Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

המחבר מודה לד"ר כריסטיאן דרנטל מהמחלקה לביוטכנולוגיה ומיקרוביולוגיה ב- TU Wien והמחלקה לרפואה III, המחלקה לנפרולוגיה ודיאליזה באוניברסיטה הרפואית של וינה, במיוחד ד"ר מרקוס ורמן על תמיכה טכנית ומדעית. ביטוי חלבונים בתאי יונקים נתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה באוניברסיטה למשאבי טבע ומדעי החיים (BOKU) וינה. המחברת רוצה להביע את התודה העמוקה שלה לד"ר ניקו דנקבר מ- XanTec bioanalytics בדיסלדורף, גרמניה, על דיונים מדעיים מועילים על ביצוע מבחני הכריכה של SPR.

עבור המחקר הנוכחי, חלבון היתוך דמוי יוביקוויטין קטן (SUMO) של CVN שימש בבדיקות אימונוסורבנט הקשורות לאנזימים במקום CV-N והוא מתאים לבדיקות מבוססות תאים. שפעת רקומביננטית באורך מלא חלבון HA H3 מתקבל באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) או מבוטא בקווי תאים HEK293 של יונקים ובתאי חרקים נגועים ב-baculovirus...

זיקת הקשירה של CV-N מתואמת עם מספר אתרי הקישור הפונקציונליים [2H על דומיינים B, ו-2L על דומיינים A כאשר הם מהונדסים כדימר מוחלף דומיין]. גרסה עם זיקה מחייבת משתנה (CVN2L0-V2, קפל יציב הומודימרי של CV-N הכולל נוק-אאוט של גשר דיסולפיד) מתבטאת ב- E. coli, מטוהרת, ונבדקת חיובית לקשירת חלבון HA (H3N2) באמצעות SPR<su...

פעילות אנטי-ויראלית הקשורה לטתרין מושרית על ידי אינטרפרון-α, והיא מורכבת מקשירה מבוססת חלבון, מה שמוביל לשמירה של וירוסים שנוצרו במלואם על משטחי תאים נגועים1. הצורך בגליקוזילציה של טטרין בעיכוב שחרור הנגיף עדיין אינו ודאי, מה שמרמז על החשיבות של דפוסי גליקוזילציה על גליקנים המבוטאים באופן רקומביננטי עבור מחקרים במבחנה 1,2, אשר תלוי בקונפורמציה של (במקרה של נגיף שפעת) השפעת המגלוטינין HA 3,4 . צוין כי שינוי של אוליגוסכריד הקשור לגליקוזילציה הקשורה ל-N מספיק להגבלה בתיווך תרין של שחרור HIV מסוג 12, בעוד שדמריזציה ממלאת תפקיד חיוני במניעת שחרור הנגיף, ובכך מערבת את תחום הטרנס-ממברנה או גליקוזיל-פוספטידיל-אינוזיטול (GPI)-עוגן לקשירת הוויריונים הניצנים5 . תכונות ייחודיות מתוארות עבור טתרין אנושי ומורין כדי לחסום וירוסים עטופים מרובים, רטרו-וירוסים, ופילו-וירוסים. BST-2/tetherin הוא חלבון אנטי-ויראלי הניתן לאינטרפרון של מערכת החיסון המולדת1,6, הפועל עם פעילות אנטי-ויראלית רחבת טווח ונוגד אנטגוניזם על ידי גליקופרוטאינים מעטפת5 כדי לבצע טרנסלוקציה של טטרין או לשבש את המבנה של ת'רין 6. לדוגמה, גליקופרוטאין HA של מעטפת המבוטא על פני השטח ונוירמינידאז על נגיף שפעת A ידועים באנטגוניזם של טטרין באופן ספציפי לזן7, מה שמקל על זיהוי אתרי קשירת קולטן מארח8. נוגדנים המכוונים לגליקן נחקרים בסטויכיומטריה של יחסי הגומלין שלהם עם מגני הגליקן המותאמים אישית במהירות ב-HA, וכתוצאה מכך נוצרת זיקה לתת-סוגים שפעת A H3N2 ו-H1N14.
כדי להבהיר את מנגנוני הקשירה בין חומרים אנטי-ויראליים לבין קוצים במעטפת הנגיף, כלומר ליגנדות פחמימות, ושיטות אימונולוגיות וספקטרוסקופיות משלימות, מסונתזים כימית מונו, די-די-מנוז ותלת-מנוז. הפפטידים המנוזילים נוצרים באמצעות אזידו גליקוזילציה של גליקוזיל {בטא}-פראצטטים לטרנספורמציה של 1,2-טרנס גליקוזיל אזידים9, המחקה את ה-N-אצטיל גלוקוזאמין ואוליגוסכרידים עתירי מנוז על פני השטח של וירוסים מסכני חיים. ביואיזוסטרים של טריאזול משמשים לחיקויים של קישורים היוצרים את השאריות המנוזיליות של פפטיד HA10 ומאפשרים אינטראקציות ספציפיות לאתר עם נגזרות CV-N אנטי-ויראליות סביב נקודת הגליקוזילציה השנייה הקשורה ל-N בתחום ראש ה-HA (HA למעלה עם 4 גליקנים מקושרים N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . אינטראקציות בין חומצה גלוטמית (Glu) וארגינין (Arg) לבין דיפול הסליל שנוצר ביטאו יציבות טובה של פפטידי המודל ושל חלבונים, אך הן מוצגות באמצעות SPR. אם משווים אותו לזיהוי אתר גליקוזילציה מסונתז כימית יחיד ב-HA10 על ידי עיכוב ישיר של קשירת קולטן על הגליקן, הוכחה זיקה גבוהה יותר של מבנה Fc בעל מוטציה של ארבעה אתרים לקולטן שלו כמעוררת פונקציות אפקטים in vivo, וחושפת את ההרכב הלא קשור של גליקנים מקושרים N המחוברים למוטציה של Fc כדי לקבוע באופן מכניסטי13.
CV-N מציג פעילות אנטי-ויראלית נגד HIV 14,15, שפעת16 ונגיף האבולה, המתווך על ידי קשירת ננומולר לשינויים אוליגוסכרידיים עתירי מנוז על חלבוני ספייק מעטפת12,17,18,19. קשירת שפעת HA לאתר קשירת פחמימות אחד בעל זיקה גבוהה (H) ב-CV-N או בשני Hs ב-CVN2 דימרי מקושר קוולנטית נקבעת כבעלת קבועי דיסוציאציה של שיווי משקל (K D) = 5.7 ננומטר (איור 1A) ו-KD = 2.7 ננומטר, בהתאמה. גם CV-N וגם CVN2 מכילים עוד אתר אחד או שניים של קשירת פחמימות בעלות זיקה נמוכה (L)s 12,17,20,21. אבולה GP1,2 נקשר ל-2H של CVN2 עם זיקות בתחום הננומולרי התחתון (KD = 26 ננומטר). CV-N WT מחייב לאבולה GP1,2 ו- HA מציג זיקות מ- K D = 34 nM ל- KD = 5.7 nM (A / New York / 55/04)12. לקטינים, כגון CV-N, המכוונים באופן ספציפי לגליקנים עתירי מנוז על מעטפות הנגיף, מעכבים עוד יותר את השכפול של נגיף הפטיטיס C, SARS-CoV, נגיף ההרפס, נגיף מרבורג ונגיף החצבת22.
מולקולת CV-N הקטנה נחקרה ביסודיות במשך יותר מ-20 שנה, שכן היא מתפקדת כדי לקשור מגוון רחב של נגיפים כדי לעכב את כניסת הנגיף16,18. ניתוחים מבניים ומבחני זיקה מקשרים מצביעים על קישור צולב של שני Ls בדימר CVN2 שהוחלף על ידי קשירה דו-ערכית בטווח המיקרומולרי כדי להגביר את ההתלהבות לגליקופרוטאינים של מעטפת נגיפית10,19. קשירה סלקטיבית של Manα1-2Manα על זרועות Man(8) D1D3 ו-Man(9) כוללת שני אתרי קשירה בעלי זיקות שונות הממוקמים על פרוטומרים של חלבונים מנוגדים20, ובכך מגיעים לזיקות קשירה ננומולריות (איור 1B). לפיכך, CVN2 נחשב לנוגדן פסאודו בנוגע ליישומו לקשירת אפיטופים על HIV gp120, בדומה לנוגדנים מנטרלי וירוסים17. כאן, המחבר מעוניין לחקור את הקשירה הפוטנציאלית של CVN2 לספייק SARS-CoV-2 באמצעות תחום קשירת הקולטן שלו (RBD). עקומות קשירה של אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי משותק (ACE)-2 עם SARS-CoV-2 RBD התוצאה KD = 4.7 nM עבור אינטראקציה מחייבת רלוונטית ביולוגית זו23.
לעומת זאת, מחלקות אימונוגלובולינים נבחרות מזהות תבניות חלבונים מבניות ספציפיות ועקביות, המקנים מצע להבשלת זיקה באזורי HA24 המעוגנים בממברנה. CV-N מראה פעילות חזקה מאוד כמעט בכל נגיפי שפעת A ו-B16, והוא חומר אנטי-ויראלי המנטרל באופן נרחב. הידע שלנו אינו שלם על מיקומם של אפיטופים ממוקדים על הגבעול של HA1 ו-HA2 שעשויים לערב מבנים אפיטופיים למיקוד גליקן על ידי נוגדנים מנטרלים מאוד ובהשוואה לקשירת לקטין25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של בדיקת קשירת SPR עבור CV-N לקפיצות מעטפת הנגיף. (A) בדיקת SPR לקשירת CV-N לליגנד: חלבון HA באורך מלא (90 kDa). ערכת נתונים קינטית (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) המציגה כריכה כפולה בזמן אמת לשפעת HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 גרסה V2 נקשרת לליגנד DM משותק בטווח ריכוז של 500 ננומטר עד 16 מיקרומטר. רצף: שאריות L מודגשות בצהוב. שאריות H מודגשות באפור. E58 ו-R73 הם תחליף לציסטאינים בחלבון ה-wildtype והופכים את V2 לקפל חלבון יציב עם שלושה במקום ארבעה קשרים דיסולפידיים <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
בעוד שמגן הגליקן בחלק העליון של HA הדיסטלי של הממברנה גורם לקשירת זיקה גבוהה ל-CV-N 12, קשירת CVN2 ל-HA הסמוכה לגשר דיסולפיד של החלק העליון של HA נצפתה גם באתרי הזיקה הנמוכה שלו10,12. אינטראקציות קוטביות שונות ואתרי אינטראקציה מזוהים בקשירת פחמימות על ידי CV-N. אינטראקציות אלה מאומתות על ידי יצירת וריאנטים נוק-אאוט באתר הקשירה כדי לתאם זיקות קשירה לגליקוזילציה חזויה בסיליקו 12. לפיכך, הפרויקט שואף להשוות פפטידי HA שעברו מנוזילציה כימית שנבדקו בעבר בזיקה ובספציפיות מחייבת עם רצפי פפטידים קצרים מקוצים הקשורים לסארס 2019-nCoV ו- SARS-CoV-2, המתרחשים באופן טבעי על ידי מספר קטן של אתרי גליקוזילציה שונים המקושרים ל- N וגליקוזילציה מקושרת O. באמצעות מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים ומבחני קשירה, פינטו ועמיתיו מדווחים על נוגדן חד-שבטי, S309, שעשוי לזהות אפיטופ על חלבון ספייק SARS-CoV-2 המכיל גליקן שמור בתוך תת-הסוג Sarbecovirus, מבלי להתחרות בחיבור הקולטן26. הפרוטוקול של מחקר זה מתאר כיצד תכנון, הבעה ואפיון של וריאנטים של CV-N חשובים כדי לחקור כיצד CV-N ו-CVN2 נקשרים לחלבונים מסוכררים ולפפטידים מאנוסילטים סינתטיים באמצעות טכנולוגיית SPR10,12.
דימר CVN2L027 וגרסאות של אתר קשירה (V2-V5) מבוטאים באופן רקומביננטי וריאנטים הם עם תחליפי קשרים דיסולפידיים (C58E ו-C73R) (איור 2A). כמו כן, מוטציה עם מוטציה חד-נקודתית E41A מוכנה מכיוון שתנוחה זו נתפסה כשאריות של מגע צולב בין-מולקולרי. מוטציה זו היא מולקולה מעניינת נוספת למדידות קשירת SPR בין הלקטין לאוליגוסכרידים בעלי מנוז גבוה המפענחת תחומי קשירה ומאפשרת השוואה לצורה הדימרית. המבנה הגבישי המוחלף בתחום של CVN2 מראה מקשר גמיש, המשתרע בין 49 ל-54 שאריות. שני התחומים יכולים להמשיך לנוע סביב הציר כגופים קשיחים, ולפתח מונומר באמצעות אינטראקציות תחום תוך-מולקולריות (תחום A -שאריות 1-39;90-101- עם תחום B -שאריות 40-89) או דימר על ידי החלפת תחום בין-מולקולרי [תחום A (של המונומר הראשון) עם תחום B (של השני), ותחום B (של המונומר הראשון) עם תחום A (של העותק השני)]. אין אינטראקציות קרובות בין תחומי A ו-B של שני הפרוטומרים, למעט Glu4128. ניתן לפתח את הגן עבור CV-N בשיטת PCR חוזרת עם אוליגוס מסונתז 40-mer29 ולאחר מכן הוא משויך לאתרים NdeI ו- BamHI של pET11a לטרנספורמציה (אלקטרופורציה) לתאים אלקטרו-מוכשרים כפי שתואר על ידי Keeffe, J.R.27. החלבון, המשמש להשגת המבנה הגבישי המתאים (PDB ID 3S3Y), כולל תג טיהור N-terminal 6-histidine ואחריו אתר ביקוע פרוטאז פקטור Xa. מוטגנזה מכוונת אתר משמשת ליצירת מוטציות נקודתיות, להחלפת קודונים ולהוספה או מחיקה של בסיסים או קודונים בודדים או מרובים להחלפת חומצות אמינו. טרנספורמציות אלה מספקות תובנה שלא תסולא בפז לגבי תפקוד ומבנה החלבון. CV-N, CVN2 ו-CVN3 עם ביטוי רקומביננטי וטיהור רקומביננטי נחקרו היטב מבחינה ביופיזית20,21,27, הם זולים לייצור, ולכן משמשים לאפיון מבחני קשירה לגליקנים המשותקים על שבבי חיישן SPR. בדיקה חיסונית קונבנציונלית הקשורה לאנזים (ELISA) מספקת פחות יכולת שכפול בנוגע לטכניקת האימוביליזציה של ליגנדות גליקן והופכת קשירה בזמן אמת של גרסאות שונות של אתרי קשירה, המוצגת עבור SPR, למבחני נקודות קצה.
וריאנט זיקה מחייבת CVN2L0-V2 (קפל שלם של CV-N הומודימרי עם החלפת גשר דיסולפידית10) מבוטא בתג שלו ב-Escherichia coli (E. coli), מטוהר מעל עמודת Ni-NTA תוך שימוש בכרומטוגרפיית זיקה ונבדק לקשירת HA (H3N2), פפטיד HA-פפטיד מונומנוזילי ופפטיד דימנוזילי באמצעות SPR. פפטידים מנוזיליים כימית, או חלבון HA ו-S, כולם ליגנדים ואמינים המוצמד למשטח השבב ההידרופילי באמצעות אסטרים תגובתיים או הנדסת חלבונים ביוטין-סטרפטאווידין. אותו הליך של ריצות עוקבות מוחל על ליגנדות אלה, המזריקות דילולים שונים של CV-N וריאנטים של CV-N (ו- CVN2) כדי לקבל מידע קינטי עבור ניתוחי האינטראקציה המולקולרית כמתואר להלן30. שבב חיישן SPR משותק RBD משמש לקשירת מחקרים על פפטידי CV-N ל-S, והזיקות מושוות לקשירת SARS-CoV-2 עם ACE2 האנושי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

תהודת פלסמון פני השטח (SPR) משמשת למדידת קשירת המגלוטינין (HA) לדמיר ציאנובירין-N (CV-N) שהוחלף בתחום ולניטור אינטראקציות בין פפטידים מנוזילטים לבין אתר הקשירה בעל הזיקה הגבוהה של CV-N. דווח כי קוצים במעטפת הנגיף gp120, ha וגליקופרוטאין אבולה (GP) 1,2 קושרים אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה ונמוכה ב-CVN2 דימרי. פפטיד HA דימנוזילי קשור גם בשני אתרי הקישור בעלי הזיקה הנמוכה למולקולה מהונדסת של CVN2, הנושאת אתר זיקה גבוהה עבור הליגנד המתאים ועוברת מוטציה כדי להחליף קשר דיסולפיד מייצב בכיס קשירת הפחמימות, ובכך לאשר קשירה רב-ערכית. קשירת HA מוצגת לאתר קשירה אחד בעל זיקה גבוהה של פסאודו-נוגדנים CVN2 בקבוע דיסוציאציה (KD) של 275 ננומטר המנטרל עוד יותר את נגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) באמצעות אוליגומריזציה. קורלציה בין מספר הגשרים הדיסולפידים ב-CVN2 שהוחלפו בתחום, אשר מופחתים מ-4 ל-2 על-ידי החלפת ציסטינים בזוגות שאריות קוטביות של חומצה גלוטמית וארגינין, מביאה לירידה בזיקה ל-HA. בין האינטראקציות החזקות ביותר, אבולה GP1,2 קשורה על ידי CVN2 עם שני אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה בתחום הננומולרי התחתון באמצעות גליקן המעטפת ללא תחום טרנסממברנה. במחקר הנוכחי, קשירת CV-N מונומרי רב-ספציפי לתסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) גליקופרוטאין (S) נמדדת ב- K D = 18.6 μM בהשוואה לננומולאר KD לאותם קוצים אחרים בנגיף, ובאמצעות תחום קשירת הקולטן שלו בטווח הטוחנות האמצעיות μ.

מולקולת CVN2L0 שהוחלפה על-ידי תחום דימרי נבדקת להיקשרות לאזור העליון של HA בשלושה ניסויי SPR נפרדים, וזיקת הקישור מוצגת בערכיK D. ההנחה היא שתחום B כולל אתרי קשירה H, המושפעים מהחלפת קשר דיסולפיד בשאריות יוניות, ותחום A יוצר L10,18. הזרקות בודדות של CVN2L0 וגרסאות V2 (...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כלים חדשים למבחני קשירת SPR כדי לבחון קשירת CV-N ל-HA, גליקופרוטאין S, גליקנים היברידיים קשורים ואוליגוסכרידים עתירי מנוז. SPR משמש לקביעתK D לקשירת CV-N דימרי או מונומרי לגליקנים אלה.

הנדסת חומרים אנטי-ויראליים באמצעות תהודה פלסמונית על פני השטח

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

ספקטרוסקופיית תהודה של פלסמון פני השטח נקבעה לקביעת ליגנד חלבון באופן בעל תפוקה בינונית. מוצגות זיקות שונות לגרסאות אתר קשירה של אותה מולקולה, כלומר לאוליגוזכרידים הגבוהים הקושרים ברזל על וירוסים. SPR היא טכניקה נטולת תוויות לחקר קשירה מקרומולקולרית בזמן אמת של קולטנים משותקים על פני השטח.אינטראקציות מרובות אתרים מוכרות בניתוח הקינטי על ידי קשירה תחרותית ללא תלות בגודל האזורים הספציפיים במחקר המשתמשים ב- SPR הם פיתוח תרופות לחיפוש מעכבים או אפיון נוגדנים. קבועים קינטיים וזיקות מחושבים ישירות מתגובת החיישן. כדי להתחיל, להעביר 100 microliters של התמיסה על צלחות LB-agar ולהפיץ אותו בעדינות באמצעות מפזר תאים סטריליים.התחל סדרה של תגובות דגימה באמצעות ריכוזים מרובים של תבנית דנ"א דו-גדילי הנעים בין חמישה ל-50 ננוגרם תוך שמירה על ריכוז פריימר קבוע. לאחר מכן הוסיפו את אנזים ההגבלה DpnI מתחת לשכבת השמן המינרלי ודגרו מיד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לעיכול הדנ"א הדו-גדילי של ההורים. כדי להפשיר את התאים הסופר-מוכשרים XL1-Blue, יש להפשיר את התאים לצינור תחתון קטן ועגול מקורר מראש.לאחר מכן, העבר מיקרוליטר אחד של הדנ"א החד-גדילי שטופל ב-DpnI מכל תגובת בקרה ודגימה לאליקוטים נפרדים של התאים העל-טבעיים אשר מסנתזים את הגדיל המשלים. לאחר מערבולת תגובות הטרנספורמציה בזהירות כדי לערבב, לדגור את התגובות על הקרח במשך 30 דקות. יש להפעיל את דופק החום על תגובות הטרנספורמציה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ולאחר מכן להניח את התגובות על הקרח למשך שתי דקות.לאחר מכן הוסיפו 0.5 מיליליטר של מרק NZY+דגירה של תגובות הטרנספורמציה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-225 עד 250 סל"ד למשך שעה. לאחר מכן, צלחת את הנפח הנכון של כל תגובת טרנספורמציה על לוחות LB Ampicillin Agar כפי שהודגם קודם לכן. עבור תרבית זרעים, לחסן כמות קטנה של אמפיצילין המכיל מדיה LB עם מושבה אחת מן הצלחת מותמרת.באמצעות תרבית הלילה, לחסן את תרבות הביטוי עם תוספים הכוללים 10 מילימולאר של מגנזיום כלוריד, 10 מילימולאר של מגנזיום גופרתי, ו 20 מילימולאר של גלוקוז, דילול תרבית הזרעים לאחד על 100. לאחר מכן, לגדל תאים עם רעידות נמרצות ב 37 מעלות צלזיוס ל 600 ננומטר סופג בין 0.4 ל 0.6 לפני קירור התאים ל 20 מעלות צלזיוס ולגרום עם IPTG מילימולרי אחד ולגדול בן לילה. ואז לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.לאחר החייאת גלולת התא במאגר מלח חצוב פוספט, מקלט לאחרונה ב 4, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להשליך את supernatant עם פיפטה. לאחר מכן, להשעות את הכדור הנותר ב 10 מיליליטר של חיץ תזה לדגור את ההשעיה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן להפריד שברים מסיסים ובלתי מסיסים על ידי צנטריפוגה ב 4, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בנוסף, השתמש בג'ל HIS-Select Ni2+Affinity בצינורות של 14 מיליליטר כדי לקשור ולהשהות מחדש את הציאנובירין-N המתויג שלו המתויג באופן רקומביננטי בתמיסות חיץ עם 20 מילימולר אימידזול ו-250 מילימולאר אימידזול, בהתאמה. לדגור באצווה במשך 30 דקות לפחות בין השלבים האלה.הוספת חיץ אלוציה המכיל 250 מילימולאר אימידזול לחלבון אלוטי. מעבירים את תמיסות החלבון לצינורות צנטריפוגה באמצעות מסנן חיתוך דלתון במשקל 10 קילו ורוכזו אותן על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-4, 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס. הוסף חיץ פועל SPR למקדם דילול של 1 עד 10 וצנטריפוגה ארבע פעמים לנפח ההתחלתי במשך 10 דקות ב 4, 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, קבע את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop UV-Visible בהתבסס על ההכחדה המחושבת שהייתה יעילה עבור החלבון העיקרי CVN2L0 המציג גודל של 23, 474 דלתון. עבור מערכת SPR דו-ערוצית, השתמש ב- HBSCP plus כמאגר פועל, 10 מילימולר גליצין חומצה הידרוכלורית של pH 1.5 עד 1.6 כמאגר ההתחדשות והפעל את מכשיר degasser, autosampler ומשאבה. לאחר מכן לשטוף את כל המערכת עם מים מזוקקים כפולים במשך שעה אחת.לאחר מכן, הטילו שמן טבילה על הגלאי והרכיבו שבב חיישן זכוכית המצופה בסרט זהב דק. ובצד העליון, פונקציונלי עם קרבוקסימתיל דקסטרן הידרוג'ל ישירות על הגלאי מתחת לתא הזרימה בעל שלוש היציאות. לאחר מכן תקן את ההגדרה על ידי משיכת הטיפול כלפי מטה.כדי לשתק את הליגנדות החלבוניות לשבבי חיישן, פתח טבלת ריצה על ידי לחיצה על טופס בשורת התפריטים והפעל את עורך הטבלה בתוכנת הקישור האוטומטי המשולבת SPP. לאחר מכן בחר ולחץ על אימוביליזציה בסיסית מרשימת טבלאות ההפעלה הזמינות ובצע את השלבים של ההליך הניסויי על מסך המחשב. לאחר מכן, לחץ על עורך ערכת דוגמאות בקטע הטופס כדי למלא את רשימת הריאגנטים עבור שני ארונות תקשורת הממוקמים בדגימה האוטומטית לניתוח נוסף.לחץ על Autosampler Direct Control ככלי בשורת התפריטים כדי להביא את המדפים קדימה או אחורה הביתה ובחר ארבע מעלות צלזיוס כטמפרטורת ההפעלה. הפעל את המשאבה כדי להחדיר מים מזוקקים כפולים על ידי לחיצה על כלים ובקרה ישירה של המשאבה. ותעד נתונים על ידי לחיצה על שליטה ישירה במכשיר SPR.ובכל פעם, התחל בחלון החדש שהופיע. לאחר הוספת ריאגנטים צימוד בבקבוקונים של 300 מיקרוליטר, הכניסו אותם למדפי הדגימה האוטומטית והתחילו את שולחן ההפעלה על ידי לחיצה על Run. עבור אינטראקציה פשוטה חלבון-חלבון, לאחר מילוי המשאבה ב 25, 000 microliters לדקה, לבצע התאמה בסיסית במשך 30 שניות.אפשר את ההתאמה הבסיסית הבאה עם מים מזוקקים כפולים למשך 1.5 דקות לפני המרווה את משטח השבב המופעל עם אתנולמין הידרוכלוריד טוחן אחד, pH 8.5. לאחר מכן החלף את הצינורות מהדוגם הנוזלי לדגה ממים מזוקקים כפולים לבקבוק באמצעות HBS-EP+לחץ על טופס, גלול מטה ושנה ל- Post-Processing על ידי לחיצה על מצב פעולה זה. לאחר מכן לחץ על הוסף כדי לבחור עקומות קשירה שנוצרו לאורך זמן בפלטפורמת הנתונים עבור כל תא זרימה ולייצא את שכבת העל כקובץ סקרבר.לאחר מכן, לחץ על קובץ כדי לפתוח את אפשרויות שמירת הקבצים ולקבל עקומות תגובה על ידי יישור עקומות שמאל וימין והפחתת אותות של ערוץ הייחוס השני מאלו של ערוץ הליגנד. זריקות בודדות של CVN2L0 ושונות V2 ו-V5 נבדקו לראשונה לקשירת שבב החיישן המצומד haemagglutinin כדי להעריך את יכולות הקשירה באמצעות הדגימה האוטומטית ועורך טבלת הריצה. הזרקות חוזרות ונשנות היו אוטומטיות בריכוזים שונים בתחום הננומולאר והמיקרומולאר במערכת לאורך זמן והוכיחו כי לא הושגה רוויה על פני השבב או קשירת שיווי משקל.ריכוז לעומת תגובה תוכנן עבור קשירה מסוג בר CVN ל-RBD, בהנחה שמיקוד ספציפי של פחמימות עשויות להיות שמורות בתת-היחידה RBD S1 עם זיקה חלשה יותר עם קצב דיסוציאציה קבוע של 260 מיקרומולים. אותה עלילת זיקה לקשירת CVN2L0-V4 ל-DM הופכת לבלתי ניתנת עוד לניתוח עקב החלפת קשרי דיסולפיד המפריעים לקשירת זיקה גבוהה לפפטידים גליקוזילים קטנים ומניבים תגובה גבוהה מהערך המרבי של התגובה. קשירת CVN ל-RBD ב-SARS-CoV-2 מראה קשירה לחלבון S ול-RBD עם קבוע זעם דיסוציאציה של 18.6 מיקרומולים ו-260 מיקרומולים, בהתאמה.למרות שתגובת SPR עבור ריכוזי אנליטים גורמת ליחידות תגובה גבוהות ולחיישני SPR טיפוסיים עבור קשירת CVN מסוג פראי ו-E41A. עם זאת, המוטציה אינה יציבה כאשר היא מדוללת. ביוסנסינג SPR מטפל בקשירת זיקה גבוהה וזיקה נמוכה של חלבונים מטוהרים וריאנטים שלהם לליגנדים.במקרה שלנו, גליקופרוטאינים מנצלים את הקריאה האופטית ואת מערכת זרימת הערוצים הכפולה על משטח שבב החיישן. אנזים הוא בדיקה אימונוסורבנטית היא שיטה אימונולוגית חלופית המזהה אפיטופים של חלבונים אך גם מספקת נתונים על ריכוז פפטידים ומולקולות קטנות מתוך מטריצות מורכבות. בדיקת חלבונים המבוטאים באופן רקומביננטי על ידי מבחני קשירת SPR שילבה ביוסנסינג של שינויים מאשרים אשר שימושי לאימות וחיזוי יציבות החלבון על ידי צד חלבון חישובי.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Procedure for Lung Engineering

נוהל הנדסה ריאות

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

תהודה מגנטית elastography מתודולוגיה להערכת של רקמות מהונדסות צמיחה Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

הוספת בדיקות ביולוגיות Biosensors סיליקה אופטי באמצעות סוכני צימוד silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

כמותית סריג ניתוח (תהודת העברת אנרגית פורסטר) לקביעת SENP1 פרוטאז קינטיקס

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...