Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
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L'autore riconosce il Dr. Christian Derntl del Dipartimento di Biotecnologia e Microbiologia presso la TU Wien e il Dipartimento di Medicina III, Divisione di Nefrologia e Dialisi presso l'Università di Medicina di Vienna, in particolare il Dr. Markus Wahrmann per il supporto tecnico e scientifico. L'espressione proteica nelle cellule di mammifero è stata sostenuta dal Dipartimento di Biotecnologie dell'Università di Risorse Naturali e Scienze della Vita (BOKU) di Vienna. L'autrice vuole esprimere il suo profondo riconoscimento al Dr. Nico Dankbar di XanTec bioanalytics a Duesseldorf, in Germania, per utili discussioni scientifiche sull'esecuzione dei saggi di legame SPR.

Per il presente studio, una proteina di fusione CVN-small ubiquitina-like modifier (SUMO) è stata utilizzata nei saggi di immunoassorbimento enzimatico invece di CV-N ed è adatta per saggi basati su cellule. La proteina H3 ricombinante a lunghezza intera del virus dell'influenza A HA è ottenuta commercialmente (vedi tabella dei materiali) o espressa in linee cellulari HEK293 di mammiferi e cellule di insetti infettate da baculovirus secondo i protocolli standard12. La proteina ...

L'affinità di legame di CV-N è correlata al numero di siti di legame funzionali [2H sui domini B e 2L sui domini A quando progettati come dimero scambiati di dominio]. Una variante con un'alterata affinità di legame (CVN2L0-V2, una piega omodimerica stabile di CV-N comprendente un knock-out del ponte disolfuro) è espressa in E. coli, purificata e testata positivamente per il legame alla proteina HA (H3N2) usando SPR10, e mostra un cambiamento conformazionale dopo aver legato HA con si...

L'attività antivirale associata alla terina è indotta dall'interferone-α e comprende legami a base di proteine, che portano alla ritenzione di virioni completamente formati sulle superfici cellulari infette1. La necessità della glicosilazione della teterina nell'inibizione del rilascio del virus rimane incerta, il che implica l'importanza dei pattern di glicosilazione sui glicani espressi in modo ricombinante per gli studi in vitro 1,2, che dipende dalla conformazione dell'emoagglutinina HA 3,4 dell'influenza espressa in superficie (nel caso del virus dell'influenza) . È stato notato che la modifica dell'oligosaccaride legato alla glicosilazione legata all'N è sufficiente per la restrizione tetherin-mediata dell'HIV di tipo 1 rilascio2, mentre la dimerizzazione svolge un ruolo essenziale nel prevenire il rilascio del virus, coinvolgendo così il dominio transmembrana o l'ancora glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI) per legare i virioni in erba5 . Sono descritte caratteristiche uniche per il tetherin umano e murino per bloccare più virus, retrovirus e filovirus con involucro. BST-2/tetherin è una proteina antivirale inducibile dall'interferone dell'immunità innata1,6, che agisce con attività antivirale ad ampio spettro ed è antagonizzata dalle glicoproteine dell'involucro5 per traslocare tetherin o interrompere la struttura della tetherin 6. Ad esempio, la glicoproteina HA dell'involucro espressa in superficie e la neuraminidasi sul virus dell'influenza A sono ben note per l'antagonismo delle teterine in modo specifico del ceppo 7, facilitando il riconoscimento dei siti di legamedel recettore ospite8. Gli anticorpi mirati ai glicani sono studiati nella stechiometria delle loro interazioni con gli scudi glicani in rapida personalizzazione sull'HA, con conseguente affinità di legame con l'influenza A H3N2 e H1N1 sottotipi4.
Per chiarire i meccanismi di legame tra agenti antivirali e picchi di involucro virale, cioè ligandi di carboidrati, e metodi immunologici e spettroscopici complementari, vengono sintetizzate chimicamente porzioni mono-, di- e tri-mannosio. I peptidi mannosilati sono creati tramite glicosilazione azidica dei glicosil {beta}-peracetati alla trasformazione 1,2-trans glicosil azide9, imitando la N-acetil glucosamina e gli oligosaccaridi ad alto mannosio sulla superficie di virus potenzialmente letali. I bioisosteri triazolici sono utilizzati per imitare i legami che formano il residuo mannosilato del peptide HA10 e facilitare le interazioni sito-specifiche con i derivati antivirali CV-N attorno al secondo punto di glicosilazione N-linked sul dominio di testa dell'HA (HA top con 4 glicani N-linked N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Le interazioni tra acido glutammico (Glu) e arginina (Arg) e il dipolo dell'elica risultante hanno manifestato una buona stabilità sia dei peptidi modello che delle proteine, ma sono visualizzate utilizzando SPR. Se confrontato con il riconoscimento di un singolo sito di glicosilazione sintetizzato chimicamente su HA10 inibendo direttamente il legame del recettore sulle porzioni dei glicani, una maggiore affinità di una struttura Fc mutata a quattro siti al suo recettore è mostrata per suscitare funzioni effettrici in vivo, rivelando la composizione non correlata dei glicani N-linked attaccati al mutante Fc da determinare meccanicamente13.
CV-N mostra attività antivirale contro l'HIV 14,15, l'influenza16 e il virus Ebola, che è mediata dal legame nanomolare alle modificazioni oligosaccaridiche ad alto mannosio sulle proteine spike dell'involucro12,17,18,19. Il legame dell'influenza HA a un sito di legame dei carboidrati ad alta affinità (H) in CV-N o due H in CVN2 dimerico legato covalentemente è determinato per avere costanti di dissociazione all'equilibrio (K D) = 5,7 nM (Figura 1A) e KD = 2,7 nM, rispettivamente. Sia CV-N che CVN2 ospitano altri uno o due siti di legame dei carboidrati a bassa affinità (L) 12,17,20,21. Ebola GP1,2 si lega a 2H di CVN2 con affinità nell'intervallo nanomolare inferiore (KD = 26 nM). Il legame di CV-N WT a Ebola GP1,2 e HA mostra affinità da K D = 34 nM a KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Le lectine, come CV-N, che colpiscono specificamente i glicani ad alto mannosio sugli involucri virali, inibiscono ulteriormente la replicazione del virus dell'epatite C, SARS-CoV, herpesvirus, virus Marburg e virus del morbillo22.
La piccola molecola CV-N è stata studiata a fondo per più di 20 anni in quanto si funzionalizza per legare una vasta gamma di virus per inibire l'ingresso virale16,18. Analisi strutturali e saggi di affinità di legame indicano il cross-linking di due L in un dimero CVN2 scambiato di dominio mediante legame bivalente nell'intervallo micromolare per aumentare l'avidità alle glicoproteine dell'involucro virale10,19. Il legame selettivo di Manα1-2Manα sui bracci Man(8) D1D3 e Man(9) comprende due siti di legame di affinità diverse situati su protomeri proteici opposti20, raggiungendo così affinità di legame nanomolare (Figura 1B). Pertanto, CVN2 è considerato uno pseudo-anticorpo per quanto riguarda la sua applicazione per legare epitopi su HIV gp120, simile agli anticorpi neutralizzanti il virus17. Qui, l'autore è interessato a studiare il potenziale legame di CVN2 al picco SARS-CoV-2 attraverso il suo dominio di legame del recettore (RBD). Le curve di legame dell'enzima di conversione dell'angiotensina umana immobilizzata (ACE)-2 con il SARS-CoV-2 RBD danno come risultato KD = 4,7 nM per questa interazione di legame biologicamente rilevante23.
Al contrario, classi di immunoglobuline selezionate riconoscono modelli proteici strutturali specifici e coerenti, che conferiscono un substrato per la maturazione dell'affinità nelle regioni HA ancorate alla membrana24. CV-N mostra un'attività molto potente in quasi tutti i virus dell'influenza A e B16 ed è un agente antivirale ampiamente neutralizzante. Le nostre conoscenze sono incomplete sulla posizione di epitopi mirati sul gambo di HA1 e HA2 che potrebbero coinvolgere strutture epitopiche per il targeting dei glicani da anticorpi altamente neutralizzanti e rispetto al legame della lectina25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di legame SPR per CV-N ai picchi dell'involucro virale. (A) Saggio SPR per il legame CV-N al ligando: proteina a lunghezza intera HA (90 kDa). Set di dati cinetici (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) che mostrano in tempo reale il doppio legame con l'influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variante V2 che si lega al ligando immobilizzato DM entro un intervallo di concentrazione compreso tra 500 nM e 16 μM. Sequenza: i residui di L sono evidenziati in giallo. I residui di H sono evidenziati in grigio. E58 e R73 sono un sostituto delle cisteine nella proteina wildtype e rendono V2 una piega proteica stabile con tre invece di quattro legami disolfuro <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Mentre lo scudo glicano sulla parte superiore distale della membrana HA induce un legame ad alta affinità con CV-N 12, il legame CVN2 all'HA adiacente a un ponte disolfuro della parte superiore dell'HA è stato ulteriormente osservato nei suoi siti a bassa affinità10,12. Varie interazioni polari e siti di interazione sono identificati nel legame dei carboidrati da CV-N. Queste interazioni sono verificate generando varianti knock-out nel sito di legame per correlare le affinità di legame alla glicosilazione 12 prevista in silico. Pertanto, il progetto mira a confrontare peptidi HA mannosilati chimicamente precedentemente testati in affinità e specificità di legame con brevi sequenze peptidiche da picchi di 2019-nCoV correlati al SARS e SARS-CoV-2, presenti in natura modificati da un piccolo numero di diversi siti di glicosilazione N-linked e glicosilazione O-linked. Utilizzando la microscopia crioelettronica e saggi di legame, Pinto e collaboratori riportano un anticorpo monoclonale, S309, che potenzialmente riconosce un epitopo sulla proteina spike SARS-CoV-2 contenente un glicano conservato all'interno del sottogenere Sarbecovirus, senza competere con l'attaccamento del recettore26. Il protocollo di questo studio descrive come la progettazione, l'espressione e la caratterizzazione delle varianti di CV-N siano importanti per studiare come CV-N e CVN2 si legano alle proteine glicosilate e ai peptidi mannosilati sintetici utilizzando la tecnologia SPR10,12.
Il dimero legato al tandem CVN2L027 e le varianti del sito di legame (V2-V5) sono espressi in modo ricombinante e le varianti sono con sostituzioni del legame disolfuro (C58E e C73R) (Figura 2A). Inoltre, un mutante con una mutazione a punto singolo E41A è preparato perché questa posizione è stata vista come un residuo intermolecolare cross-contact. Questo mutante è un'altra molecola interessante per le misure di legame SPR tra la lectina e gli oligosaccaridi ad alto mannosio che decifra i domini di legame e consente il confronto con la forma dimerica. La struttura cristallina di CVN2 mostra un linker flessibile, che si estende tra 49 e 54 residui. I due domini possono continuare a muoversi attorno alla cerniera come corpi rigidi, sviluppando un monomero attraverso interazioni intramolecolari (dominio A -residui 1-39;90-101- con dominio B -residui 40-89) o un dimero mediante scambio di dominio intermolecolare [dominio A (del primo monomero) con dominio B (del secondo) e dominio B (del primo monomero) con dominio A (della seconda copia)]. Non ci sono interazioni strette tra i domini A e B dei due protomeri, ad eccezione di Glu4128. Il gene per CV-N può essere sviluppato utilizzando un metodo PCR ripetitivo con oligo sintetizzati 40-mer29 e viene quindi subclonato nei siti NdeI e BamHI di pET11a per la trasformazione (elettroporazione) in cellule elettrocompetenti come descritto da Keeffe, J.R.27. La proteina, che viene utilizzata per ottenere la rispettiva struttura cristallina (PDB ID 3S3Y), include un tag di purificazione N-terminale 6-istidina seguito da un sito di scissione della proteasi del fattore Xa. La mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per fare mutazioni puntiformi, cambiare codoni e inserire o eliminare basi o codoni singoli o multipli per lo scambio di amminoacidi. Queste trasformazioni forniscono informazioni preziose sulla funzione e la struttura delle proteine. CV-N, CVN2 e CVN3 espressi e purificati in modo ricombinante sono stati biofisicamente ben studiati20,21,27, sono economici da produrre e quindi utilizzati per caratterizzare saggi di legame ai glicani immobilizzati su chip di sensori SPR. Il saggio di immunoassorbimento enzimatico convenzionale (ELISA) fornisce una minore riproducibilità per quanto riguarda la tecnica di immobilizzazione dei ligandi glicani e trasforma il legame in tempo reale di varie varianti del sito di legame, che viene mostrato per SPR, in saggi endpoint.
La variante di affinità di legame CVN2L0-V2 (una piega intatta di CV-N omodimerico con una sostituzione del ponte disolfuro10) è espressa con un His-tag in Escherichia coli (E. coli), purificata su colonna Ni-NTA applicando cromatografia di affinità e testata per il legame con HA (H3N2), peptide HA monomannosilato e peptide HA dimannosilato usando SPR. I peptidi mannosilati chimicamente, o proteine HA e S, sono tutti ligandi e ammina accoppiati alla superficie del chip idrofilo tramite esteri reattivi o ingegneria proteica biotina-streptavidina. La stessa procedura di esecuzione sequenziale viene applicata a questi ligandi, iniettando varie diluizioni di CV-N e varianti di CV-N (e CVN2) per ottenere informazioni cinetiche per le analisi di interazione molecolare come descritto di seguito30. Il chip sensore SPR immobilizzato RBD viene utilizzato per studi di legame sui peptidi CV-N a S e le affinità vengono confrontate con il legame SARS-CoV-2 con l'ACE2 umano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

La risonanza plasmonica di superficie (SPR) viene utilizzata per misurare il legame dell'emoagglutinina (HA) al dimero di cianovirina-N (CV-N) scambiato di dominio e per monitorare le interazioni tra peptidi mannosilati e sito di legame ad alta affinità di CV-N. I picchi dell'involucro virale gp120, HA e glicoproteina di Ebola (GP) 1,2 sono stati segnalati per legare entrambi i siti di legame ad alta e bassa affinità su CVN2 dimerico. Il peptide HA dimannosilato è anche legato nei due siti di legame a bassa affinità a una molecola ingegnerizzata di CVN2, che porta un sito ad alta affinità per il rispettivo ligando e muta per sostituire un legame disolfuro stabilizzante nella tasca di legame dei carboidrati, confermando così il legame multivalente. Il legame con l'HA è mostrato in un sito di legame ad alta affinità dello pseudo-anticorpo CVN2 a una costante di dissociazione (KD) di 275 nM che neutralizza ulteriormente il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) attraverso l'oligomerizzazione. Correlando il numero di ponti disolfuro in CVN2 scambiati di dominio, che sono diminuiti da 4 a 2 sostituendo le cistine in coppie di residui polari di acido glutammico e arginina, si ottiene una ridotta affinità di legame con l'HA. Tra le interazioni più forti, Ebola GP1,2 è legato da CVN2 con due siti di legame ad alta affinità nell'intervallo nanomolare inferiore utilizzando il glicano dell'involucro senza un dominio transmembrana. Nel presente studio, il legame della glicoproteina monomerica multispecifica CV-N alla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) è misurato a K D = 18,6 μM rispetto al nanomolare KD a quegli altri picchi virali e attraverso il suo dominio di legame del recettore nell'intervallo medio-μ-molare.

Una molecola CVN2L0 scambiata di dominio dimerico viene testata per il legame alla regione superiore dell'HA in tre esperimenti SPR separati e l'affinità di legame è presentata in valori KD. Si presume che il dominio B comprenda siti di legame H, che sono influenzati dalla sostituzione di un legame disolfuro in residui ionici, e il dominio A forma L10,18. Le singole iniezioni di CVN2L0 e delle varianti V2 (tre ponti disolfuro) e V5 (due ponti disolfu...

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Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Il presente protocollo descrive nuovi strumenti per i saggi di legame SPR per esaminare il legame CV-N a HA, glicoproteina S, glicani di tipo ibrido correlati e oligosaccaridi ad alto mannosio. SPR è usato per determinare il KD per legare CV-N dimerico o monomerico a questi glicani.

Ingegneria di agenti antivirali tramite risonanza plasmonica di superficie

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

La spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie è stata stabilita per la determinazione del ligando proteico in modo a media produttività. Sono presentate diverse affinità per le varianti del sito di legame della stessa molecola, in particolare per gli oligosaccaridi ferro-leganti ad alta maniere sui virus. SPR è una tecnica label-free per studiare in tempo reale il legame macromolecolare dei recettori immobilizzati di superficie.Le interazioni multisito sono riconosciute nell'analisi cinetica mediante legame competitivo indipendentemente dalle dimensioni del Le aree specifiche nella ricerca che utilizzano SPR sono lo sviluppo di farmaci per la ricerca di inibitori o caratterizzazione anticorpale. Le costanti cinetiche e le affinità sono calcolate direttamente dalla risposta del sensore. Per iniziare, trasferire 100 microlitri della soluzione su piastre di agar LB e distribuirla delicatamente utilizzando uno spargitore di cellule sterili.Avviare una serie di reazioni campione utilizzando concentrazioni multiple di DNA a doppio filamento che vanno da cinque a 50 nanogrammi mantenendo costante la concentrazione del primer. Quindi aggiungere l'enzima di restrizione DpnI sotto la sovrapposizione di olio minerale e incubare immediatamente a 37 gradi Celsius per un'ora per digerire il DNA a doppio filamento superarrotolato parentale. Per scongelare le cellule supercompetenti XL1-Blue, aliquotare le cellule in un piccolo tubo inferiore rotondo pre-raffreddato.Successivamente, trasferire un microlitro di DNA a singolo filamento trattato con DpnI da ciascuna reazione di controllo e campione ad aliquote separate delle cellule supercompetenti che sintetizzano il filamento complementare. Dopo aver ruotato attentamente le reazioni di trasformazione per mescolare, incubare le reazioni sul ghiaccio per 30 minuti. Applicare un impulso di calore alle reazioni di trasformazione a 42 gradi Celsius per 45 secondi, quindi posizionare le reazioni sul ghiaccio per due minuti.Quindi aggiungere 0,5 millilitri di NZY+Brodo e incubare le reazioni di trasformazione a 37 gradi Celsius agitando a 225-250 RPM per un'ora. Successivamente, placcare il volume corretto di ciascuna reazione di trasformazione sulle piastre di Agar dell'ampicillina LB come dimostrato in precedenza. Per una coltura di semi, inoculare una piccola quantità di ampicillina contenente LB media con una singola colonia dalla piastra trasformata.Utilizzando la coltura durante la notte, inoculare la coltura di espressione con additivi tra cui 10 millimolari di cloruro di magnesio, 10 millimolari di solfato di magnesio e 20 millimolari di glucosio, diluendo la coltura di semi a uno per 100. Successivamente, far crescere le cellule con un vigoroso scuotimento a 37 gradi Celsius a un assorbente di 600 nanometri tra 0,4 e 0,6 prima di raffreddare le cellule a 20 gradi Celsius e indurre con un IPTG millimolare e crescere durante la notte. Quindi raccogliere le cellule centrifugando a 4.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.Dopo aver risospeso il pellet cellulare in tampone salino tamponato fosfato, recente rifugio a 4.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi scartare il surnatante con una pipetta. Quindi, risospendere il pellet rimanente in 10 millilitri di tampone di lisi e incubare la sospensione per un'ora a 37 gradi Celsius.Quindi separare le frazioni solubili e insolubili mediante centrifugazione a 4.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Inoltre, utilizzare HIS-Select Ni2 + Affinity Gel in tubi da 14 millilitri per legare e risospendere la sua cianovirina-N espressa in modo ricombinante marcata in soluzioni tampone con 20 millimolari imidazolo e 250 millimolari imidazolo, rispettivamente. Incubare in batch per almeno 30 minuti tra questi passaggi.Aggiungere il tampone di eluizione contenente 250 millimolari di imidazolo alla proteina eluita. Trasferire le soluzioni proteiche in provette di centrifugazione con un filtro Dalton da 10 kg e concentrarle centrifugando per 10 minuti a 4.500 g e quattro gradi Celsius. Aggiungere il tampone di corsa SPR a un fattore di diluizione da uno a 10 e centrifugare quattro volte al volume iniziale per 10 minuti a 4.500 g e quattro gradi Celsius.Successivamente, determinare la concentrazione proteica a 280 nanometri utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile NanoDrop basato sul coefficiente di estinzione calcolato per la proteina principale CVN2L0 che mostra una dimensione di 23.474 Dalton. Per il sistema SPR a doppio canale, utilizzare HBSCP plus come tampone di funzionamento, acido cloridrico glicina 10 millimolari di pH da 1,5 a 1,6 come tampone di rigenerazione e accendere il degasatore dello strumento, l'autocampionatore e la pompa. Quindi lavare l'intero sistema con acqua distillata due volte per un'ora.Quindi, far cadere l'olio ad immersione sul rilevatore e montare un chip sensore di vetro rivestito con una sottile pellicola dorata. E sul lato superiore, funzionalizzato con carbossimetildegrato destrano idrogel direttamente sul rivelatore sotto la cella di flusso a tre porte. Quindi fissare l'impostazione tirando verso il basso la gestione.Per immobilizzare i ligandi proteici ai chip del sensore, aprire una tabella di esecuzione facendo clic su Modulo nella barra dei menu ed eseguire l'editor della tabella nel software di collegamento automatico SPP integrato. Quindi scegliere e fare clic su Immobilizzazione di base dall'elenco delle tabelle di esecuzione disponibili e seguire i passaggi della procedura sperimentale sullo schermo del computer. Quindi, fare clic su Sample Set Editor nella sezione del modulo per compilare l'elenco dei reagenti per due rack posizionati nell'autocampionatore per ulteriori analisi.Fare clic su Controllo diretto autocampionatore come strumento nella barra dei menu per portare i rack avanti o indietro a casa e scegliere quattro gradi Celsius come temperatura operativa. Avviare la pompa per infondere acqua bidistillata facendo clic su strumenti e controllo diretto della pompa. E registra i dati facendo clic su SPR Instrument Direct Control.E ogni volta, inizia nella finestra appena apparsa. Dopo aver aggiunto i reagenti di accoppiamento in flaconcini da 300 microlitri, inserirli nei rack dell'autocampionatore e avviare la tabella di esecuzione facendo clic su Esegui. Per la semplice interazione proteina-proteina, dopo aver riempito nuovamente la pompa a 25.000 microlitri al minuto, eseguire la regolazione della linea di base per 30 secondi.Attendere la successiva regolazione della linea di base con acqua distillata doppia per 1,5 minuti prima di spegnere la superficie del chip attivato con un molare etanolammina cloridrato, pH 8,5. Quindi passare i tubi dal campionatore liquido al degasatore dall'acqua bidistillata nella bottiglia con HBS-EP + Click on Form, scorrere verso il basso e passare a Post-Processing facendo clic su questa modalità operativa. Quindi fare clic su Aggiungi per selezionare le curve di binding generate nel tempo nella piattaforma dati per ciascuna cella di flusso ed esportare la sovrapposizione come file di scrub.Quindi, fare clic su File per aprire le opzioni di salvataggio del file e ottenere curve di risposta allineando le curve sinistra e destra e sottraendo i segnali del secondo canale di riferimento da quelli del canale ligando. Le singole iniezioni di CVN2L0 e varianza V2 e V5 sono state testate per la prima volta per il legame al chip del sensore accoppiato all'emoagglutinina per stimare le capacità di legame utilizzando l'autocampionatore e l'editor della tabella di esecuzione. Le iniezioni ripetute sono state automatizzate a varie concentrazioni nell'intervallo nanomolare e micromolare nel sistema nel tempo, dimostrando che non è stata raggiunta alcuna saturazione sulla superficie del chip né alcun legame di equilibrio.La concentrazione rispetto alla risposta è stata tracciata per il legame wild-type CVN a RBD, assumendo un targeting specifico di carboidrati possibilmente conservati sulla subunità RBD S1 con affinità più debole avente una costante di velocità di dissociazione di 260 micromoli. Lo stesso grafico di affinità per il legame di CVN2L0-V4 al DM diventa non più analizzabile a causa della sostituzione dei legami disolfuro che interferiscono con il legame ad alta affinità a piccoli peptidi glicosilati e produce una risposta superiore al valore massimo di risposta. Il legame di tipo selvatico CVN a RBD su SARS-CoV-2 mostra un legame alla proteina S e RBD con una costante di rabbia di dissociazione di 18,6 micromoli e 260 micromoli, rispettivamente.Sebbene la risposta SPR per le concentrazioni di analita si traduca in unità ad alta risposta e sensorigrammi SPR tipici per CVN wild-type e legame E41A. Tuttavia, il mutante è instabile quando diluito. Il biorilevamento SPR sta affrontando il legame ad alta e bassa affinità delle proteine purificate e delle sue varianti ai ligandi.Nel nostro caso, glicoproteine che sfruttano la lettura ottica e il sistema di flusso a doppio canale sulla superficie del chip del sensore. Il saggio immunoassorbente dell'enzima è un metodo immunologico alternativo che riconosce gli epitopi proteici ma fornisce anche dati sulla concentrazione di peptidi e piccole molecole da matrici complesse. Il test delle proteine espresse in modo ricombinante mediante saggi di legame SPR ha incorporato il biorilevamento dei cambiamenti di conferma che è utile per la verifica e la previsione della stabilità delle proteine dal lato proteico computazionale.

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