Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
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L’auteur remercie le Dr Christian Derntl du Département de biotechnologie et de microbiologie de la TU Wien et du Département de médecine III, Division de néphrologie et de dialyse de l’Université de médecine de Vienne, en particulier le Dr Markus Wahrmann pour son soutien technique et scientifique. L’expression des protéines dans les cellules de mammifères a été soutenue par le Département de biotechnologie de l’Université des ressources naturelles et des sciences de la vie (BOKU) de Vienne. L’auteur tient à exprimer sa profonde gratitude au Dr Nico Dankbar de XanTec bioanalytics à Düsseldorf, en Allemagne, pour ses discussions scientifiques utiles sur la réalisation des tests de liaison SPR.

Pour la présente étude, une protéine de fusion SUMO (modificateur de type ubiquitine) à petite ubiquitine CVN a été utilisée dans des tests immuno-enzymatiques au lieu de CV-N et convient aux tests cellulaires. La protéine HA H3 recombinante du virus de la grippe A pleine longueur est obtenue commercialement (voir le tableau des matières) ou exprimée dans des lignées cellulaires HEK293 de mammifères et des cellules d’insectes infectées par le baculovirus selon les protocoles standard<sup c...

L’affinité de liaison de CV-N est corrélée avec le nombre de sites de liaison fonctionnels [2H sur les domaines B et 2L sur le(s) domaine(s) A lorsqu’ils sont conçus comme dimères permutés de domaine]. Une variante avec une affinité de liaison altérée (CVN2L0-V2, un pli stable homodimérique de CV-N comprenant un pont disulfure) est exprimée dans E. coli, purifiée et testée positivement pour la liaison à la protéine HA (H3N2) en utilisant SPR10, et montre un changement c...

L’activité antivirale associée à la tetherine est induite par l’interféron-α, et elle comprend des attaches à base de protéines, qui conduisent à la rétention de virions entièrement formés sur les surfaces cellulaires infectées1. La nécessité de la glycosylation de l’attache dans l’inhibition de la libération du virus demeure incertaine, ce qui implique l’importance des profils de glycosylation sur les glycanes exprimés par recombinaison pour les études in vitro 1,2, qui dépend de la conformation (dans le cas du virus de la grippe) de l’hémagglutinine HA 3,4 de la grippe exprimée en surface . Il a été noté que la modification de l’oligosaccharide attaché à la glycosylation liée à l’azote est suffisante pour la restriction médiée par l’attache de la libération 2 du VIH de type1, tandis que la dimérisation joue un rôle essentiel dans la prévention de la libération du virus, impliquant ainsi le domaine transmembranaire ou l’ancrage du glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI) pour attacher les virions en herbe5 . Des caractéristiques uniques sont décrites pour l’attachement humain et murin afin de bloquer plusieurs virus, rétrovirus et filovirus enveloppés. BST-2/tetherin est une protéine antivirale inductible par l’interféron de l’immunité innée1,6, agissant avec une activité antivirale à large spectre et est antagonisée par les glycoprotéines d’enveloppe5 pour translocaliser l’attache ou perturber la structure de la tetherin 6. Par exemple, la glycoprotéine HA et la neuraminidase de l’enveloppe exprimée en surface sur le virus de la grippe A sont bien connues pour l’antagonisme de la tetherine d’une manière spécifique à la souche7, facilitant la reconnaissance des sites de liaison aux récepteurs de l’hôte8. Les anticorps ciblant les glycanes sont étudiés dans la stœchiométrie de leurs interactions avec les boucliers glycanes à personnalisation rapide sur l’HA, ce qui entraîne une affinité de liaison avec les sous-types 4 H3N2 et H1N1 de la grippeA.
Pour élucider les mécanismes de liaison entre les agents antiviraux et les pics d’enveloppe virale, c’est-à-dire les ligands glucidiques, et les méthodes immunologiques et spectroscopiques complémentaires, les fractions mono-, di- et tri-mannose sont synthétisées chimiquement. Les peptides mannosylés sont créés par glycosylation azido de glycosyl {bêta}-peracétates en 1,2-trans glycosyl azoturetransformation 9, imitant la N-acétyl glucosamine et les oligosaccharides à haute teneur en mannose à la surface de virus potentiellement mortels. Les bioisostères triazolés sont utilisés pour imiter les liaisons qui forment le résidu mannosylé du peptide HA10 et faciliter les interactions spécifiques au site avec les dérivés antiviraux CV-N autour de la deuxième tache de glycosylation liée à l’azote sur le domaine de la tête HA (sommet HA avec 4 glycanes N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Les interactions entre l’acide glutamique (Glu) et l’arginine (Arg) et le dipôle hélicoïdal qui en résulte ont manifesté une bonne stabilité des peptides et des protéines modèles, mais sont visualisées à l’aide de SPR. Si on compare à la reconnaissance d’un seul site de glycosylation synthétisé chimiquement sur HA10 en inhibant directement la liaison du récepteur sur les fractions glycanes, une affinité plus élevée d’une structure Fc mutée à quatre sites avec son récepteur est démontrée pour provoquer des fonctions effectrices in vivo, révélant que la composition non apparentée des glycanes liés à l’azote attachés au mutant Fc doit être déterminée mécaniquement13.
CV-N affiche une activité antivirale contre le VIH 14,15, la grippe16 et le virus Ebola, qui est médiée par la liaison nanomolaire aux modifications oligosaccharidiques à haute teneur en mannose sur les protéines de pointe d’enveloppe12,17,18,19. Il est déterminé que l’HA de la grippe se liant à un site de liaison aux glucides (H) de haute affinité dans le CV-N ou à deux Hs dans le CVN2 dimérique lié par covalence présente des constantes de dissociation à l’équilibre (K D) = 5,7 nM (figure 1A) et KD = 2,7 nM, respectivement. CV-N et CVN2 abritent tous deux un ou deux autres sites de liaison aux glucides de faible affinité (L)s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 se lie à 2H de CVN2 avec des affinités dans la gamme nanomolaire inférieure (KD = 26 nM). La liaison CV-N Wt à Ebola GP1,2 et HA présente des affinités de K D = 34 nM à KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Les lectines, telles que CV-N, qui ciblent spécifiquement les glycanes à haut niveau de mannose sur les enveloppes virales, inhibent davantage la réplication du virus de l’hépatite C, du SRAS-CoV, de l’herpèsvirus, du virus Marburg et du virus de la rougeole22.
La petite molécule CV-N a été étudiée en profondeur pendant plus de 20 ans car elle se fonctionnalise pour se lier à un large éventail de virus afin d’inhiber l’entrée virale16,18. Les analyses structurales et les tests d’affinité de liaison indiquent la réticulation de deux L dans un dimère CVN2 permuté par domaine par liaison bivalente dans la gamme micromolaire pour améliorer l’avidité des glycoprotéines de l’enveloppe virale10,19. La liaison sélective de Manα1-2Manα sur les bras Man(8) D1D3 et Man(9) comprend deux sites de liaison d’affinités différentes situés sur des protomères protéiques opposés20, atteignant ainsi des affinités de liaison nanomolaire (Figure 1B). Ainsi, CVN2 est considéré comme un pseudo-anticorps concernant son application pour lier les épitopes sur le VIH gp120, similaire aux anticorps neutralisant le virus17. Ici, l’auteur s’intéresse à l’étude de la liaison potentielle de CVN2 au pic SARS-CoV-2 via son domaine de liaison au récepteur (RBD). Les courbes de liaison de l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine (ECA)-2 immobilisée avec le RBD du SRAS-CoV-2 donnent KD = 4,7 nM pour cette interaction de liaison biologiquement pertinente23.
En revanche, certaines classes d’immunoglobulines reconnaissent des schémas protéiques structuraux spécifiques et cohérents, qui confèrent un substrat pour la maturation d’affinité dans les régions HA ancrées dans la membrane24. CV-N montre une activité très puissante dans presque tous les virus grippaux A et B16, et c’est un agent antiviral largement neutralisant. Nos connaissances sont incomplètes sur la localisation des épitopes ciblés sur la tige de HA1 et HA2 qui impliquent éventuellement des structures épitopiques pour le ciblage des glycanes par des anticorps hautement neutralisants et par rapport à la liaison à la lectine25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique du test de liaison SPR pour les pics CV-N aux pics d’enveloppe virale. (A) Dosage SPR pour la liaison CV-N au ligand: protéine pleine longueur HA (90 kDa). Ensemble de données cinétiques (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) montrant une liaison en temps réel à double référence à l’HA de la grippe A/New-York/55/04 (H3N2). (B) Liaison de la variante V2 de la variante CVN2L0 au ligand DM immobilisé dans une plage de concentration comprise entre 500 nM et 16 μM. Séquence: Les résidus L sont surlignés en jaune. Les résidus H sont surlignés en gris. E58 et R73 remplacent les cystéines dans la protéine de type sauvage et font de V2 un repliement protéique stable avec trois liaisons disulfure au lieu de quatre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Alors que le bouclier glycane sur la partie supérieure HA distale de la membrane induit une liaison de haute affinité à CV-N 12, la liaison CVN2 à HA adjacente à un pont disulfure de la partie supérieure HA a également été observée à ses sites de faible affinité10,12. Diverses interactions polaires et sites d’interaction sont identifiés dans la liaison aux glucides par CV-N. Ces interactions sont vérifiées en générant des variantes knock-out dans le site de liaison pour corréler les affinités de liaison à la glycosylation in silico prédite12. Ainsi, le projet vise à comparer des peptides HA chimiquement mannosylés précédemment testés en affinité et spécificité de liaison avec de courtes séquences peptidiques provenant de pics 2019-nCoV liés au SRAS et du SARS-CoV-2, naturellement modifiés par un petit nombre de sites de glycosylation liés à l’N différents et glycosylation liée à O. En utilisant la cryo-microscopie électronique et les tests de liaison, Pinto et ses collègues rapportent un anticorps monoclonal, S309, qui reconnaît potentiellement un épitope sur la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 contenant un glycane conservé dans le sous-genre Sarbecovirus, sans entrer en compétition avec la fixation du récepteur26. Le protocole de cette étude décrit comment la conception, l’expression et la caractérisation des variantes CV-N sont importantes pour étudier comment CV-N et CVN2 se lient aux protéines glycosylées et aux peptides mannosylés synthétiques à l’aide de la technologie SPR10,12.
Les variantes de dimères liés en tandem CVN2L027 et de site de liaison (V2-V5) sont exprimées de manière recombinante et les variantes sont avec des remplacements de liaison disulfure (C58E et C73R) (Figure 2A). En outre, un mutant avec une mutation ponctuelle unique E41A est préparé parce que cette position a été vue comme un résidu de contact intermoléculaire croisé. Ce mutant est une autre molécule intéressante pour les mesures de liaison SPR entre la lectine et les oligosaccharides à haut mannose, déchiffrant les domaines de liaison et permettant la comparaison avec la forme dimérique. La structure cristalline permutée de domaine de CVN2 montre un linker flexible, qui s’étend entre 49 et 54 résidus. Les deux domaines peuvent continuer à se déplacer autour de la charnière en tant que corps rigides, développant soit un monomère par des interactions de domaine intramoléculaire (domaine A -résidus 1-39;90-101- avec le domaine B -résidus 40-89) soit un dimère par échange de domaine intermoléculaire [domaine A (du premier monomère) avec le domaine B (du second), et domaine B (du premier monomère) avec le domaine A (de la deuxième copie)]. Il n’y a pas d’interactions étroites entre les domaines A et B des deux protomères, à l’exception de Glu4128. Le gène CV-N peut être développé à l’aide d’une méthode de PCR répétitive avec des oligos synthétisés 40-mer29 et est ensuite sous-cloné dans les sites NdeI et BamHI de pET11a pour la transformation (électroporation) en cellules électrocompétentes comme décrit par Keeffe, J.R.27. La protéine, qui est utilisée pour obtenir la structure cristalline respective (PDB ID 3S3Y), comprend une étiquette de purification N-terminale 6-histidine suivie d’un site de clivage de la protéase du facteur Xa. La mutagénèse dirigée est utilisée pour effectuer des mutations ponctuelles, changer de codon, et insérer ou supprimer des bases ou des codons simples ou multiples pour l’échange d’acides aminés. Ces transformations fournissent des informations inestimables sur la fonction et la structure des protéines. Les CV-N, CVN2 et CVN3 exprimés et purifiés par recombinaison ont été biophysiquement bien étudiés20,21,27, sont peu coûteux à produire et sont donc utilisés pour caractériser les tests de liaison aux glycanes immobilisés sur les puces de capteur SPR. Le test immuno-enzymatique conventionnel (ELISA) fournit moins de reproductibilité en ce qui concerne la technique d’immobilisation des ligands glycanes et transforme la liaison en temps réel de diverses variantes de site de liaison, qui est montrée pour SPR, en tests finaux.
La variante d’affinité de liaison CVN2L0-V2 (un pli intact de CV-N homodimérique avec une substitution de pont disulfure10) est exprimée avec un His-tag chez Escherichia coli (E. coli), purifiée sur colonne Ni-NTA en appliquant une chromatographie d’affinité et testée pour la liaison à HA (H3N2), peptide HA monomannosylé et peptide HA dimannosylé à l’aide de SPR. Les peptides chimiquement mannosylés, ou protéines HA et S, sont tous des ligands et des amines couplés à la surface de la puce hydrophile via des esters réactifs ou l’ingénierie des protéines biotine-streptavidine. La même procédure d’essais séquentiels est appliquée à ces ligands, en injectant diverses dilutions de CV-N et de variantes de CV-N (et CVN2) pour obtenir des informations cinétiques pour les analyses d’interaction moléculaire décrites ci-dessous30. La puce de capteur SPR immobilisée par RBD est utilisée pour les études de liaison sur les peptides CV-N à S, et les affinités sont comparées à la liaison du SARS-CoV-2 avec l’ACE2 humain.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

La résonance plasmonique de surface (SPR) est utilisée pour mesurer la liaison de l’hémagglutinine (HA) au dimère de cyanovirine-N (CV-N) interverti et pour surveiller les interactions entre les peptides mannosylés et le site de liaison à haute affinité de CV-N. Il a été rapporté que les pics d’enveloppe virale gp120, HA et la glycoprotéine Ebola (GP) 1,2 se lient aux sites de liaison à haute et à faible affinité sur le CVN2 dimérique. Le peptide HA dimannosylé est également lié aux deux sites de liaison de faible affinité à une molécule modifiée de CVN2, qui porte un site de haute affinité pour le ligand respectif et mutée pour remplacer une liaison disulfure stabilisatrice dans la poche de liaison aux glucides, confirmant ainsi la liaison multivalente. La liaison de l’HA est démontrée à un site de liaison à haute affinité du pseudo-anticorps CVN2 à une constante de dissociation (KD) de 275 nM qui neutralise davantage le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) par oligomérisation. La corrélation du nombre de ponts disulfure dans CVN2 permuté de domaine, qui sont diminués de 4 à 2 en substituant les cystines en paires de résidus polaires d’acide glutamique et d’arginine, entraîne une affinité de liaison réduite à l’HA. Parmi les interactions les plus fortes, Ebola GP1,2 est lié par CVN2 avec deux sites de liaison de haute affinité dans la gamme nanomolaire inférieure utilisant le glycane d’enveloppe sans domaine transmembranaire. Dans la présente étude, la liaison de la glycoprotéine de pointe (S) monomère multispécifique au coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est mesurée à K D = 18,6 μM par rapport à la nanomolaire KD à ces autres pointes virales, et via son domaine de liaison au récepteur dans la gamme molaire moyenne μ.

Une molécule CVN2L0 dimérique échangée de domaine est testée pour se lier à la région supérieure HA dans trois expériences SPR distinctes et l’affinité de liaison est présentée en valeurs KD. Le domaine B est supposé comprendre les sites de liaison H, qui sont affectés par le remplacement d’une liaison disulfure en résidus ioniques, et le domaine A forme L10,18. Les injections simples de CVN2L0 et les variantes V2 (trois ponts disulf...

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Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Le présent protocole décrit de nouveaux outils pour les tests de liaison SPR afin d’examiner la liaison CV-N à l’HA, à la glycoprotéine S, aux glycanes de type hybride apparentés et aux oligosaccharides à haute teneur en mannose. SPR est utilisé pour déterminer le KD pour lier le CV-N dimérique ou monomère à ces glycanes.

Ingénierie d’agents antiviraux par résonance plasmonique de surface

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

La spectroscopie de résonance plasmonique de surface a été établie pour la détermination du ligand protéique de manière à débit moyen. Différentes affinités pour les variantes de site de liaison de la même molécule sont présentées, notamment pour les oligosaccharides de haute liaison au fer sur les virus. SPR est une technique sans marquage pour étudier la liaison macromoléculaire en temps réel des récepteurs immobilisés en surface.Les interactions multicentriques sont reconnues dans l’analyse cinétique par liaison compétitive indépendamment de la taille de la Les domaines spécifiques de la recherche qui utilisent la SPR sont le développement de médicaments pour rechercher des inhibiteurs ou la caractérisation des anticorps. Les constantes cinétiques et les affinités sont directement calculées à partir de la réponse du capteur. Pour commencer, transférez 100 microlitres de la solution sur des plaques de LB-agar et étalez-la doucement à l’aide d’un épandeur de cellules stériles.Commencez une série de réactions d’échantillons en utilisant plusieurs concentrations de matrice d’ADN double brin allant de cinq à 50 nanogrammes tout en maintenant la concentration de l’amorce constante. Ensuite, ajoutez l’enzyme de restriction DpnI sous la couche d’huile minérale et incuber immédiatement à 37 degrés Celsius pendant une heure pour digérer l’ADN double brin superenroulé parental. Pour décongeler les cellules supercompétentes XL1-Blue, aliquote les cellules dans un petit tube de fond rond pré-refroidi.Ensuite, transférez un microlitre de l’ADN simple brin traité par DpnI de chaque réaction de contrôle et d’échantillon à des aliquotes séparées des cellules supercompétentes qui synthétisent le brin complémentaire. Après avoir soigneusement fait tourbillonner les réactions de transformation pour mélanger, incuber les réactions sur de la glace pendant 30 minutes. Appliquez une impulsion de chaleur aux réactions de transformation à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes, puis placez les réactions sur de la glace pendant deux minutes.Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de NZY + bouillon et incuber les réactions de transformation à 37 degrés Celsius avec agitation à 225 à 250 tr / min pendant une heure. Ensuite, plaquez le volume correct de chaque réaction de transformation sur des plaques de gélose à l’ampicilline LB comme démontré précédemment. Pour une culture de semences, inoculer une petite quantité de milieu LB contenant de l’ampicilline avec une seule colonie de la plaque transformée.En utilisant la culture de nuit, inoculer la culture d’expression avec des additifs, y compris 10 millimolaires de chlorure de magnésium, 10 millimolaires de sulfate de magnésium et 20 millimolaires de glucose, en diluant la culture de graines à une par 100. Ensuite, cultivez des cellules avec une agitation vigoureuse à 37 degrés Celsius à un absorbant de 600 nanomètres entre 0,4 et 0,6 avant de refroidir les cellules à 20 degrés Celsius et d’induire avec une IPTG millimolaire et de croître pendant la nuit. Ensuite, récoltez les cellules par centrifugation à 4 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant.Après remise en suspension de la pastille cellulaire dans un tampon salin tamponné au phosphate, refuge récent à 4 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez ensuite le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, remettez en suspension la pastille restante dans 10 millilitres de tampon de lyse et incuber la suspension pendant une heure à 37 degrés Celsius.Ensuite, séparez les fractions solubles et insolubles par centrifugation à 4 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. De plus, utilisez le gel d’affinité Ni2+Affinity HIS-Select dans des tubes de 14 millilitres pour lier et remettre en suspension sa cyanovirine-N exprimée par recombinaison marquée dans des solutions tampons contenant 20 millimolaires d’imidazole et 250 millimolaires d’imidazole, respectivement. Incuber par lots pendant au moins 30 minutes entre ces étapes.Ajout du tampon d’élution contenant 250 millimolaires imidazole à la protéine éluée. Transférer les solutions protéiques dans des tubes de centrifugation à l’aide d’un filtre de coupure Dalton de 10 kilos et les concentrer par centrifugation pendant 10 minutes à 4 500 g et quatre degrés Celsius. Ajouter le tampon courant SPR à un facteur de dilution de un à 10 et centrifuger quatre fois au volume initial pendant 10 minutes à 4 500 g et quatre degrés Celsius.Ensuite, déterminez la concentration de protéines à 280 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible NanoDrop basé sur le coefficient d’extinction calculé pour la protéine principale CVN2L0 montrant une taille de 23, 474 Dalton. Pour le système SPR à double canal, utilisez HBSCP plus comme tampon de fonctionnement, de l’acide chlorhydrique glycine 10 millimolaires de pH 1,5 à 1,6 comme tampon de régénération et allumez le dégazeur de l’instrument, l’échantillonneur automatique et la pompe. Ensuite, lavez l’ensemble du système avec de l’eau distillée double pendant une heure.Ensuite, déposez de l’huile d’immersion sur le détecteur et montez une puce de capteur en verre recouverte d’un mince film d’or. Et sur la face supérieure, fonctionnalisé avec de l’hydrogel de carboxyméthyl dextran directement sur le détecteur sous la cellule d’écoulement à trois ports. Ensuite, corrigez le réglage en tirant vers le bas la manipulation.Pour immobiliser les ligands protéiques sur les puces du capteur, ouvrez une table d’exécution en cliquant sur Formulaire dans la barre de menus et exécutez l’éditeur de tableau dans le logiciel de liaison automatique SPP intégré. Ensuite, choisissez et cliquez sur Immobilisation de base dans la liste des tables d’exécution disponibles et suivez les étapes de la procédure expérimentale sur l’écran de l’ordinateur. Ensuite, cliquez sur Sample Set Editor dans la section formulaire pour remplir la liste des réactifs pour deux racks placés dans l’échantillonneur automatique pour une analyse plus approfondie.Cliquez sur Autosampler Direct Control comme outil dans la barre de menus pour avancer ou ramener les racks à la maison et choisissez quatre degrés Celsius comme température de fonctionnement. Démarrez la pompe pour infuser de l’eau distillée double en cliquant sur Outils et commande directe de la pompe. Et enregistrez les données en cliquant sur SPR Instrument Direct Control.Et à chaque fois, commencez dans la fenêtre qui apparaît. Après avoir ajouté les réactifs de couplage dans des flacons de 300 microlitres, placez-les dans les racks d’échantillonneur automatique et démarrez la table d’exécution en cliquant sur Exécuter. Pour l’interaction protéine-protéine simple, après avoir rempli la pompe à 25 000 microlitres par minute, effectuez un ajustement de base pendant 30 secondes.Laisser procéder à l’ajustement de base suivant avec de l’eau distillée double pendant 1,5 minute avant d’éteindre la surface de la puce activée avec un chlorhydrate d’éthanolamine molaire, pH 8,5. Ensuite, passez les tubes de l’échantillonneur liquide au dégazeur de l’eau distillée double dans la bouteille avec HBS-EP + Cliquez sur Formulaire, faites défiler vers le bas et passez au post-traitement en cliquant sur ce mode de fonctionnement. Cliquez ensuite sur Ajouter pour sélectionner les courbes de liaison générées au fil du temps dans la plate-forme de données pour chaque cellule de flux et exporter la superposition sous forme de fichier d’épuration.Ensuite, cliquez sur Fichier pour ouvrir les options de sauvegarde du fichier et obtenir des courbes de réponse en alignant les courbes gauche et droite et en soustrayant les signaux du deuxième canal de référence de ceux du canal du ligand. Des injections uniques de CVN2L0 et de variance V2 et V5 ont d’abord été testées pour se lier à la puce du capteur couplé à l’hémagglutinine afin d’estimer les capacités de liaison à l’aide de l’échantillonneur automatique et de l’éditeur de table en cours d’exécution. Des injections répétées ont été automatisées à diverses concentrations dans la gamme nanomolaire et micromolaire du système au fil du temps, démontrant qu’aucune saturation à la surface de la puce ni liaison à l’équilibre n’a été atteinte.La concentration par rapport à la réponse a été tracée pour la liaison de type sauvage CVN au RBD, en supposant un ciblage spécifique des glucides éventuellement conservés sur la sous-unité RBD S1 avec une affinité plus faible ayant une constante de taux de dissociation de 260 micromoles. Le même tracé d’affinité pour la liaison CVN2L0-V4 au DM n’est plus analysable en raison du remplacement des liaisons disulfures qui interfèrent avec la liaison de haute affinité aux petits peptides glycosylés et donne une réponse plus élevée que la valeur maximale de réponse. La liaison de type sauvage CVN au RBD sur le SARS-CoV-2 montre une liaison à la protéine S et au RBD avec une constante de rage de dissociation de 18,6 micromoles et 260 micromoles, respectivement.Bien que la réponse SPR pour les concentrations d’analytes entraîne des unités de réponse élevées et des capteurs SPR typiques pour le type sauvage CVN et la liaison E41A. Cependant, le mutant est instable lorsqu’il est dilué. La biodétection SPR traite de la liaison à haute affinité et à faible affinité des protéines purifiées et de ses variantes aux ligands.Dans notre cas, les glycoprotéines exploitent la lecture optique et le système d’écoulement à double canal sur la surface de la puce du capteur. Le dosage immuno-enzymatique est une méthode immunologique alternative reconnaissant les épitopes protéiques, mais fournissant également des données sur la concentration de peptides et de petites molécules à partir de matrices complexes. Les tests de protéines exprimées par recombinaison par des tests de liaison SPR ont incorporé la biodétection des changements de confirmation, ce qui est utile pour la vérification et la prédiction de la stabilité des protéines par le côté protéique computationnel.

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