Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

O autor reconhece o Dr. Christian Derntl do Departamento de Biotecnologia e Microbiologia da TU Wien e do Departamento de Medicina III, Divisão de Nefrologia e Diálise da Universidade Médica de Viena, especialmente o Dr. Markus Wahrmann para apoio técnico e científico. A expressão de proteínas em células de mamíferos foi apoiada pelo Departamento de Biotecnologia da Universidade de Recursos Naturais e Ciências da Vida (BOKU) de Viena. A autora quer expressar seu profundo reconhecimento ao Dr. Nico Dankbar, da XanTec bioanalytics em Duesseldorf, Alemanha, por discussões científicas úteis sobre a realização dos ensaios de vinculação SPR.

Para o presente estudo, uma proteína de fusão modificadora semelhante à ubiquitina (SUMO) CVN foi usada em ensaios de imunoabsorção enzimática em vez de CV-N e é adequada para ensaios baseados em células. A proteína recombinante de comprimento total do vírus da gripe A HA H3 é obtida comercialmente (ver Tabela de Materiais) ou expressa em linhagens celulares HEK293 de mamíferos e células de insetos infectadas por baculovírus de acordo com protocolos padrão12. A prot...

A afinidade de ligação do CV-N está correlacionada com o número de sites de ligação funcionais [2H nos domínios B e 2L no(s) domínio(s) A, quando projetados como dímero trocado por domínio]. Uma variante com uma afinidade de ligação alterada (CVN2L0-V2, uma prega estável homodimérica de CV-N compreendendo um knock-out de ponte dissulfeto) é expressa em E. coli, purificada e testada positivamente para ligação à proteína HA (H3N2) usando SPR10, e mostra uma mudança confo...

A atividade antiviral associada à tetherin é induzida por α interferon, e compreende amarras à base de proteínas, que levam à retenção de virions totalmente formados em superfícies celulares infectadas1. A necessidade de glicosilação por amarrina na inibição da liberação do vírus permanece incerta, implicando a importância dos padrões de glicosilação em glicanos expressos recombinantemente para estudos in vitro 1,2, o que depende da conformação de (no caso do vírus da gripe) hemaglutinina da gripe expressa superficialmente 3,4 . Observou-se que a modificação do oligossacarídeo amarrado à glicosilação ligada a N é suficiente para a restrição mediada por teia da liberação do HIV tipo 12, enquanto a dimerização desempenha um papel essencial na prevenção da liberação do vírus, envolvendo assim o domínio transmembrana ou a âncora glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) para amarrar os virions em brotamento5 . Características exclusivas são descritas para a amarrina humana e murina para bloquear vários vírus envelopados, retrovírus e filovírus. A BST-2/tetherin é uma proteína antiviral induzível por interferon da imunidade inata1,6, atuando com atividade antiviral de amplo espectro e é antagonizada pelas glicoproteínasdo envelope 5 para translocar a tetherin ou interromper a estrutura da tetherin 6. Por exemplo, a glicoproteína HA do envelope expresso superficialmente e a neuraminidase no vírus influenza A são bem conhecidas pelo antagonismo da teina de maneira específica da cepa7, facilitando o reconhecimento dos locais de ligação do receptor hospedeiro8. Os anticorpos direcionados ao glicano são estudados na estequiometria de suas interações com os escudos glicanos de rápida personalização no AH, resultando em afinidade de ligação aos subtipos 4 H3N2 e H1N1da influenza A.
Para elucidar os mecanismos de ligação entre agentes antivirais e picos de envelope de vírus, ou seja, ligantes de carboidratos e métodos imunológicos e espectroscópicos complementares, metades mono, di- e tri-manose são sintetizadas quimicamente. Os peptídeos manosilados, são criados via glicosilação azida de glicosil {beta}-peracetato para a transformação de azidas de glicosila 1,2-trans9, imitando a N-acetilglucosamina tipicamente encontrada e oligossacarídeos de alto manose na superfície de vírus com risco de vida. Os bioisósteros triazólicos são utilizados para imitar ligações que formam o resíduo manosilado do peptídeo HA10 e facilitar interações site-specific com derivados antivirais CV-N em torno do segundo ponto de glicosilação ligado a N no domínio da cabeça de AH (topo de AH com 4 glicanos ligados a N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . As interações entre o ácido glutâmico (Glu) e a arginina (Arg) e o dipolo de hélice resultante manifestaram boa estabilidade de ambos os peptídeos modelo e proteínas, mas são visualizadas usando SPR. Se comparado com o reconhecimento de um único sítio de glicosilação quimicamente sintetizado no HA10, inibindo diretamente a ligação do receptor nas metades de glicano, uma maior afinidade de uma estrutura Fc mutada de quatro locais ao seu receptor é mostrada para provocar funções efetoras in vivo, revelando a composição não relacionada de glicanos ligados a N ligados ao mutante Fc a ser determinada mecanicamente13.
O CV-N apresenta atividade antiviral contra o HIV 14,15, influenza16 e vírus Ebola, que é mediada pela ligação nanomolar a modificações de oligossacarídeos de alta manose em proteínas spike do envelope12,17,18,19. Determina-se que a ligação do AH influenza a um sítio de ligação a carboidratos (H) de alta afinidade em CV-N ou dois Hs em CVN2 dimérico covalentemente ligado tem constantes de dissociação de equilíbrio (K D) = 5,7 nM (Figura 1A) e KD = 2,7 nM, respectivamente. Tanto o CV-N quanto o CVN2 abrigam outro um ou dois sítios de ligação a carboidratos (L) de baixa afinidade 12,17,20,21. O Ebola GP1,2 liga-se a 2H de CVN2 com afinidades na faixa nanomolar inferior (KD = 26 nM). A CV-N WT vinculando-se ao Ebola GP1,2 e HA apresenta afinidades de K D = 34 nM a KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. As lectinas, como a CV-N, que visam especificamente glicanos de alta manose nos envelopes virais, inibem ainda mais a replicação do vírus da hepatite C, SARS-CoV, herpesvírus, vírus de Marburg e vírus do sarampo22.
A pequena molécula CV-N tem sido estudada minuciosamente há mais de 20 anos, pois se funcionaliza para se ligar a uma ampla gama de vírus para inibir a entrada viral16,18. Análises estruturais e ensaios de afinidade de ligação indicam reticulação de dois Ls em um dímero CVN2 trocado por domínio por ligação bivalente na faixa micromolar para aumentar a avidez às glicoproteínas do envelope viral10,19. A ligação seletiva de Manα1-2Manα nos braços D1D3 de Man(8) e Man(9) compreende dois locais de ligação de diferentes afinidades localizados em protômeros de proteínas opostas20, alcançando, assim, afinidades de ligação nanomolar (Figura 1B). Assim, o CVN2 é considerado um pseudo-anticorpo quanto à sua aplicação para ligar epítopos na gp120 do HIV, semelhante aos anticorpos neutralizantes do vírus17. Neste documento, o autor está interessado em investigar a potencial ligação do CVN2 ao pico do SARS-CoV-2 através do seu domínio de ligação ao receptor (RBD). Curvas de ligação da enzima conversora de angiotensina humana imobilizada (ECA)-2 com o SARS-CoV-2 RBD resultam em KD = 4,7 nM para essa interação de ligação biologicamente relevante23.
Por outro lado, classes selecionadas de imunoglobulinas reconhecem padrões proteicos estruturais específicos e consistentes, que conferem um substrato para a maturação por afinidade nas regiões de AH ancoradas na membrana24. O CV-N mostra atividade altamente potente em quase todos os vírus influenza A e B16, sendo um agente antiviral amplamente neutralizante. Nosso conhecimento é incompleto sobre a localização de epítopos direcionados no caule de HA1 e HA2 que possivelmente envolvem estruturas epitópicas para direcionamento de glicano por anticorpos altamente neutralizantes e em comparação com a ligação àlectina 25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do ensaio de ligação SPR para CV-N a espículas de envelope de vírus. (A) Ensaio SPR para ligação de CV-N ao ligante: proteína de comprimento total HA (90 kDa). Conjunto de dados cinéticos (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) mostrando ligação duplamente referenciada em tempo real à influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) Ligação da variante V2 do CVN2L0 ao ligante imobilizado DM dentro de uma faixa de concentração de 500 nM a 16 μM. Sequência: Os resíduos de L são destacados em amarelo. Os resíduos de H são destacados em cinza. E58 e R73 são um substituto para cisteínas na proteína selvagem e fazem da V2 uma dobra proteica estável com três em vez de quatro ligações <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">dissulfeto Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Enquanto o escudo glicano na parte superior do AH membrana-distal induz uma ligação de alta afinidade ao CV-N 12, a ligação do CVN2 ao AH adjacente a uma ponte dissulfeto da parte superior do AH tem sido observada em seus locais de baixa afinidade10,12. Várias interações polares e locais de interação são identificados na ligação a carboidratos pelo CV-N. Essas interações são verificadas por meio da geração de variantes knock-out no sítio de ligação para correlacionar afinidades de ligação com a glicosilação predita in silico 12. Assim, o projeto visa comparar peptídeos HA quimicamente manosilados previamente testados em afinidade e especificidade de ligação com sequências peptídicas curtas de picos de 2019-nCoV relacionados ao SARS e SARS-CoV-2, ocorrendo naturalmente modificados por um pequeno número de diferentes locais de glicosilação ligados a N e glicosilação ligada a O. Usando microscopia crioeletrônica e ensaios de ligação, Pinto e colaboradores relatam um anticorpo monoclonal, S309, que potencialmente reconhece um epítopo na proteína spike SARS-CoV-2 contendo um glicano conservado dentro do subgênero Sarbecovirus, sem competir com a ligação do receptor26. O protocolo deste estudo descreve como projetar, expressar e caracterizar variantes de CV-N são importantes para estudar como CV-N e CVN2 se ligam a proteínas glicosiladas e peptídeos manosilados sintéticos utilizando a tecnologia SPR10,12.
O dímero ligado a tandem CVN2L027 e as variantes de local de ligação (V2-V5) são expressas de forma recombinante e as variantes estão com substituições de ligação dissulfeto (C58E e C73R) (Figura 2A). Além disso, um mutante com uma mutação de ponto único E41A é preparado porque esta posição tem sido vista como um resíduo de contato cruzado intermolecular. Este mutante é outra molécula interessante para medições de ligação SPR entre a lectina e oligossacarídeos de alta manose decifrando domínios de ligação e permite a comparação com a forma dimérica. A estrutura cristalina trocada por domínio do CVN2 mostra um ligador flexível, que se estende entre 49 e 54 resíduos. Os dois domínios podem continuar se movendo ao redor da dobradiça como corpos rígidos, desenvolvendo um monômero através de interações de domínio intramolecular (domínio A -resíduos 1-39;90-101- com domínio B -resíduos 40-89) ou um dímero por troca de domínio intermolecular [domínio A (do primeiro monômero) com domínio B (do segundo) e domínio B (do primeiro monômero) com domínio A (da segunda cópia)]. Não há interações próximas entre os domínios A e B dos dois protômeros, com exceção de Glu4128. O gene para CV-N pode ser desenvolvido usando um método de PCR repetitivo com oligossintetizados 40-mer 29 e é então subclonado nos sítios NdeI e BamHI de pET11a para transformação (eletroporação) em células eletrocompetentes, conforme descrito por Keeffe, J.R.27. A proteína, que é usada para alcançar a respectiva estrutura cristalina (PDB ID 3S3Y), inclui uma etiqueta de purificação N-terminal de 6 histidinas seguida por um local de clivagem da protease do Fator Xa. A mutagênese dirigida ao local é utilizada para fazer mutações pontuais, alternar códons e inserir ou excluir bases ou códons únicos ou múltiplos para troca de aminoácidos. Essas transformações fornecem informações inestimáveis sobre a função e a estrutura das proteínas. CV-N, CVN2 e CVN3 recombinantemente expressos e purificados têm sido biofisicamente bem estudados20,21,27, são de baixa produção e, portanto, utilizados para caracterizar ensaios de ligação a glicanos imobilizados em chips de sensor SPR. O ensaio imunoenzimático convencional (ELISA) fornece menor reprodutibilidade em relação à técnica de imobilização de ligantes de glicano e transforma a ligação em tempo real de várias variantes do local de ligação, o que é mostrado para SPR, em ensaios de desfecho.
A variante de afinidade de ligação CVN2L0-V2 (uma dobra intacta de CV-N homodimérico com uma substituição de ponte dissulfeto10) é expressa com uma etiqueta His-em Escherichia coli (E. coli), purificada sobre a coluna Ni-NTA aplicando cromatografia de afinidade e testada quanto à ligação a HA (H3N2), peptídeo HA monomanisílico e peptídeo HA dimanosilado usando SPR. Peptídeos quimicamente manosilados, ou proteínas HA e S, todos são ligantes e amina acoplados à superfície do chip hidrofílico através de ésteres reativos ou engenharia de proteínas de biotina-estreptavidina. O mesmo procedimento de corridas sequenciais é aplicado a esses ligantes, injetando várias diluições de CV-N e variantes de CV-N (e CVN2) para obter informações cinéticas para as análises de interação molecular, conforme descrito abaixo30. O chip sensor SPR imobilizado por RBD é usado para estudos de ligação de peptídeos CV-N a S, e as afinidades são comparadas à ligação do SARS-CoV-2 com a ACE2 humana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

A ressonância plasmônica de superfície (SPR) é usada para medir a ligação da hemaglutinina (HA) ao dímero de cianovirina-N (CV-N) trocado por domínio e para monitorar interações entre peptídeos manosilados e o local de ligação de alta afinidade do CV-N. Foram relatados picos de envelope de vírus gp120, HA e glicoproteína (GP) de Ebola (GP) 1,2 para se ligar a locais de ligação de alta e baixa afinidade na CVN2 dimérica. O peptídeo HA dimanosilado também está ligado nos dois locais de ligação de baixa afinidade a uma molécula modificada de CVN2, que está carregando um local de alta afinidade para o respectivo ligante e mutado para substituir uma ligação dissulfeto estabilizadora na bolsa de ligação de carboidratos, confirmando assim a ligação multivalente. A ligação ao AH é mostrada a um local de ligação de alta afinidade do pseudo-anticorpo CVN2 em uma constante de dissociação (KD) de 275 nM que neutraliza ainda mais o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) através da oligomerização. A correlação do número de pontes dissulfeto na CVN2 trocada por domínio, que é diminuída de 4 para 2 pela substituição de cistinas em pares de resíduos polares de ácido glutâmico e arginina, resulta em afinidade de ligação reduzida ao AH. Entre as interações mais fortes, o Ebola GP1,2 é ligado por CVN2 com dois locais de ligação de alta afinidade na faixa nanomolar inferior usando o glicano de envelope sem um domínio transmembrana. No presente estudo, a ligação da glicoproteína spike (S) monomérica multiespecífica CV-N à glicoproteína spike (S) do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) é medida em K D = 18,6 μM em comparação com a KD nanomolar para esses outros picos de vírus, e através de seu domínio de ligação ao receptor na faixa μ molar média.

Uma molécula CVN2L0 trocada por domínio dimérico é testada para ligação à região superior do AH em três experimentos SPR separados e a afinidade de ligação é apresentada em valores de KD. Assume-se que o domínio B compreende sítios de ligação H, que são impactados pela substituição de uma ligação dissulfeto em resíduos iônicos, e o domínio A forma L10,18. Injeções únicas de CVN2L0 e variantes V2 (três pontes de dissulfeto) e...

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Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

O presente protocolo descreve novas ferramentas para ensaios de ligação ao SPR para examinar a ligação de CV-N ao AH, glicoproteína S, glicanos do tipo híbrido relacionados e oligossacarídeos com alto teor de manose. O SPR é usado para determinar o KD para ligar o CV-N dimérico ou monomérico a esses glicanos.

Engenharia de Agentes Antivirais via Ressonância de Plasmon de Superfície

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

A espectroscopia de ressonância plasmônica de superfície foi estabelecida para a determinação do ligante proteico de forma de rendimento médio. Diferentes afinidades para variantes de sítios de ligação da mesma molécula são apresentadas, nomeadamente para a ligação de ferro a oligossacarídeos de alta qualidade em vírus. A SPR é uma técnica livre de rótulos para estudar a ligação macromolecular em tempo real de receptores imobilizados de superfície.As interações multissítio são reconhecidas na análise cinética pela vinculação competitiva independentemente do tamanho das áreas específicas em pesquisa que utilizam a RPS são o desenvolvimento de fármacos para busca de inibidores ou caracterização de anticorpos. Constantes cinéticas e afinidades são calculadas diretamente a partir da resposta do sensor. Para começar, transfira 100 microlitros da solução em placas de ágar LB e espalhe-a suavemente usando um espalhador de células estéreis.Inicie uma série de reações de amostra usando múltiplas concentrações de molde de DNA de fita dupla variando de cinco a 50 nanogramas, mantendo a concentração do primer constante. Em seguida, adicione a enzima de restrição DpnI abaixo da sobreposição de óleo mineral e incube imediatamente a 37 graus Celsius por uma hora para digerir o DNA de fita dupla superenrolado parental. Para descongelar as Células Supercompetentes XL1-Blue, aliquote as células a um tubo inferior pré-refrigerado, pequeno e redondo.Em seguida, transfira um microlitro do DNA de fita simples tratado com DpnI de cada reação de controle e amostra para alíquotas separadas das células supercompetentes que sintetizam a fita complementar. Depois de girar as reações de transformação cuidadosamente para misturar, incube as reações no gelo por 30 minutos. Aplique pulso de calor nas reações de transformação a 42 graus Celsius por 45 segundos e, em seguida, coloque as reações no gelo por dois minutos.Em seguida, adicione 0,5 mililitros de NZY+Caldo e incube as reações de transformação a 37 graus Celsius com agitação a 225 a 250 RPM por uma hora. Posteriormente, pratique o volume correto de cada reação de transformação em placas de ágar ampicilina LB, conforme demonstrado anteriormente. Para uma cultura de sementes, inocular uma pequena quantidade de ampicilina contendo meios LB com uma única colônia da placa transformada.Usando a cultura noturna, inocular a cultura de expressão com aditivos incluindo 10 milimolares de cloreto de magnésio, 10 milimolares de sulfato de magnésio e 20 milimolares de glicose, diluindo a cultura de sementes para um por 100. Em seguida, cultive células com agitação vigorosa a 37 graus Celsius a um absorvente de 600 nanômetros entre 0,4 a 0,6 antes de resfriar as células a 20 graus Celsius e induzir com um IPTG milimolar e crescer durante a noite. Em seguida, colha as células por centrifugação a 4.000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante.Após a ressuspensão do pellet celular em tampão salino tamponada com fosfato, refúgio recente a 4.000 g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante com uma pipeta. Em seguida, ressuspeite o pellet restante em 10 mililitros de tampão de lise e incube a suspensão por uma hora a 37 graus Celsius.Em seguida, separe as fracções solúveis e insolúveis por centrifugação a 4 000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Além disso, use HIS-Select Ni2+Affinity Gel em tubos de 14 mililitros para ligar e ressuspender sua cianovirina-N expressa recombinantemente em soluções tampão com imidazol milimolar e imidazol 250 milimolares, respectivamente. Incubar em lote durante pelo menos 30 minutos entre estes passos.Adição do tampão de eluição contendo 250 milimolares de imidazol à proteína elutiva. Transferir as soluções proteicas para tubos de centrifugação com um filtro de corte Dalton de 10 quilos e concentrá-las centrifugando durante 10 minutos a 4, 500 g e quatro graus Celsius. Adicionar o tampão de funcionamento SPR a um factor de diluição de um a 10 e centrifugar quatro vezes até ao volume inicial durante 10 minutos a 4, 500 g e quatro graus Celsius.Posteriormente, determine a concentração de proteína a 280 nanômetros usando um espectrofotômetro UV-Visible NanoDrop com base no coeficiente de extinção calculado para a proteína principal CVN2L0 mostrando um tamanho de 23, 474 Dalton. Para o sistema SPR de canal duplo, use HBSCP plus como tampão de funcionamento, ácido clorídrico de glicina 10 milimolares de pH 1,5 a 1,6 como tampão de regeneração e ligue o desgaseificador de instrumentos, o amostrador automático e a bomba. Em seguida, lave todo o sistema com água destilada duas vezes por uma hora.Em seguida, solte o óleo de imersão no detector e monte um chip sensor de vidro revestido com um filme fino de ouro. E no lado superior, funcionalizado com hidrogel carboximetil dextran diretamente no detector abaixo da célula de fluxo de três portas. Em seguida, fixe a configuração puxando o manuseamento para baixo.Para imobilizar os ligantes proteicos para chips sensores, abra uma tabela de execução clicando em Formulário na barra de menus e execute o editor de tabela no software de link automático SPP integrado. Em seguida, escolha e clique em Imobilização Básica na lista de tabelas de execução disponíveis e siga as etapas do procedimento experimental na tela do computador. Em seguida, clique em Sample Set Editor na seção de formulário para preencher a lista de reagentes para dois racks colocados no amostrador automático para análise posterior.Clique em Autosampler Direct Control como uma ferramenta na barra de menus para trazer os racks para frente ou para casa e escolha quatro graus Celsius como a temperatura de operação. Ligue a bomba para infundir água destilada duplamente clicando em ferramentas e controle direto da bomba. E registre os dados clicando em SPR Instrument Direct Control.E cada vez, comece na janela recém-exibida. Depois de adicionar os reagentes de acoplamento em frascos para injetáveis de 300 microlitros, coloque-os nos racks do amostrador automático e inicie a tabela de execução clicando em Executar. Para a interação proteína-proteína simples, depois de reabastecer a bomba a 25.000 microlitros por minuto, execute o ajuste da linha de base por 30 segundos.Permitir o ajuste de linha de base subsequente com água destilada dupla por 1,5 minutos antes de extinguir a superfície do chip ativado com um cloridrato molar de etanolamina, pH 8,5. Em seguida, mude os tubos do amostrador de líquido para o desgaseificador de água destilada dupla para a garrafa com HBS-EP + Clique no formulário, role para baixo e mude para Pós-processamento clicando neste modo de operação. Em seguida, clique em Adicionar para selecionar curvas de ligação geradas ao longo do tempo na plataforma de dados para cada célula de fluxo e exporte a sobreposição como um arquivo de depuração.Em seguida, clique em Arquivo para abrir as opções de salvamento de arquivos e obter curvas de resposta alinhando as curvas esquerda e direita e subtraindo os sinais do segundo canal de referência daqueles do canal do ligante. Injeções únicas de CVN2L0 e variância V2 e V5 foram testadas pela primeira vez para ligação ao chip do sensor acoplado à hemaglutinina para estimar as capacidades de ligação usando o amostrador automático e o editor de mesa de execução. Injeções repetidas foram automatizadas em várias concentrações na faixa nanomolar e micromolar no sistema ao longo do tempo, demonstrando que nenhuma saturação na superfície do chip nem ligação de equilíbrio foi alcançada.A concentração versus resposta foi plotada para a ligação do tipo selvagem da DCV à DCR, assumindo o direcionamento específico de carboidratos possivelmente conservados na subunidade RBD S1 com afinidade mais fraca, com uma taxa de dissociação constante de 260 micromoles. O mesmo gráfico de afinidade para a ligação de CVN2L0-V4 ao DM torna-se mais analisável devido à substituição de ligações dissulfeto que interferem na ligação de alta afinidade a pequenos peptídeos glicosilados e produzem uma resposta maior do que o valor máximo de resposta. A ligação do tipo selvagem da DCV ao RBD no SARS-CoV-2 mostra ligação à proteína S e à RBD com uma constante de raiva de dissociação de 18,6 micromoles e 260 micromoles, respectivamente.Embora a resposta do SPR para as concentrações de analitos resulte em unidades de resposta elevadas e sensorgramas SPR típicos para ligação do tipo selvagem CVN e E41A. No entanto, o mutante é instável quando diluído. A biossensoriamento SPR está abordando a ligação de alta afinidade e baixa afinidade de proteínas purificadas e suas variantes a ligantes.No nosso caso, glicoproteínas explorando a leitura óptica e o sistema de fluxo de canal duplo na superfície do chip do sensor. O ensaio imunoenzimático é um método imunológico alternativo que reconhece epítopos proteicos, mas também fornece dados sobre a concentração de peptídeos e pequenas moléculas fora de matrizes complexas. O teste de proteínas expressas recombinantemente por ensaios de ligação SPR incorporou biossensoriamento de alterações confirmacionais que é útil para a verificação e previsão da estabilidade da proteína pelo lado computacional da proteína.

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