Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Forfatteren anerkjenner Dr. Christian Derntl fra Institutt for bioteknologi og mikrobiologi ved TU Wien og Institutt for medisin III, Divisjon for nefrologi og dialyse ved Det medisinske universitetet i Wien, spesielt Dr. Markus Wahrmann for teknisk og vitenskapelig støtte. Proteinuttrykk i pattedyrceller ble støttet av Institutt for bioteknologi ved Universitetet for naturressurser og biovitenskap (BOKU) Wien. Forfatteren ønsker å uttrykke sin dype anerkjennelse til Dr. Nico Dankbar fra XanTec bioanalyse i Düsseldorf, Tyskland, for nyttige vitenskapelige diskusjoner om å utføre SPR-bindingsanalysene.

For denne studien har et CVN-lite ubiquitinlignende modifikator (SUMO) fusjonsprotein blitt brukt i enzymbundne immunosorbentanalyser i stedet for CV-N og er egnet for cellebaserte analyser. Rekombinant full lengde influensa A-virus HA H3-protein oppnås kommersielt (se materialtabell) eller uttrykkes i pattedyrs HEK293-cellelinjer og baculovirusinfiserte insektceller i henhold til standardprotokoller12. Wuhan-1 spikeprotein uttrykkes i pattedyr HEK293-celler. Syntesen av monomann...

CV-Ns bindingsaffinitet er korrelert med antall funksjonelle bindingssteder [2H på domener B, og 2L på domene(r) A når de konstrueres som domenebyttede dimer]. En variant med endret bindingsaffinitet (CVN2L0-V2, en homodimer stabil fold av CV-N som består av en disulfidbro knock-out) uttrykkes i E. coli, renset og positivt testet for binding til HA-protein (H3N2) ved bruk av SPR10, og viser en konformasjonsendring ved binding av HA med enten H eller L karbohydratbindende steder og K<s...

Tetherin-assosiert antiviral aktivitet induseres av interferon-α, og den består av proteinbaserte tethers, som fører til oppbevaring av fullt dannede virioner på infiserte celleoverflater1. Nødvendigheten av tetheringlykosylering ved hemming av virusfrigjøring er fortsatt usikker, noe som antyder betydningen av glykosyleringsmønstre på rekombinant uttrykte glykaner for in vitro-studier 1,2, som avhenger av konformasjonen av (i tilfelle influensavirus) overflateuttrykt influensa hemagglutinin HA 3,4 . Det har blitt bemerket at modifisering av oligosakkarid bundet til N-bundet glykosylering er nok for tetherinmediert begrensning av HIV type-1-frigjøring2, mens dimerisering spiller en viktig rolle i å forhindre virusfrigivelse, og derved involverer transmembrandomenet eller glykosylfosfatidyl-inositol (GPI) -anker for tethering av spirende virioner5 . Unike funksjoner er beskrevet for humant og murine tetherin for å blokkere flere innkapslede virus, retrovirus og filovirus. BST-2 / tetherin er et interferoninduserbart antiviralt protein av den medfødte immuniteten1,6, som virker med bredspektret antiviral aktivitet og motvirkes av konvoluttglykoproteiner5 for enten å translokere tetherin eller forstyrre strukturen av tetherin 6. For eksempel er overflate-uttrykt konvoluttglykoprotein HA og neuraminidase på influensa A-virus kjent for tetherinantagonisme på en stammespesifikk måte7, noe som letter anerkjennelsen av vertsreseptorbindingssteder8. Glykanmålrettede antistoffer studeres i støkiometrien av deres interaksjoner med de raskt tilpassede glykanskjoldene på HA, noe som resulterer i bindingsaffinitet til influensa A H3N2 og H1N1 subtyper4.
For å belyse bindingsmekanismene mellom antivirale midler og viruskonvoluttpigger, dvs. karbohydratligander, og komplementære immunologiske og spektroskopiske metoder, syntetiseres mono-, di- og tri-mannose-deler kjemisk. De mannosylerte peptidene dannes via azidoglykosylering av glykosyler {beta}-peracetater til 1,2-trans glykosylazider transformasjon9, som etterligner de typisk funnet N-acetylglukosamin og høymannose oligosakkarider på overflaten av livstruende virus. Triazolbioisostere brukes til å etterligne koblinger som danner mannosylert rest av HA-peptid10 og letter stedsspesifikke interaksjoner med antivirale CV-N-derivater rundt det andre N-koblede glykosyleringspunktet på HA-hodedomenet (HA-topp med 4 N-bundne glykaner N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Interaksjoner mellom glutaminsyre (Glu) og arginin (Arg) og den resulterende helix-dipolen manifesterte god stabilitet av både modellpeptider og proteiner, men visualiseres ved hjelp av SPR. Hvis sammenlignet med å gjenkjenne et enkelt kjemisk syntetisert glykosyleringssted på HA10 ved direkte å hemme reseptorbinding på glykandelene, vises en høyere affinitet av en fire-site mutert Fc-struktur til reseptoren for å fremkalle effektorfunksjoner in vivo, og avslører den ikke-relaterte sammensetningen av N-bundne glykaner festet til Fc-mutanten for å være mekanistisk bestemt13.
CV-N viser antiviral aktivitet mot HIV 14,15, influensa16 og Ebola-virus, som er mediert av nanomolar binding til oligosakkaridmodifikasjoner med høy mannose på konvoluttpiggproteiner12,17,18,19. Influensa HA-binding til ett karbohydratbindende sted med høy affinitet (H) i CV-N eller to Hs i kovalent koblet dimerisk CVN2 er bestemt til å ha likevektsdissosiasjonskonstanter (K D) = henholdsvis 5,7 nM (figur 1A) og KD = 2,7 nM. Både CV-N og CVN2 har en eller to karbohydratbindende steder med lav affinitet (L) s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 binder seg til 2H CVN2 med affiniteter i det nedre nanomolare området (KD = 26 nM). CV-N WT binding til Ebola GP1,2 og HA viser slektskap fra K D = 34 nM til KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Lektiner, som CV-N, som spesifikt retter seg mot høymannoseglykaner på virushylsene, hemmer ytterligere replikasjon av hepatitt C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus og meslingvirus22.
Det lille CV-N-molekylet har blitt studert grundig i mer enn 20 år, da det funksjonaliserer for å binde et bredt spekter av virus for å hemme viral oppføring16,18. Strukturelle analyser og bindingsaffinitetsanalyser indikerer kryssbinding av to L-er i en domenebyttet CVN2-dimer ved bivalent binding i mikromolarområdet for å øke aviditeten til virale konvoluttglykoproteiner10,19. Selektiv binding av Manα1-2Manα på Man(8) D1D3-armer og Man(9) består av to bindingssteder med forskjellig affinitet lokalisert på motsatte proteinprotomerer20, og når dermed nanomolære bindingsaffiniteter (figur 1B). CVN2 anses således som et pseudoantistoff angående dets anvendelse for å binde epitoper på HIV gp120, i likhet med virusnøytraliserende antistoffer17. Her er forfatteren interessert i å undersøke den potensielle bindingen av CVN2 til SARS-CoV-2-piggen via sitt reseptorbindende domene (RBD). Bindingskurver for immobilisert humant angiotensinkonverterende enzym (ACE)-2 med SARS-CoV-2 RBD resulterer i KD = 4,7 nM for denne biologisk relevante bindingsinteraksjonen23.
Derimot gjenkjenner utvalgte immunglobulinklasser spesifikke og konsistente strukturelle proteinmønstre, som gir et substrat for affinitetsmodning i de membranforankrede HA-regionene24. CV-N viser svært potent aktivitet i nesten alle influensa A- og B-virus16, og det er et bredt nøytraliserende antiviralt middel. Vår kunnskap er ufullstendig på plasseringen av målrettede epitoper på stammen av HA1 og HA2 som muligens involverer epitopiske strukturer for glykanmålretting av svært nøytraliserende antistoffer og sammenlignet med lektinbinding25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> Figur 1: Skjematisk fremstilling av SPR-bindingsanalysen for CV-N til viruskonvoluttpigger. (A) SPR-analyse for CV-N-binding til ligand: HA protein i full lengde (90 kDa). Kinetisk datasett (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) som viser dobbeltreferert binding i sanntid til influensa HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variant V2 binding til immobilisert ligand DM innenfor et konsentrasjonsområde på 500 nM til 16 μM. Sekvens: L-rester er uthevet i gult. H-rester er uthevet i grått. E58 og R73 er en erstatning for cysteiner i wildtypeproteinet og gjør V2 til en stabil proteinfold med tre i stedet for fire disulfidbindinger <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Mens glykanskjoldet på den membrandistale HA-toppdelen induserer høy affinitetsbinding til CV-N 12, har CVN2-binding til HA ved siden av en disulfidbro av HA-toppdelen videre blitt observert på lavaffinitetsstedene10,12. Ulike polare interaksjoner og interaksjonssteder identifiseres i karbohydratbinding ved CV-N. Disse interaksjonene verifiseres ved å generere knock-out-varianter i bindingsstedet for å korrelere bindingsaffiniteter til in silico predikert glykosylering12. Prosjektet tar derfor sikte på å sammenligne tidligere testede kjemisk mannosylerte HA-peptider i bindingsaffinitet og spesifisitet med korte peptidsekvenser fra SARS-relaterte 2019-nCoV-pigger og SARS-CoV-2, naturlig forekommende modifisert av et lite antall forskjellige N-bundne glykosyleringssteder og O-bundet glykosylering. Ved hjelp av kryo-elektronmikroskopi og bindingsanalyser rapporterer Pinto og kolleger et monoklonalt antistoff, S309, som potensielt gjenkjenner en epitop på SARS-CoV-2-piggprotein som inneholder et konservert glykan i Sarbecovirus-underslekten, uten å konkurrere med reseptorvedlegg26. Protokollen i denne studien beskriver hvordan design, uttrykk og karakterisering av CV-N-varianter er viktig for å studere hvordan CV-N og CVN2 binder seg til glykosylerte proteiner og syntetiske mannosylerte peptider ved hjelp av SPR-teknologien10,12.
Tandemkoblede dimer CVN2L027 og bindingsstedsvarianter (V2-V5) uttrykkes rekombinant og varianter er med disulfidbindingserstatninger (C58E og C73R) (figur 2A). Også en mutant med en enkeltpunktsmutasjon E41A er forberedt fordi denne posisjonen har blitt sett på som en intermolekylær krysskontaktrest. Denne mutanten er et annet interessant molekyl for SPR-bindingsmålinger mellom lektin- og høymannoseoligosakkarider som dechiffrerer bindingsdomener og tillater sammenligning med den dimeriske formen. Den domenebyttede krystallstrukturen til CVN2 viser en fleksibel kobling, som strekker seg mellom 49 og 54 rester. De to domenene kan fortsette å bevege seg rundt hengslet som stive legemer, og utvikle enten en monomer gjennom intramolekylære domeneinteraksjoner (domene A -rester 1-39;90-101- med domene B -rester 40-89) eller en dimer ved intermolekylær domenebytte [domene A (av den første monomeren) med domene B (av den andre), og domene B (av den første monomeren) med domene A (av den andre kopien)]. Det er ingen nære interaksjoner mellom de to protomerenes A- og B-domener, bortsett fra Glu4128. Genet for CV-N kan utvikles ved hjelp av en repeterende PCR-metode med 40-mer syntetiserte oligoer29 og blir deretter subklonert inn i NdeI- og BamHI-stedene til pET11a for transformasjon (elektroporering) til elektrokompetente celler som beskrevet av Keeffe, JR.27. Proteinet, som brukes til å oppnå den respektive krystallstrukturen (PDB ID 3S3Y), inkluderer en N-terminal 6-histidinrensingskode etterfulgt av et Faktor Xa proteasespaltningssted. Site-rettet mutagenese brukes til å lage punktmutasjoner, bytte kodoner og sette inn eller slette enkle eller flere baser eller kodoner for aminosyreutveksling. Disse transformasjonene gir uvurderlig innsikt i proteinfunksjon og struktur. Rekombinant uttrykt og renset CV-N, CVN2 og CVN3 har blitt biofysisk godt studert20,21,27, er billige å produsere, og brukes derfor til å karakterisere bindingsanalyser til glykaner immobilisert på SPR-sensorbrikker. Konvensjonell enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) gir mindre reproduserbarhet angående immobiliseringsteknikken til glykanligander og forvandler sanntidsbinding av forskjellige bindingsstedsvarianter, som er vist for SPR, til endepunktanalyser.
Bindingsaffinitetsvarianten CVN2L0-V2 (en intakt fold av homodimer CV-N med en disulfidbrosubstitusjon10) uttrykkes med en His-tag i Escherichia coli (E. coli), renset over Ni-NTA-kolonnen ved bruk av affinitetskromatografi og testet for binding til HA (H3N2), monomannosylert HA-peptid og dimannosylert HA-peptid ved bruk av SPR. Kjemisk mannosylerte peptider, eller HA- og S-protein, er alle ligander og amin koblet til den hydrofile chipoverflaten via reaktive estere eller biotin-streptavidin protein engineering. Den samme prosedyren for sekvensielle løp brukes på disse ligandene, injisering av forskjellige fortynninger av CV-N og varianter av CV-N (og CVN2) for å oppnå kinetisk informasjon for molekylære interaksjonsanalyser som beskrevet nedenfor30. RBD-immobilisert SPR-sensorbrikke brukes til bindingsstudier på CV-N til S-peptider, og affiniteter sammenlignes med SARS-CoV-2-binding med human ACE2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

Overflateplasmonresonans (SPR) brukes til å måle hemagglutinin (HA) binding til domenebyttet Cyanovirin-N (CV-N) dimer og for å overvåke interaksjoner mellom mannosylerte peptider og CV-Ns bindingssted for høy affinitet. Viruskonvoluttpigger gp120, HA og Ebola glykoprotein (GP) 1,2 har blitt rapportert å binde både høy- og lavaffinitetsbindingssteder på dimerisk CVN2. Dimannosylert HA-peptid er også bundet på de to bindingsstedene med lav affinitet til et konstruert molekyl av CVN2, som bærer et høyaffinitetssted for den respektive liganden og mutert for å erstatte en stabiliserende disulfidbinding i karbohydratbindende lomme, og bekrefter dermed multivalent binding. HA-binding er vist til ett bindingssted med høy affinitet av pseudoantistoff CVN2 ved en dissosiasjonskonstant (KD) på 275 nM som ytterligere nøytraliserer humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) gjennom oligomerisering. Korrelering av antall disulfidbroer i domenebyttet CVN2, som reduseres fra 4 til 2 ved å erstatte cystiner i polare restpar av glutaminsyre og arginin, resulterer i redusert bindingsaffinitet til HA. Blant de sterkeste interaksjonene er Ebola GP1,2 bundet av CVN2 med to bindingssteder med høy affinitet i det nedre nanomolare området ved bruk av konvoluttglykanet uten transmembrandomene. I denne studien måles binding av det multispesifikke monomere CV-N til alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glykoprotein ved K D = 18,6 μM sammenlignet med nanomolar KD til de andre virustoppene, og via dets reseptorbindende domene i midten av μ-molare området.

Et dimerisk domenebyttet CVN2L0-molekyl testes for binding til HA-toppregionen i tre separate SPR-eksperimenter, og bindingsaffinitet presenteres i KD-verdier. Domene B antas å omfatte H-bindende steder, som påvirkes ved å erstatte en disulfidbinding i ioniske rester, og domene A danner L10,18. Enkeltinjeksjoner av CVN2L0 og variantene V2 (tre disulfidbroer) og V5 (to disulfidbroer) testes først for binding til den HA-koblede sensorbrikken for å e...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Denne protokollen beskriver nye verktøy for SPR-bindingsanalyser for å undersøke CV-N-binding til HA, S-glykoprotein, relaterte hybrid-type glykaner og oligosakkarider med høy mannose. SPR brukes til å bestemme KD for binding av enten dimerisk eller monomer CV-N til disse glykanene.

Tekniske antivirale midler via overflateplasmonresonans

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

Overflateplasmonresonansspektroskopi er etablert for bestemmelse av proteinligand på en middels gjennomstrømningsmåte. Ulike affiniteter for bindingsstedsvarianter av samme molekyl presenteres, nemlig for jernbindende oligosakkarider på virus. SPR er en etikettfri teknikk for å studere sanntids makromolekylær binding av overflate immobiliserte reseptorer.Multisite interaksjoner er anerkjent i kinetisk analyse ved konkurransedyktig binding uavhengig av størrelsen på Spesifikke områder i forskning som bruker SPR er legemiddelutvikling for å søke etter hemmere eller antistoffkarakterisering. Kinetiske konstanter og affiniteter beregnes direkte fra sensorresponsen. For å begynne, overfør 100 mikroliter av løsningen på LB-agarplater og spred den forsiktig ved hjelp av en steril cellespreder.Start en serie prøvereaksjoner ved å bruke flere konsentrasjoner av dobbeltstrenget DNA-mal som spenner fra fem til 50 nanogram, samtidig som primerkonsentrasjonen holdes konstant. Deretter legger du til DpnI-restriksjonsenzymet under mineraloljeoverlegget og inkuberer umiddelbart ved 37 grader Celsius i en time for å fordøye foreldrenes supercoiled dobbeltstrengede DNA. For å tine XL1-Blue Supercompetent Cells, aliquot cellene til et forkjølt, lite, rundt bunnrør.Deretter overfører du en mikroliter av DpnI-behandlet enkeltstrenget DNA fra hver kontroll og prøvereaksjon til separate aliquots av superkompetente celler som syntetiserer komplementærstrengen. Etter å ha virvlet transformasjonsreaksjonene forsiktig for å blande, inkuber reaksjonene på is i 30 minutter. Påfør varmepuls på transformasjonsreaksjonene ved 42 grader Celsius i 45 sekunder og legg deretter reaksjonene på is i to minutter.Tilsett deretter 0,5 milliliter NZY + Broth og inkuber transformasjonsreaksjonene ved 37 grader Celsius med risting ved 225 til 250 RPM i en time. Etterpå, plate riktig volum av hver transformasjonsreaksjon på LB Ampicillin Agar plater som vist tidligere. For en frøkultur, inokulere en liten mengde ampicillin som inneholder LB-medier med en enkelt koloni fra den transformerte platen.Ved hjelp av nattkulturen inokulerer du uttrykkskulturen med tilsetningsstoffer, inkludert 10 millimolare magnesiumklorid, 10 millimolar magnesiumsulfat og 20 millimolar glukose, og fortynner frøkulturen til en med 100. Deretter vokser celler med kraftig risting ved 37 grader Celsius til en absorberende 600 nanometer mellom 0,4 og 0,6 før avkjøling av cellene til 20 grader Celsius og induserer med en millimolar IPTG og vokser over natten. Høst deretter cellene ved sentrifuging ved 4.000 g i 15 minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten.Etter resuspending av cellepelleten i fosfatbufret saltvannsbuffer, nylig tilflukt ved 4.000 g i 15 minutter ved fire grader Celsius. Kast deretter supernatanten med en pipette. Deretter resuspenderer den gjenværende pelleten i 10 milliliter lysisbuffer og inkuberer suspensjonen i en time ved 37 grader Celsius.Deretter separeres oppløselige og uoppløselige fraksjoner ved sentrifugering ved 4.000 g i 15 minutter ved fire grader Celsius. I tillegg bruker du HIS-Select Ni2 + Affinity Gel i 14 milliliter rør for å binde og resuspendere hans merkede rekombinant uttrykt cyanovirin-N i bufferløsninger med henholdsvis 20 millimolar imidazol og 250 millimolar imidazol. Inkuber i batch i minst 30 minutter mellom disse trinnene.Tilsetning av elueringsbuffer inneholdende 250 millimolar imidazol til eluere protein. Overfør proteinløsningene til sentrifugeringsrør med et 10 kilo Dalton cutoff-filter og konsentrer dem ved sentrifuging i 10 minutter ved 4.500 g og fire grader Celsius. Legg SPR løpende buffer til en fortynningsfaktor på en til 10 og sentrifuger fire ganger til startvolumet i 10 minutter ved 4.500 g og fire grader Celsius.Etterpå bestemmer du proteinkonsentrasjonen ved 280 nanometer ved hjelp av et NanoDrop UV-synlig spektrofotometer basert på den beregnede utryddelsen som er koeffektiv for hovedproteinet CVN2L0 som viser en størrelse på 23.474 Dalton. For det tokanals SPR-systemet, bruk HBSCP plus som kjørebuffer, 10 millimolar glycinsaltsyre av pH 1,5 til 1,6 som regenereringsbuffer og slå på instrumentavgasseren, autosampleren og pumpen. Vask deretter hele systemet med dobbelt destillert vann i en time.Deretter slipper du nedsenkningsolje på detektoren og monterer en glasssensorbrikke belagt med en tynn gullfilm. Og på oversiden, funksjonalisert med karboksymetyl dextran hydrogel direkte på detektoren under tre-port strømningscellen. Fest deretter innstillingen ved å trekke ned håndteringen.For å immobilisere proteinligandene til sensorbrikker, åpne en løpetabell ved å klikke på Skjema i menylinjen og kjør tabellredigerer i den integrerte SPP-programvaren for automatisk kobling. Velg deretter og klikk på Grunnleggende immobilisering fra listen over tilgjengelige kjøretabeller og følg trinnene i den eksperimentelle prosedyren på dataskjermen. Deretter klikker du på Sample Set Editor i skjemadelen for å fylle ut reagenslisten for to stativer plassert i autosampleren for videre analyse.Klikk på Autosampler Direct Control som et verktøy i menylinjen for å få stativene frem eller hjem, og velg fire grader Celsius som driftstemperatur. Start pumpen for å infisere dobbelt destillert vann ved å klikke på verktøy og pumpe direkte kontroll. Og registrer data ved å klikke på SPR Instrument Direct Control.Og hver gang, start i det nylig viste vinduet. Etter å ha tilsatt koblingsreagensene i 300 mikroliter hetteglass, legg dem i autosampler-stativene og start løpetabellen ved å klikke på Kjør. For den enkle protein-protein-interaksjonen, etter påfylling av pumpen ved 25.000 mikroliter per minutt, utfør grunnlinjejustering i 30 sekunder.Tillat etterfølgende baseline justering med dobbelt destillert vann i 1,5 minutter før du slukker den aktiverte chipoverflaten med en molar etanolaminhydroklorid, pH 8,5. Bytt deretter rørene fra væskeprøvetakeren til lufteren fra dobbelt destillert vann inn i flasken med HBS-EP + Klikk på skjema, bla ned og bytt til etterbehandling ved å klikke på denne driftsmodusen. Klikk deretter på Legg til for å velge bindingskurver generert over tid i dataplattformen for hver flytcelle og eksporter overlegget som en scrubberfil.Deretter klikker du på Fil for å åpne fillagringsalternativene og få responskurver ved å justere venstre og høyre kurver og trekke signaler fra den andre referansekanalen fra ligandkanalen. Enkeltinjeksjoner av CVN2L0 og varians V2 og V5 ble først testet for binding til den hemagglutinkoblede sensorbrikken for å estimere bindingskapasitet ved hjelp av autosampler og løpende tabellredigerer. Gjentatte injeksjoner ble automatisert ved forskjellige konsentrasjoner i nanomolært og mikromolært område i systemet over tid, noe som viser at ingen metning på chipoverflaten eller likevektsbinding ble oppnådd.Konsentrasjon versus respons ble plottet for CVN villtypebinding til RBD, forutsatt spesifikk målretting av muligens konserverte karbohydrater på RBD S1-underenheten med svakere affinitet med en dissosiasjonshastighetskonstant på 260 mikromol. Det samme affinitetsplottet for CVN2L0-V4-binding til DM blir ikke lenger analyserbart på grunn av erstatning av disulfidbindinger som forstyrrer høy affinitetsbinding til små glykosylerte peptider og gir en høyere respons enn respons maksimal verdi. CVN wild-type binding til RBD på SARS-CoV-2 viser binding til S-protein og RBD med en dissosiasjonsraserikonstant på henholdsvis 18,6 mikromol og 260 mikromol.Selv om SPR-respons for analyttkonsentrasjoner resulterer i høye responsenheter og typiske SPR-sensorgrammer for CVN-villtype og E41A-binding. Mutanten er imidlertid ustabil når den fortynnes. SPR-biosensing adresserer høy affinitet og lavaffinitetsbinding av rensede proteiner og dets varianter til ligander.I vårt tilfelle utnytter glykoproteiner optisk avlesning og tokanals strømningssystem på sensorbrikkeoverflaten. Enzym som immunosorbentanalyse er en alternativ immunologisk metode som gjenkjenner proteinepitoper, men gir også data om konsentrasjonen av peptider og små molekyler ut av komplekse matriser. Testing av rekombinant uttrykte proteiner ved SPR-bindingsanalyser innlemmet biosensing av bekreftende endringer som er nyttig for verifisering og prediksjon av proteinstabilitet ved beregningsproteinside.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance Elastography Metodikk for vurdering av Tissue Engineered Construct Vekst

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Feste Biologiske Sonder til Silica Optiske Biosensorer Bruke silane kopling agenter

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse for SENP1 Protease Kinetics Bestemmelse

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillær Force Litografi for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Egenrapportering Stillaser for 3-dimensjonal Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

ECM Protein Nanofibers og nanostrukturer Engineered Bruke Surface-initiert Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Overflaten Potential Måling av bakterier ved hjelp av Kelvin Probe Force Mikros

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering ved Intrinsic vaskularisering i en<em&gt; I Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...