Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
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El autor agradece al Dr. Christian Derntl del Departamento de Biotecnología y Microbiología de la Universidad Técnica de Viena y al Departamento de Medicina III, División de Nefrología y Diálisis de la Universidad Médica de Viena, especialmente al Dr. Markus Wahrmann por su apoyo técnico y científico. La expresión de proteínas en células de mamíferos fue apoyada por el Departamento de Biotecnología de la Universidad de Recursos Naturales y Ciencias de la Vida (BOKU) de Viena. La autora quiere expresar su profundo agradecimiento al Dr. Nico Dankbar de XanTec bioanalytics en Düsseldorf, Alemania, por sus útiles discusiones científicas sobre la realización de los ensayos de unión SPR.

Para el presente estudio, se ha utilizado una proteína de fusión modificadora similar a la ubiquitina (SUMO) pequeña CVN en ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas en lugar de CV-N y es adecuada para ensayos basados en células. La proteína HA H3 del virus de la influenza A de longitud completa recombinante se obtiene comercialmente (consulte la Tabla de materiales) o se expresa en líneas celulares HEK293 de mamíferos y células de insectos infectados por baculovirus de acuerdo con los protocol...

La afinidad de enlace de CV-N se correlaciona con el número de sitios de enlace funcionales [2H en los dominios B y 2L en los dominios A cuando se diseñan como dímeros intercambiados por dominio]. Una variante con una afinidad de unión alterada (CVN2L0-V2, un pliegue homodimérico estable de CV-N que comprende un knock-out de puente disulfuro) se expresa en E. coli, se purifica y se prueba positivamente para unirse a la proteína HA (H3N2) utilizando SPR10, y muestra un cambio conform...

La actividad antiviral asociada a la teterina es inducida por el interferón-α, y comprende ataduras basadas en proteínas, que conducen a la retención de viriones completamente formados en las superficies celulares infectadas1. La necesidad de glicosilación de la teterina en la inhibición de la liberación del virus sigue siendo incierta, lo que implica la importancia de los patrones de glicosilación en los glicanos expresados recombinantemente para los estudios in vitro 1,2, que depende de la conformación de (en el caso del virus de la gripe) hemaglutinina HA 3,4 de la gripe expresada en superficie (en el caso del virus de la gripe) . Se ha observado que la modificación del oligosacárido atado a la glicosilación ligada a N es suficiente para la restricción mediada por la teterina de la liberación 2 del VIH tipo 1, mientras que la dimerización desempeña un papel esencial en la prevención dela liberación del virus, involucrando así el dominio transmembrana o el anclaje glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) para atar los viriones en ciernes5 . Se describen características únicas para la teterina humana y murina para bloquear múltiples virus, retrovirus y filovirus envueltos. BST-2/teterina es una proteína antiviral inducible por interferón de la inmunidad innata1,6, que actúa con actividad antiviral de amplio espectro y es antagonizada por las glicoproteínas de la envoltura 5 para translocar la teterina o alterar la estructurade la teterina 6. Por ejemplo, la glicoproteína HA de la envoltura expresada en superficie y la neuraminidasa en el virus de la influenza A son bien conocidas por el antagonismo de la teterina de una manera específica de la cepa7, lo que facilita el reconocimiento de los sitios de unión al receptor del huésped8. Los anticuerpos dirigidos a glicanos se estudian en la estequiometría de sus interacciones con los escudos de glicanos que se personalizan rápidamente en HA, lo que resulta en una afinidad de unión a los subtipos4 de influenza A H3N2 y H1N1.
Para dilucidar los mecanismos de unión entre los agentes antivirales y los picos de envoltura del virus, es decir, ligandos de carbohidratos y métodos inmunológicos y espectroscópicos complementarios, se sintetizan químicamente restos mono, di- y trimanosa. Los péptidos manosilados se crean a través de la glicosilación azido de glicosil {beta}-peracetatos a 1,2-trans glicosil azidas transformación9, imitando la N-acetil glucosamina y oligosacáridos con alto contenido de manosa en la superficie de virus potencialmente mortales. Los bioisósteres de triazol se utilizan para imitar los enlaces que forman el residuo manosilado del péptido HA10 y facilitar las interacciones específicas del sitio con derivados antivirales CV-N alrededor del segundo punto de glicosilación ligado a N en el dominio de la cabeza de HA (HA superior con 4 glicanos ligados a N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Las interacciones entre el ácido glutámico (Glu) y la arginina (Arg) y el dipolo de hélice resultante manifestaron una buena estabilidad tanto de péptidos modelo como de proteínas, pero se visualizan utilizando SPR. Si se compara con el reconocimiento de un único sitio de glicosilación sintetizado químicamente en HA10 mediante la inhibición directa de la unión del receptor en las fracciones de glicanos, se muestra que una mayor afinidad de una estructura Fc mutada de cuatro sitios a su receptor provoca funciones efectoras in vivo, revelando que la composición no relacionada de glicanos ligados a N unidos al mutante Fc se determina mecánicamente13.
CV-N muestra actividad antiviral contra el VIH 14,15, la influenza16 y el virus del Ébola, que está mediada por la unión nanomolar a modificaciones de oligosacáridos con alto contenido de manosa en las proteínas de espiga de la envoltura12,17,18,19. Se determina que la unión de HA de influenza a un sitio de unión a carbohidratos (H) de alta afinidad en CV-N o dos Hs en CVN2 dimérica unida covalentemente tiene constantes de disociación de equilibrio (K D) = 5.7 nM (Figura 1A) y KD = 2.7 nM, respectivamente. Tanto CV-N como CVN2 albergan otros uno o dos sitios de unión a carbohidratos (L) de baja afinidad 12,17,20,21. El ébola GP1,2 se une a 2H de CVN2 con afinidades en el rango nanomolar inferior (KD = 26 nM). La unión CV-N WT al Ébola GP1,2 y HA exhibe afinidades de K D = 34 nM a KD = 5.7 nM (A/New York/55/04)12. Las lectinas, como CV-N, que se dirigen específicamente a los glicanos con alto contenido de manosa en las envolturas virales, inhiben aún más la replicación del virus de la hepatitis C, el SARS-CoV, el herpesvirus, el virus de Marburgo y el virus del sarampión22.
La pequeña molécula CV-N ha sido estudiada a fondo durante más de 20 años, ya que se funcionaliza para unirse a una amplia gama de virus para inhibir la entrada viral16,18. Los análisis estructurales y los ensayos de afinidad de unión indican la reticulación de dos Ls en un dímero CVN2 intercambiado por dominio mediante unión bivalente en el rango micromolar para mejorar la avidez a las glicoproteínas de la envoltura viral10,19. La unión selectiva de Manα1-2Manα en los brazos Man(8) D1D3 y Man(9) comprende dos sitios de unión de diferentes afinidades localizadas en protómeros proteicos opuestos20, alcanzando así afinidades de unión nanomolar (Figura 1B). Por lo tanto, CVN2 se considera un pseudo-anticuerpo en cuanto a su aplicación para unirse a epítopos en el gp120 del VIH, similar a los anticuerpos neutralizantes del virus17. En este documento, el autor está interesado en investigar la posible unión de CVN2 al pico de SARS-CoV-2 a través de su dominio de unión al receptor (RBD). Las curvas de unión de la enzima convertidora de angiotensina humana inmovilizada (ECA)-2 con el RBD del SARS-CoV-2 dan como resultado KD = 4,7 nM para esta interacción de unión biológicamente relevante23.
Por el contrario, las clases seleccionadas de inmunoglobulinas reconocen patrones proteicos estructurales específicos y consistentes, que imparten un sustrato para la maduración de la afinidad en las regiones HA ancladas a la membrana24. CV-N muestra una actividad altamente potente en casi todos los virus de la influenza A y B16, y es un agente antiviral ampliamente neutralizante. Nuestro conocimiento es incompleto sobre la ubicación de epítopos dirigidos en el tallo de HA1 y HA2 que posiblemente involucran estructuras epitópicas para la focalización de glicanos por anticuerpos altamente neutralizantes y en comparación con la unión a lectinas25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del ensayo de unión SPR para CV-N a picos de envoltura del virus. (A) Ensayo SPR para la unión de CV-N al ligando: proteína HA de longitud completa (90 kDa). Conjunto de datos cinéticos (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) que muestran la unión de doble referencia en tiempo real a la influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variante V2 que se une al ligando inmovilizado DM dentro de un rango de concentración de 500 nM a 16 μM. Secuencia: Los residuos L se resaltan en amarillo. Los residuos H se resaltan en gris. E58 y R73 son un reemplazo para las cisteínas en la proteína de tipo salvaje y hacen de V2 un pliegue de proteína estable con tres enlaces disulfuro en lugar de cuatro Haga <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Mientras que el escudo glicanos en la parte superior de HA distal de membrana induce una unión de alta afinidad a CV-N 12, la unión de CVN2 a HA adyacente a un puente disulfuro de la parte superior de HA se ha observado además en sus sitios de baja afinidad10,12. Varias interacciones polares y sitios de interacción se identifican en la unión de carbohidratos por CV-N. Estas interacciones se verifican mediante la generación de variantes knock-out en el sitio de unión para correlacionar las afinidades de unión con la glicosilación predicha in silico 12. Por lo tanto, el proyecto tiene como objetivo comparar péptidos HA químicamente manosilados previamente probados en afinidad y especificidad de unión con secuencias cortas de péptidos de picos de 2019-nCoV relacionados con el SARS y SARS-CoV-2, que ocurren naturalmente modificados por un pequeño número de diferentes sitios de glicosilación ligados a N y glicosilación ligada a O. Usando microscopía crioelectrónica y ensayos de unión, Pinto y sus colaboradores reportan un anticuerpo monoclonal, S309, que potencialmente reconoce un epítopo en la proteína espiga del SARS-CoV-2 que contiene un glicano conservado dentro del subgénero Sarbecovirus, sin competir con la unión al receptor26. El protocolo de este estudio describe cómo el diseño, la expresión y la caracterización de variantes de CV-N son importantes para estudiar cómo CV-N y CVN2 se unen a proteínas glicosiladas y péptidos manosilados sintéticos utilizando la tecnología SPR10,12.
El dímero ligado en tándem CVN2L027 y las variantes del sitio de unión (V2-V5) se expresan de forma recombinante y las variantes se expresan con reemplazos de enlaces disulfuro (C58E y C73R) (Figura 2A). Además, se prepara un mutante con una mutación de un solo punto E41A porque esta posición se ha visto como un residuo de contacto cruzado intermolecular. Este mutante es otra molécula interesante para las mediciones de unión SPR entre la lectina y los oligosacáridos con alto contenido de manosa que descifran los dominios de unión y permiten la comparación con la forma dimérica. La estructura cristalina intercambiada de dominio de CVN2 muestra un enlazador flexible, que se extiende entre 49 y 54 residuos. Los dos dominios pueden continuar moviéndose alrededor de la bisagra como cuerpos rígidos, desarrollando un monómero a través de interacciones de dominio intramolecular (dominio A -residuos 1-39;90-101- con dominio B -residuos 40-89) o un dímero por intercambio de dominio intermolecular [dominio A (del primer monómero) con dominio B (del segundo), y dominio B (del primer monómero) con dominio A (de la segunda copia)]. No hay interacciones cercanas entre los dominios A y B de los dos protómeros, excepto para Glu4128. El gen para CV-N puede desarrollarse utilizando un método de PCR repetitivo con oligos29 sintetizados de 40 mer y luego se subclona en los sitios NdeI y BamHI de pET11a para su transformación (electroporación) en células electrocompetentes como lo describe Keeffe, J.R.27. La proteína, que se utiliza para lograr la estructura cristalina respectiva (PDB ID 3S3Y), incluye una etiqueta de purificación de 6-histidina N-terminal seguida de un sitio de escisión de la proteasa del factor Xa. La mutagénesis dirigida al sitio se utiliza para hacer mutaciones puntuales, cambiar codones e insertar o eliminar bases o codones únicos o múltiples para el intercambio de aminoácidos. Estas transformaciones proporcionan información invaluable sobre la función y estructura de las proteínas. Los CV-N, CVN2 y CVN3 expresados y purificados recombinantemente han sido biofísicamente bien estudiados20,21,27, son baratos de producir y, por lo tanto, se utilizan para caracterizar ensayos de unión a glicanos inmovilizados en chips sensores SPR. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas convencional (ELISA) proporciona menos reproducibilidad con respecto a la técnica de inmovilización de ligandos de glicano y transforma la unión en tiempo real de varias variantes del sitio de unión, que se muestra para SPR, en ensayos de punto final.
La variante de afinidad de unión CVN2L0-V2 (un pliegue intacto de CV-N homodimérico con una sustitución de puente disulfuro10) se expresa con una etiqueta His en Escherichia coli (E. coli), purificada sobre una columna de Ni-NTA aplicando cromatografía de afinidad y probada para unirse a HA (H3N2), péptido HA monomanosilado y péptido HA dimanosilado usando SPR. Los péptidos químicamente manosilados, o proteína HA y S, todos son ligandos y aminas acoplados a la superficie del chip hidrófilo. a través de ésteres reactivos o ingeniería de proteínas biotina-estreptavidina. El mismo procedimiento de corridas secuenciales se aplica a esos ligandos, inyectando diversas diluciones de CV-N y variantes de CV-N (y CVN2) para obtener información cinética para los análisis de interacción molecular como se describe a continuación30. El chip sensor SPR inmovilizado RBD se utiliza para estudios de unión en péptidos CV-N a S, y las afinidades se comparan con la unión del SARS-CoV-2 con el ACE2 humano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

La resonancia de plasmón de superficie (SPR) se utiliza para medir la unión de hemaglutinina (HA) al dímero de cianovirina-N (CV-N) intercambiado por dominio y para monitorear las interacciones entre los péptidos manosilados y el sitio de unión de alta afinidad de CV-N. Se ha informado que los picos de la envoltura del virus gp120, HA y glicoproteína del Ébola (GP) 1,2 se unen a sitios de unión de alta y baja afinidad en CVN2 dimérico. El péptido HA dimanosilado también se une en los dos sitios de unión de baja afinidad a una molécula diseñada de CVN2, que lleva un sitio de alta afinidad para el ligando respectivo y muta para reemplazar un enlace disulfuro estabilizador en el bolsillo de unión a carbohidratos, confirmando así la unión multivalente. La unión a HA se muestra en un sitio de unión de alta afinidad del pseudoanticuerpo CVN2 a una constante de disociación (KD) de 275 nM que neutraliza aún más el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) a través de la oligomerización. La correlación del número de puentes disulfuro en CVN2 intercambiado de dominio, que se reducen de 4 a 2 mediante la sustitución de cistinas en pares de residuos polares de ácido glutámico y arginina, da como resultado una afinidad de unión reducida a HA. Entre las interacciones más fuertes, el ébola GP1,2 está unido por CVN2 con dos sitios de unión de alta afinidad en el rango nanomolar inferior utilizando el glicano de envoltura sin un dominio transmembrana. En el presente estudio, la unión de la glicoproteína monomérica multiespecífica CV-N al coronavirus 2 del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) se mide en K D = 18.6 μM en comparación con la KD nanomolar a esos otros picos de virus, y a través de su dominio de unión al receptor en el rango medio μ-molar.

Una molécula CVN2L0 intercambiada en dominio dimérico se prueba para unirse a la región superior de HA en tres experimentos SPR separados y la afinidad de unión se presenta en valores KD. Se supone que el dominio B comprende sitios de unión H, que se ven afectados por la sustitución de un enlace disulfuro en residuos iónicos, y el dominio A forma L10,18. Las inyecciones individuales de CVN2L0 y las variantes V2 (tres puentes disulfuro) y V5 (dos...

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Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

El presente protocolo describe nuevas herramientas para ensayos de unión a SPR para examinar la unión CV-N a HA, glicoproteína S, glicanos de tipo híbrido relacionados y oligosacáridos con alto contenido de manosa. SPR se utiliza para determinar el KD para la unión de CV-N dimérico o monomérico a estos glicanos.

Ingeniería de agentes antivirales a través de la resonancia de plasmones de superficie

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

Se ha establecido la espectroscopia de resonancia de plasmones de superficie para la determinación del ligando proteico de forma de rendimiento medio. Se presentan diferentes afinidades para las variantes del sitio de unión de la misma molécula, a saber, para los oligosacáridos de alta unión al hierro en los virus. SPR es una técnica sin etiquetas para estudiar la unión macromolecular en tiempo real de receptores inmovilizados superficiales.Las interacciones multisitio se reconocen en el análisis cinético mediante la unión competitiva independientemente del tamaño de las áreas específicas en la investigación que utilizan SPR son el desarrollo de fármacos para buscar inhibidores o caracterización de anticuerpos. Las constantes cinéticas y las afinidades se calculan directamente a partir de la respuesta del sensor. Para comenzar, transfiera 100 microlitros de la solución en placas de agar LB y extiéndala suavemente usando un esparcidor de células estériles.Comience una serie de reacciones de muestra utilizando múltiples concentraciones de plantilla de ADN bicatenario que van de cinco a 50 nanogramos mientras mantiene constante la concentración del cebador. Luego agregue la enzima de restricción DpnI debajo de la capa de aceite mineral e incube inmediatamente a 37 grados centígrados durante una hora para digerir el ADN bicatenario superenrollado parental. Para descongelar las células supercompetentes XL1-Blue, alícuota las células a un tubo inferior redondo, pequeño y preenfriado.A continuación, transfiera un microlitro de ADN monocatenario tratado con DpnI de cada reacción de control y muestra a alícuotas separadas de las células supercompetentes que sintetizan la cadena complementaria. Después de agitar las reacciones de transformación cuidadosamente para mezclar, incubar las reacciones en hielo durante 30 minutos. Aplique pulso de calor a las reacciones de transformación a 42 grados centígrados durante 45 segundos y luego coloque las reacciones en hielo durante dos minutos.Luego agregue 0.5 mililitros de NZY + Caldo e incube las reacciones de transformación a 37 grados Celsius con agitación a 225 a 250 RPM durante una hora. Después, coloque el volumen correcto de cada reacción de transformación en placas de agar ampicilina LB como se demostró anteriormente. Para un cultivo de semillas, inocular una pequeña cantidad de ampicilina que contenga medios LB con una sola colonia de la placa transformada.Usando el cultivo durante la noche, inocular el cultivo de expresión con aditivos que incluyen 10 milimolares de cloruro de magnesio, 10 milimolares de sulfato de magnesio y 20 milimolares de glucosa, diluyendo el cultivo de semillas a uno por 100. A continuación, cultive células con agitación vigorosa a 37 grados centígrados a un absorbente de 600 nanómetros entre 0,4 y 0,6 antes de enfriar las células a 20 grados centígrados e inducir con un IPTG milimolar y crecer durante la noche. Luego cosecha las células centrifugando a 4, 000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y desecha el sobrenadante.Después de resuspender el pellet celular en tampón salino tamponado con fosfato, refugio reciente a 4, 000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, deseche el sobrenadante con una pipeta. A continuación, vuelva a suspender el pellet restante en 10 mililitros de tampón de lisis e incube la suspensión durante una hora a 37 grados centígrados.Luego separe las fracciones solubles e insolubles por centrifugación a 4, 000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Además, utilice HIS-Select Ni2+Affinity Gel en tubos de 14 mililitros para unir y resuspender su cianovirina-N recombinantemente expresada en soluciones tampón con 20 milimolares de imidazol y 250 milimolares de imidazol, respectivamente. Incubar en lote durante al menos 30 minutos entre estos pasos.Agregar el tampón de elución que contiene 250 milimolares de imidazol a la proteína de eluy. Transfiera las soluciones proteicas a tubos de centrifugación con un filtro de corte Dalton de 10 kilos y concéntrelos centrifugando durante 10 minutos a 4, 500 g y cuatro grados centígrados. Agregue el tampón de funcionamiento SPR a un factor de dilución de uno a 10 y centrifugar cuatro veces hasta el volumen inicial durante 10 minutos a 4, 500 g y cuatro grados centígrados.Después, determine la concentración de proteína a 280 nanómetros utilizando un espectrofotómetro NanoDrop UV-Visible basado en el coeficiente de extinción calculado para la proteína principal CVN2L0 que muestra un tamaño de 23, 474 Dalton. Para el sistema SPR de doble canal, use HBSCP plus como tampón de funcionamiento, ácido clorhídrico de glicina milimolar de pH 1.5 a 1.6 como tampón de regeneración y encienda el desgasificador del instrumento, el muestreador automático y la bomba. Luego lave todo el sistema con agua destilada doble durante una hora.A continuación, deje caer el aceite de inmersión en el detector y monte un chip sensor de vidrio recubierto con una fina película de oro. Y en la parte superior, funcionalizado con hidrogel de carboximetil dextrano directamente sobre el detector debajo de la celda de flujo de tres puertos. A continuación, fije la configuración tirando hacia abajo del manejo.Para inmovilizar los ligandos proteicos a los chips sensores, abra una tabla de ejecución haciendo clic en Formulario en la barra de menú y ejecute el editor de tablas en el software de enlace automático SPP integrado. Luego elija y haga clic en Inmovilización básica de la lista de tablas de ejecución disponibles y siga los pasos del procedimiento experimental en la pantalla de la computadora. A continuación, haga clic en Sample Set Editor en la sección de formularios para completar la lista de reactivos para dos bastidores colocados en el muestreador automático para su posterior análisis.Haga clic en Autosampler Direct Control como herramienta en la barra de menú para llevar los bastidores hacia adelante o de vuelta a casa y elija cuatro grados centígrados como temperatura de funcionamiento. Encienda la bomba para infundir agua destilada doble haciendo clic en las herramientas y el control directo de la bomba. Y registre datos haciendo clic en SPR Instrument Direct Control.Y cada vez, comience en la ventana que aparece de nuevo. Después de agregar los reactivos de acoplamiento en viales de 300 microlitros, colóquelos en los bastidores de muestreador automático e inicie la tabla de ejecución haciendo clic en Ejecutar. Para la interacción simple proteína-proteína, después de rellenar la bomba a 25, 000 microlitros por minuto, realice el ajuste de línea de base durante 30 segundos.Permita el ajuste de referencia posterior con agua destilada doble durante 1,5 minutos antes de enfriar la superficie del chip activado con un clorhidrato molar de etanolamina, pH 8,5. A continuación, cambie los tubos del muestreador de líquido al desgasificador de agua destilada doble en la botella con HBS-EP + Haga clic en Formulario, desplácese hacia abajo y cambie a Post-Procesamiento haciendo clic en este modo de operación. Luego haga clic en Agregar para seleccionar las curvas de enlace generadas a lo largo del tiempo en la plataforma de datos para cada celda de flujo y exportar la superposición como un archivo depurador.A continuación, haga clic en Archivo para abrir las opciones de guardado del archivo y obtener curvas de respuesta alineando las curvas izquierda y derecha y restando las señales del segundo canal de referencia de las del canal de ligando. Las inyecciones individuales de CVN2L0 y varianza V2 y V5 se probaron primero para la unión al chip sensor acoplado a hemaglutinina para estimar las capacidades de unión utilizando el muestreador automático y el editor de tablas en ejecución. Las inyecciones repetidas se automatizaron a varias concentraciones en el rango nanomolar y micromolar en el sistema a lo largo del tiempo, lo que demuestra que no se logró ninguna saturación en la superficie del chip ni unión al equilibrio.La concentración versus respuesta se trazó para la unión de tipo salvaje CVN a RBD, asumiendo una orientación específica de carbohidratos posiblemente conservados en la subunidad RBD S1 con una afinidad más débil que tiene una constante de tasa de disociación de 260 micromoles. La misma gráfica de afinidad para la unión CVN2L0-V4 a DM ya no es analizable debido a la sustitución de enlaces disulfuro que interfieren con la unión de alta afinidad a péptidos glicosilados pequeños y produce una respuesta mayor que el valor máximo de respuesta. La unión de tipo salvaje CVN a RBD en SARS-CoV-2 muestra unión a la proteína S y RBD con una constante de rabia de disociación de 18.6 micromoles y 260 micromoles, respectivamente.Aunque la respuesta SPR para las concentraciones de analito da como resultado unidades de alta respuesta y sensorgramas SPR típicos para CVN de tipo salvaje y unión E41A. Sin embargo, el mutante es inestable cuando se diluye. La biodetección SPR está abordando la unión de alta afinidad y baja afinidad de proteínas purificadas y sus variantes a ligandos.En nuestro caso, las glicoproteínas que explotan la lectura óptica y el sistema de flujo de doble canal en la superficie del chip sensor. El ensayo de enzimas inmunoabsorbentes es un método inmunológico alternativo que reconoce epítopos de proteínas, pero también proporciona datos sobre la concentración de péptidos y moléculas pequeñas a partir de matrices complejas. Las pruebas de proteínas expresadas recombinantemente mediante ensayos de unión SPR incorporaron biodetección de cambios confirmacionales que son útiles para la verificación y predicción de la estabilidad de proteínas por el lado computacional de la proteína.

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