlakte-uitgedrukt influenza hemagglutinine HA 3,4 . Er is opgemerkt dat modificatie van oligosaccharide gebonden aan N-gebonden glycosylering voldoende is voor tetherin-gemedieerde beperking van HIV type-1 release2, terwijl dimerisatie een essentiële rol speelt bij het voorkomen van virusafgifte, waarbij het transmembraandomein of glycosyl-fosfatidyl-inositol (GPI)-anker betrokken is voor het aanbinden van de ontluikende virionen5 . Unieke kenmerken worden beschreven voor menselijke en muriene tetherin om meerdere omhulde virussen, retrovirussen en filovirussen te blokkeren. BST-2/tetherin is een interferon-induceerbaar antiviraal eiwit van de aangeboren immuniteit 1,6, dat werkt met breedspectrum antivirale activiteit en wordt tegengewerkt door envelop glycoproteïnen5 om tetherine te transloceren of de structuur van tetherinte verstoren 6. Bijvoorbeeld, oppervlakte-uitgedrukte envelop glycoproteïne HA en neuraminidase op influenza A-virus zijn bekend voor tetherine-antagonisme op een stamspecifieke manier7, waardoor de herkenning van gastheerreceptorbindingsplaatsenwordt vergemakkelijkt 8. Glycaan-gerichte antilichamen worden bestudeerd in de stoichiometrie van hun interacties met de snel aanpassende glycaanschilden op HA, wat resulteert in bindingsaffiniteit met influenza A H3N2 en H1N1 subtypen4.
Om de bindingsmechanismen tussen antivirale middelen en virusenveloppieken, d.w.z. koolhydraatliganden, en complementaire immunologische en spectroscopische methoden op te helderen, worden mono-, di- en tri-mannose moieties chemisch gesynthetiseerd. De gemannosyleerde peptiden worden gemaakt via azidoglycosylering van glycosyl {beta}-peracetaten tot 1,2-trans glycosylazidentransformatie9, waarbij de typisch aangetroffen N-acetylglucosamine en hoog-mannose oligosacchariden op het oppervlak van levensbedreigende virussen worden nagebootst. Triazol bio-isotopen worden gebruikt om verbanden na te bootsen die het gemannosyleerde residu van HA-peptide10 vormen en sitespecifieke interacties met antivirale CV-N-derivaten rond de tweede N-gebonden glycosylatieplek op het HA-hoofddomein (HA-top met 4 N-gebonden glycanen N54, N97, N181, N301) 8,11,12 . Interacties tussen glutaminezuur (Glu) en arginine (Arg) en de resulterende helix dipool manifesteerden een goede stabiliteit van zowel modelpeptiden als eiwitten, maar worden gevisualiseerd met behulp van SPR. In vergelijking met het herkennen van een enkele chemisch gesynthetiseerde glycosylatieplaats op HA10 door de receptorbinding op de glycaanmoieties direct te remmen, wordt aangetoond dat een hogere affiniteit van een vier-site gemuteerde Fc-structuur naar zijn receptor effectorfuncties in vivo oproept, waardoor de niet-gerelateerde samenstelling van N-gebonden glycanen die aan Fc-mutant zijn gehecht, mechanistisch wordt bepaald13.
CV-N toont antivirale activiteit tegen HIV14,15, influenza16 en ebolavirus, dat wordt gemedieerd door nanomolaire binding aan oligosaccharidemodificaties met een hoog mannosegehalte op enveloppe spike-eiwitten 12,17,18,19. Influenza HA binding aan één koolhydraatbindende plaats met hoge affiniteit (H) in CV-N of twee H's in covalent gebonden dimerisch CVN2 wordt bepaald om evenwichtsdissociatieconstanten (KD) = 5,7 nM (figuur 1A) en KD = 2,7 nM te hebben. Zowel CV-N als CVN2 herbergen nog een of twee koolhydraatbindplaatsen met lage affiniteit (L)s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 bindt aan 2H cvn2 met affiniteiten in het lagere nanomolaire bereik (KD = 26 nM). CV-N WT binding aan Ebola GP1,2 en HA vertoont affiniteiten van KD = 34 nM tot KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Lectines, zoals CV-N, die zich specifiek richten op glycanen met een hoog mannosegehalte op de virale enveloppen, remmen de replicatie van hepatitis C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus en mazelenvirus22 verder.
Het kleine CV-N-molecuul is al meer dan 20 jaar grondig bestudeerd omdat het functionaliseert om een breed scala aan virussen te binden om virale binnenkomst te remmen16,18. Structurele analyses en bindingsaffiniteitstests wijzen op cross-linking van twee L's in een domein-swapped CVN2-dimeer door bivalente binding in het micromolaire bereik om de aviditeit naar virale envelop glycoproteïnen te verbeteren10,19. Selectieve binding van Manα1-2Manα op Man(8) D1D3-armen en Man(9) bestaat uit twee bindingsplaatsen van verschillende affiniteiten op tegengestelde eiwitprotomeren20, waardoor nanomolaire bindingsaffiniteiten worden bereikt (figuur 1B). Cvn2 wordt dus beschouwd als een pseudo-antilichaam met betrekking tot de toepassing ervan om epitopen te binden op HIV gp120, vergelijkbaar met virusneutraliserende antilichamen17. Hierin is de auteur geïnteresseerd in het onderzoeken van de potentiële binding van CVN2 aan de SARS-CoV-2-piek via zijn receptorbindende domein (RBD). Bindingscurven van geïmmobiliseerd humaan angiotensine-converterend enzym (ACE)-2 met de SARS-CoV-2 RBD resulteren in KD = 4,7 nM voor deze biologisch relevante bindingsinteractie23.
Daarentegen herkennen geselecteerde immunoglobulineklassen specifieke en consistente structurele eiwitpatronen, die een substraat geven voor affiniteitsrijping in de membraangeankerde HA-regio's24. CV-N vertoont zeer krachtige activiteit in bijna alle influenza A- en B-virussen16, en het is een breed neutraliserend antiviraal middel. Onze kennis is onvolledig over de locatie van gerichte epitopen op de stam van HA1 en HA2 die mogelijk epitopische structuren voor glycaan-targeting omvatten door sterk neutraliserende antilichamen en in vergelijking met lectinebinding25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de SPR-bindingstest voor CV-N naar virus enveloppenpieken. (A) SPR-test voor CV-N binding aan ligand: HA-eiwit over de volledige lengte (90 kDa). Kinetische dataset (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) met real-time dubbele verwijzing naar influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). B) CVN2L0 variant V2 binding aan geïmmobiliseerd ligand DM binnen een concentratiebereik van 500 nM tot 16 μM. Volgorde: L-residuen worden geel gemarkeerd. H-residuen worden grijs gemarkeerd. E58 en R73 zijn een vervanging voor cysteines in het wildtype eiwit en maken van V2 een stabiele eiwitplooi met drie in plaats van vier disulfide bindingen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Terwijl het glycaanschild op het membraan-distale HA-bovenste deel een hoge affiniteitsbinding aan CV-N12 induceert, is CVN2-binding aan HA naast een disulfidebrug van het HA-bovenste deel verder waargenomen op de locaties met lage affiniteit10,12. Verschillende polaire interacties en interactieplaatsen worden geïdentificeerd in koolhydraatbinding door CV-N. Deze interacties worden geverifieerd door knock-outvarianten in de bindingsplaats te genereren om bindingsaffiniteiten te correleren met in silico voorspelde glycosylatie12. Het project heeft dus tot doel om eerder geteste chemisch gemannosyleerde HA-peptiden in bindingsaffiniteit en specificiteit te vergelijken met korte peptidesequenties van SARS-gerelateerde 2019-nCoV-spikes en SARS-CoV-2, van nature voorkomend gemodificeerd door een klein aantal verschillende N-gebonden glycosylatieplaatsen en O-gebonden glycosylering. Met behulp van cryo-elektronenmicroscopie en bindingstests rapporteren Pinto en collega's een monoklonaal antilichaam, S309, dat mogelijk een epitoop herkent op SARS-CoV-2 spike-eiwit dat een geconserveerd glycaan bevat in het Sarbecovirus-subgenus, zonder te concurreren met receptoraanhechting26. Het protocol van deze studie beschrijft hoe het ontwerpen, tot expressie brengen en karakteriseren van CV-N-varianten belangrijk is om te bestuderen hoe CV-N en CVN2 binden aan geglycosyleerde eiwitten en synthetische gemannosyleerde peptiden met behulp van de SPR-technologie10,12.
Tandem-gebonden dimeer CVN2L027 en bindingsplaatsvarianten (V2-V5) worden recombinant uitgedrukt en varianten zijn met disulfidebindingsvervangingen (C58E en C73R) (figuur 2A). Ook wordt een mutant met een single-point mutatie E41A voorbereid omdat deze positie is gezien als een intermoleculair kruiscontacterend residu. Deze mutant is een ander interessant molecuul voor SPR-bindingsmetingen tussen het lectine en de oligosacchariden met een hoog mannosegehalte die bindingsdomeinen ontcijferen en maakt vergelijking met de dimerische vorm mogelijk. De domein-swapped kristalstructuur van CVN2 toont een flexibele linker, die zich uitstrekt tussen 49 en 54 residuen. De twee domeinen kunnen als starre lichamen rond het scharnier blijven bewegen en ofwel een monomeer ontwikkelen door intramoleculaire domeininteracties (domein A -residuen 1-39;90-101- met domein B -residuen 40-89) of een dimeer door intermoleculaire domeinruil [domein A (van het eerste monomeer) met domein B (van de tweede), en domein B (van het eerste monomeer) met domein A (van de tweede kopie)]. Er zijn geen nauwe interacties tussen de A- en B-domeinen van de twee protomeren, behalve Glu4128. Het gen voor CV-N kan worden ontwikkeld met behulp van een repetitieve PCR-methode met 40-mer gesynthetiseerdeoligo's 29 en wordt vervolgens gesubcloned in de NdeI- en BamHI-sites van pET11a voor transformatie (elektroporatie) in elektrocompetente cellen zoals beschreven door Keeffe, J.R.27. Het eiwit, dat wordt gebruikt voor het bereiken van de respectieve kristalstructuur (PDB ID 3S3Y), bevat een N-terminale 6-histidinezuiveringstag gevolgd door een Factor Xa-proteasesplitsingsplaats. Site-gerichte mutagenese wordt gebruikt om puntmutaties te maken, codons te schakelen en enkele of meerdere basen of codons in te brengen of te verwijderen voor aminozuuruitwisseling. Deze transformaties geven van onschatbare waarde inzicht in de eiwitfunctie en -structuur. Recombinant uitgedrukt en gezuiverd CV-N, CVN2 en CVN3 zijn biofysisch goed bestudeerd 20,21,27, zijn goedkoop te produceren en worden daarom gebruikt om bindingstests te karakteriseren voor glycanen die zijn geïmmobiliseerd op SPR-sensorchips. Conventionele enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) biedt minder reproduceerbaarheid met betrekking tot de immobilisatietechniek van glycaanliganden en transformeert real-time binding van verschillende bindingsplaatsvarianten, die wordt getoond voor SPR, in eindpunttests.
Bindingsaffiniteitsvariant CVN2L0-V2 (een intacte vouw van homodimere CV-N met een disulfidebrugsubstitutie10) wordt uitgedrukt met een His-tag in Escherichia coli (E. coli), gezuiverd over Ni-NTA-kolom met affiniteitschromatografie en getest op binding aan HA (H3N2), monomannosylated HA-peptide en gediamanosyleerd HA-peptide met behulp van SPR. Chemisch gemannosyleerde peptiden, of HA- en S-eiwit, zijn allemaal liganden en amine gekoppeld aan het hydrofiele chipoppervlak via reactieve esters of biotine-streptavidin eiwittechnologie. Dezelfde procedure van sequentiële runs wordt toegepast op die liganden, waarbij verschillende verdunningen van CV-N en varianten van CV-N (en CVN2) worden geïnjecteerd om kinetische informatie te verkrijgen voor de moleculaire interactieanalyses zoals beschreven onder30. RBD-geïmmobiliseerde SPR-sensorchip wordt gebruikt voor bindingsstudies op CV-N naar S-peptiden en affiniteiten worden vergeleken met SARS-CoV-2-binding met de menselijke ACE2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

Oppervlakteplasmonresonantie (SPR) wordt gebruikt om hemagglutinine (HA) binding aan domein-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimeer te meten en om interacties tussen gemannosyleerde peptiden en CV-N's hoge affiniteit bindingsplaats te monitoren. Virus enveloppen spikes gp120, HA en Ebola glycoproteïne (GP) 1,2 zijn gemeld om zowel hoge als lage affiniteit bindingsplaatsen op dimerische CVN2 te binden. Gedimannosyleerd HA-peptide is ook gebonden aan de twee bindingsplaatsen met lage affiniteit aan een gemanipuleerd molecuul van CVN2, dat een hoge affiniteitsplaats voor het respectieve ligand draagt en gemuteerd is om een stabiliserende disulfidebinding in de koolhydraatbindende pocket te vervangen, waardoor multivalente binding wordt bevestigd. HA-binding wordt aangetoond aan één hoge-affiniteitsbindingsplaats van pseudo-antilichaam CVN2 bij een dissociatieconstante (KD) van 275 nM die het humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) verder neutraliseert door oligomerisatie. Het correleren van het aantal disulfidebruggen in domein-swapped CVN2, die worden verminderd van 4 naar 2 door cystines te vervangen door polaire residuparen van glutaminezuur en arginine, resulteert in verminderde bindingsaffiniteit voor HA. Een van de sterkste interacties is Ebola GP1,2 gebonden door CVN2 met twee bindingsplaatsen met hoge affiniteit in het lagere nanomolaire bereik met behulp van het enveloppeglycaan zonder een transmembraandomein. In deze studie wordt de binding van het multispecifieke monomere CV-N aan ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoproteïne gemeten bij KD = 18,6 μM in vergelijking met nanomolair KD aan die andere viruspieken, en via het receptorbindende domein in het midden-μ-molaire bereik.

Een dimerisch domein-swapped CVN2L0-molecuul wordt getest op binding aan het HA-topgebied in drie afzonderlijke SPR-experimenten en bindingsaffiniteit wordt gepresenteerd in KD-waarden. Domein B wordt verondersteld H-bindingsplaatsen te omvatten, die worden beïnvloed door het vervangen van een disulfidebinding in ionische residuen, en domein A vormt L 10,18. Enkelvoudige injecties van CVN2L0 en varianten V2 (drie disulfidebruggen) en V5 (twee disulfid...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Het huidige protocol beschrijft nieuwe hulpmiddelen voor SPR-bindingstests om CV-N-binding aan HA, S-glycoproteïne, gerelateerde hybride-type glycanen en oligosacchariden met een hoog mannosegehalte te onderzoeken. SPR wordt gebruikt om de KD te bepalen voor het binden van dimerische of monomere CV-N aan deze glycanen.

Engineering antivirale middelen via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

Oppervlakteplasmonresonantiespectroscopie is vastgesteld voor de bepaling van eiwitligand op een medium throughput manier. Verschillende affiniteiten voor bindingsplaatsvarianten van hetzelfde molecuul worden gepresenteerd, namelijk voor de van ijzerbindende hoge manieren oligosacchariden op virussen. SPR is een labelvrije techniek om real-time macromoleculaire binding van oppervlakte-geïmmobiliseerde receptoren te bestuderen.Multisite-interacties worden in de kinetische analyse herkend door competitieve binding onafhankelijk van de grootte van de specifieke gebieden in onderzoek die SPR gebruiken, zijn medicijnontwikkeling om te zoeken naar remmers of antilichaamkarakterisering. Kinetische constanten en affiniteiten worden direct berekend uit de sensorrespons. Breng om te beginnen 100 microliter van de oplossing over op LB-agar-platen en verspreid deze voorzichtig met behulp van een steriele celverspreider.Start een reeks monsterreacties met behulp van meerdere concentraties dubbelstrengs DNA-sjabloon variërend van vijf tot 50 nanogram terwijl de primerconcentratie constant blijft. Voeg vervolgens het DpnI-restrictie-enzym toe onder de minerale olie-overlay en incubeer onmiddellijk bij 37 graden Celsius gedurende een uur voor het verteren van het ouderlijke supercoiled dubbelstrengs DNA. Om de XL1-Blue Supercompetent Cells te ontdooien, aliquot u de cellen tot een voorgekoelde, kleine, ronde bodembuis.Breng vervolgens één microliter van het met DpnI behandelde enkelstrengs DNA over van elke controle- en monsterreactie naar afzonderlijke aliquots van de supercompetente cellen die de complementaire streng synthetiseren. Nadat u de transformatiereacties zorgvuldig hebt gezwenkt om te mengen, incubeert u de reacties gedurende 30 minuten op ijs. Breng gedurende 45 seconden warmtepuls aan op de transformatiereacties bij 42 graden Celsius en plaats de reacties vervolgens gedurende twee minuten op ijs.Voeg vervolgens 0,5 milliliter NZY +Bouillon toe en incubeer de transformatiereacties bij 37 graden Celsius met schudden bij 225 tot 250 RPM gedurende een uur. Plaats daarna het juiste volume van elke transformatiereactie op LB Ampicilline Agar-platen zoals eerder aangetoond. Voor een zaadcultuur ent u een kleine hoeveelheid ampicilline met LB-media met een enkele kolonie van de getransformeerde plaat.Gebruik de nachtcultuur ent de expressiecultuur met additieven, waaronder 10 millimol magnesiumchloride, 10 millimol magnesiumsulfaat en 20 millimol glucose, waardoor de zaadcultuur tot één bij 100 wordt verdund. Laat vervolgens cellen groeien met krachtig schudden bij 37 graden Celsius tot een absorberende 600 nanometer tussen 0,4 en 0,6 voordat de cellen worden gekoeld tot 20 graden Celsius en induceer met één millimolaire IPTG en groei 's nachts. Oogst vervolgens de cellen door 15 minuten op 4.000 g te centrifugeren bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.Na resuspendatie van de celpellet in fosfaat gebufferde zoutbuffer, recente toevlucht bij 4.000 g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant vervolgens weg met een pipet. Resuspenseer vervolgens de resterende pellet in 10 milliliter lysisbuffer en incubeer de suspensie gedurende een uur bij 37 graden Celsius.Scheid vervolgens oplosbare en onoplosbare fracties door centrifugering bij 4.000 g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Gebruik bovendien HIS-Select Ni2 + Affinity Gel in buizen van 14 milliliter om zijn gelabelde recombinant tot expressie gebrachte cyanovirine-N te binden en te resuspenderen in bufferoplossingen met respectievelijk 20 millimolidazool en 250 millimolar imidazol. Incubeer in batch gedurende ten minste 30 minuten tussen deze stappen.Toevoeging van de elutiebuffer met 250 millimolair imidazol aan eluuteiwit. Breng de eiwitoplossingen over in centrifugatiebuizen met een Dalton-afsnijfilter van 10 kilo en concentreer ze door ze gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 4, 500 g en vier graden Celsius. Voeg spr-loopbuffer toe aan een verdunningsfactor van één tot 10 en centrifugeer vier keer tot het oorspronkelijke volume gedurende 10 minuten bij 4, 500 g en vier graden Celsius.Bepaal daarna de eiwitconcentratie op 280 nanometer met behulp van een NanoDrop UV-Visible Spectrophotometer op basis van de berekende extinctie co-efficiënt voor het hoofdeiwit CVN2L0 met een grootte van 23.474 Dalton. Gebruik voor het tweekanaals SPR-systeem HBSCP plus als loopbuffer, 10 millimolar glycine zoutzuur van pH 1,5 tot 1,6 als regeneratiebuffer en schakel de instrumentontgasser, autosampler en pomp in. Was vervolgens het hele systeem met dubbel gedestilleerd water gedurende een uur.Laat vervolgens dompelolie op de detector vallen en monteer een glazen sensorchip die is bedekt met een dunne gouden film. En aan de bovenzijde, gefunctionaliseerd met carboxymethyl dextran hydrogel direct op de detector onder de driepoorts flowcel. Repareer vervolgens de instelling door de bediening naar beneden te trekken.Om de eiwithoudende liganden te immobiliseren tot sensorchips, opent u een run-tabel door op Formulier in de menubalk te klikken en voert u de tabeleditor uit in de geïntegreerde SPP auto link-software. Kies en klik vervolgens op Basic Immobilization in de lijst met beschikbare uitvoeringstabellen en volg de stappen van de experimentele procedure op het computerscherm. Klik vervolgens op Sample Set Editor in het formuliergedeelte om de reagentialijst in te vullen voor twee racks die in de autosampler zijn geplaatst voor verdere analyse.Klik op Autosampler Direct Control als hulpmiddel in de menubalk om de racks naar voren of terug naar huis te brengen en kies vier graden Celsius als bedrijfstemperatuur. Start de pomp om dubbel gedestilleerd water te injecteren door op gereedschappen te klikken en directe regeling van de pomp te pompen. En leg gegevens vast door op SPR Instrument Direct Control te klikken.En begin elke keer in het nieuw verschijnende venster. Nadat u de koppelreagentia in flacons van 300 microliter hebt toegevoegd, plaatst u ze in de autosampler-rekken en start u de run-tabel door op Uitvoeren te klikken. Voor de eenvoudige eiwit-eiwitinteractie voert u na het bijvullen van de pomp met 25.000 microliter per minuut de basislijnaanpassing gedurende 30 seconden uit.Laat de daaropvolgende basislijnaanpassing met dubbel gedestilleerd water gedurende 1,5 minuut toe voordat u het geactiveerde chipoppervlak dooft met één molaire ethanolaminehydrochloride, pH 8,5. Schakel vervolgens de buizen van de vloeibare sampler naar de ontgasser van dubbel gedestilleerd water in de fles met HBS-EP + Klik op Formulier, scroll naar beneden en verander naar Nabewerking door op deze bewerkingsmodus te klikken. Klik vervolgens op Toevoegen om bindingscurven te selecteren die in de loop van de tijd in het gegevensplatform voor elke stroomcel zijn gegenereerd en exporteer de overlay als een scrubberbestand.Klik vervolgens op Bestand om de opties voor het opslaan van bestanden te openen en responscurven te verkrijgen door linker- en rechtercurven uit te lijnen en signalen van het tweede referentiekanaal af te trekken van die van het ligandkanaal. Enkelvoudige injecties van CVN2L0 en variantie V2 en V5 werden eerst getest op binding aan de hemagglutinine gekoppelde sensorchip om de bindingscapaciteit te schatten met behulp van de autosampler en lopende tafeleditor. Herhaalde injecties werden geautomatiseerd in verschillende concentraties in het nanomolaire en micromolaire bereik in het systeem in de loop van de tijd, wat aantoonde dat er geen verzadiging op het chipoppervlak of evenwichtsbinding werd bereikt.Concentratie versus respons werd uitgezet voor CVN wild-type binding aan RBD, uitgaande van specifieke targeting van mogelijk geconserveerde koolhydraten op de RBD S1-subeenheid met zwakkere affiniteit met een dissociatiesnelheidsconstante van 260 micromol. Dezelfde affiniteitsplot voor CVN2L0-V4-binding aan DM wordt niet langer analyseerbaar vanwege de vervanging van disulfidebindingen die interfereren met hoge affiniteitsbinding aan kleine geglycosyleerde peptiden en een hogere respons dan responsmaximumwaarde opleveren. CVN wild-type binding aan RBD op SARS-CoV-2 toont binding aan S-eiwit en RBD met een dissociatie woede constante van respectievelijk 18,6 micromol en 260 micromol.Hoewel SPR-respons voor analytconcentraties resulteert in hoge responseenheden en typische SPR-sensorgrammen voor CVN wild-type en E41A-binding. De mutant is echter onstabiel wanneer hij verdund is. SPR-biosensing richt zich op bindingen met hoge affiniteit en lage affiniteit van gezuiverde eiwitten en zijn varianten op liganden.In ons geval glycoproteïnen die gebruik maken van optische uitlezing en het tweekanaals stroomsysteem op het oppervlak van de sensorchip. Enzyme being immunosorbent assay is een alternatieve immunologische methode die eiwitepionaten herkent, maar ook gegevens levert over de concentratie van peptiden en kleine moleculen uit complexe matrices. Het testen van recombinant tot expressie gebrachte eiwitten door SPR-bindingstests omvatte biosensing van bevestigingsveranderingen die nuttig is voor de verificatie en voorspelling van eiwitstabiliteit per computationele eiwitzijde.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Procedure for Lung Engineering

Procedure voor Lung Techniek

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance elastografie methodologie voor de evaluatie van Tissue Engineered Construct groei

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Kwantitatieve FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse voor SENP1 Protease Kinetics Bepaling

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

ECM Eiwit nanovezels en nanostructuren Engineered behulp-Surface geïnitieerde Vergadering

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Oppervlakte Potentieel Meting van Bacteriën Met behulp Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering door Intrinsic Vascularisatie in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...