Name: engineering antiviral agents via surface plasmon resonance
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Författaren erkänner Dr. Christian Derntl från Institutionen för bioteknik och mikrobiologi vid TU Wien och Institutionen för medicin III, Avdelningen för nefrologi och dialys vid Medicinska universitetet i Wien, särskilt Dr. Markus Wahrmann för tekniskt och vetenskapligt stöd. Proteinuttryck i däggdjursceller stöddes av institutionen för bioteknik vid University of Natural Resources and Life Sciences (BOKU) Wien. Författaren vill uttrycka sitt djupa erkännande till Dr. Nico Dankbar från XanTec bioanalytics i Düsseldorf, Tyskland, för hjälpsamma vetenskapliga diskussioner om att utföra SPR-bindande analyser.

För den aktuella studien har ett CVN-litet ubiquitinliknande modifierande (SUMO) fusionsprotein använts i enzymbundna immunosorbentanalyser istället för CV-N och är lämpligt för cellbaserade analyser. Rekombinant influensa A-virus i full längd HA H3-protein erhålls kommersiellt (se materialförteckning) eller uttrycks i HEK293-cellinjer hos däggdjur och bakulovirusinfekterade insektsceller enligt standardprotokoll12. Wuhan-1 spikprotein uttrycks i HEK293-celler från dä...

CV-N:s bindningstillhörighet korreleras med antalet funktionella bindningsställen [2H på domänerna B och 2L på domän(er) A när de konstrueras som domänbytta dimer]. En variant med en förändrad bindningsaffinitet (CVN2L0-V2, en homodimerisk stabil vik av CV-N bestående av en disulfidbro knock-out) uttrycks i E. coli, renas och testas positivt för bindning till HA-protein (H3N2) med SPR10, och visar en konformationsförändring vid bindning av HA med antingen H- eller L-kolhydra...

Tetherinassocierad antiviral aktivitet induceras av interferon-α, och den består av proteinbaserade tjuder, vilket leder till retention av fullbildade virioner på infekterade cellytor1. Nödvändigheten av tetheringlykosylering vid hämning av virusfrisättning är fortfarande osäker, vilket innebär betydelsen av glykosyleringsmönster på rekombinant uttryckta glykaner för in vitro-studier 1,2, vilket beror på konformationen av (i fallet med influensavirus) ytuttryckt influensahemagglutinin HA 3,4 . Det har noterats att modifiering av oligosackarid bunden till N-länkad glykosylering är tillräcklig för tetherinmedierad begränsning av HIV-typ-1-frisättning2, medan dimerisering spelar en viktig roll för att förhindra virusfrisättning, vilket involverar transmembrandomänen eller glykosylfosfatidyl-inositol (GPI) -ankare för att binda de spirande virionerna5 . Unika egenskaper beskrivs för mänsklig och murin tetherin för att blockera flera höljeförsedda virus, retrovirus och filovirus. BST-2/tetherin är ett interferoninducerbart antiviralt protein med den medfödda immuniteten1,6, som verkar med bredspektrum antiviral aktivitet och motarbetas av kuvertglykoproteiner5 för att antingen translokera tetherin eller störa strukturen hos tetherin 6. Till exempel är ytuttryckt kuvertglykoprotein-HA och neuraminidas på influensa A-virus välkända för tetherinantagonism på ett stamspecifikt sätt7, vilket underlättar igenkänningen av värdreceptorbindningsställen8. Glykaninriktade antikroppar studeras i stökiometrin av deras interaktioner med de snabbt anpassade glykansköldarna på HA, vilket resulterar i bindningsaffinitet till influensa A H3N2 och H1N1 subtyper4.
För att belysa bindningsmekanismerna mellan antivirala medel och virushöljespikar, dvs kolhydratligander och komplementära immunologiska och spektroskopiska metoder, syntetiseras mono-, di- och tri-mannosdelar kemiskt. De mannosylerade peptiderna skapas via azidoglykosylering av glykosyl {beta}-peracetater till 1,2-transglykosylazider transformation9, vilket efterliknar de typiskt funna N-acetylglukosamin- och högmannosoligosackariderna på ytan av livshotande virus. Triazolbioisosterer används för att efterlikna kopplingar som bildar den mannosylerade återstoden av HA-peptid10 och underlätta platsspecifika interaktioner med antivirala CV-N-derivat runt den andra N-länkade glykosyleringsplatsen på HA-huvuddomänen (HA-topp med 4 N-länkade glykaner N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Interaktioner mellan glutaminsyra (Glu) och arginin (Arg) och den resulterande spiraldipolen manifesterade god stabilitet hos både modellpeptider och proteiner men visualiseras med hjälp av SPR. Om man jämför med att känna igen ett enda kemiskt syntetiserat glykosyleringsställe på HA10 genom att direkt hämma receptorbindningen på glykandelarna, visas en högre affinitet hos en muterad Fc-struktur med fyra platser till dess receptor för att framkalla effektorfunktioner in vivo, vilket avslöjar den orelaterade sammansättningen av N-länkade glykaner bundna till Fc-mutant som ska bestämmas mekanistiskt13.
CV-N visar antiviral aktivitet mot HIV 14,15, influensa16 och ebolavirus, som förmedlas av nanomolär bindning till oligosackaridmodifieringar med hög mannos på kuvertspikproteiner12,17,18,19. Influensa-HA-bindning till ett kolhydratbindningsställe med hög affinitet (H) i CV-N eller två Hs i kovalent bunden dimerisk CVN2 bestäms ha jämviktsdissociationskonstanter (K D) = 5,7 nM (figur 1A) respektive KD = 2,7 nM. Både CV-N och CVN2 har ytterligare ett eller två kolhydratbindande ställen med låg affinitet (L) 12,17,20,21. Ebola GP1,2 binder till 2H av CVN2 med affiniteter i det lägre nanomolära området (KD = 26 nM). CV-N WT-bindning till Ebola GP1,2 och HA uppvisar affiniteter från K D = 34 nM till KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Lektiner, såsom CV-N, som specifikt riktar sig mot glykaner med hög mannos på virushöljena, hämmar ytterligare replikation av hepatit C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus och mässlingvirus22.
Den lilla CV-N-molekylen har studerats noggrant i mer än 20 år eftersom den fungerar för att binda ett brett spektrum av virus för att hämma viral inträde16,18. Strukturella analyser och bindningsaffinitetsanalyser indikerar tvärbindning av två Ls i en domänbytad CVN2-dimer genom bivalent bindning i det mikromolära intervallet för att förbättra aviditeten till virala kuvertglykoproteiner10,19. Selektiv bindning av Manα1-2Manα på Man(8) D1D3-armar och Man(9) består av två bindningsställen med olika affiniteter belägna på motsatta proteinprotomerer20 och når därmed nanomolära bindningsaffiniteter (figur 1B). Således anses CVN2 vara en pseudoantikropp angående dess tillämpning för att binda epitoper på HIV gp120, liknande virusneutraliserande antikroppar17. Häri är författaren intresserad av att undersöka den potentiella bindningen av CVN2 till SARS-CoV-2-spiken via dess receptorbindande domän (RBD). Bindningskurvor för immobiliserat humant angiotensinkonverterande enzym (ACE)-2 med SARS-CoV-2 RBD resulterar i KD = 4,7 nM för denna biologiskt relevanta bindningsinteraktion23.
Däremot känner utvalda immunglobulinklasser igen specifika och konsekventa strukturella proteinmönster, vilket ger ett substrat för affinitetsmognad i de membranförankrade HA-regionerna24. CV-N visar mycket potent aktivitet i nästan alla influensa A- och B-virus16, och det är ett i stort sett neutraliserande antiviralt medel. Vår kunskap är ofullständig om placeringen av riktade epitoper på stammen av HA1 och HA2 som möjligen involverar epitopiska strukturer för glykaninriktning genom starkt neutraliserande antikroppar och jämfört med lektinbindande25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> Figur 1: Schematisk representation av SPR-bindningsanalysen för CV-N till virushöljespikar. (A) SPR-analys för CV-N-bindning till ligand: HA fullängdsprotein (90 kDa). Kinetisk datamängd (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) som visar dubbelrefererad bindning i realtid till influensa HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variant V2 bindning till immobiliserad ligand DM inom ett koncentrationsområde på 500 nM till 16 μM. Sekvens: L-rester markeras med gult. H-rester markeras i grått. E58 och R73 är en ersättning för cysteiner i vildtypsproteinet och gör V2 till en stabil proteinveck med tre istället för fyra disulfidbindningar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Medan glykanskölden på den membrandistala HA-övre delen inducerar högaffinitetsbindning till CV-N 12, har CVN2-bindning till HA intill en disulfidbro i HA-toppdelen ytterligare observerats vid dess lågaffinitetsställen10,12. Olika polära interaktioner och interaktionsställen identifieras i kolhydratbindning med CV-N. Dessa interaktioner verifieras genom att generera knock-out-varianter i bindningsstället för att korrelera bindningsaffiniteter till in silico-förutsagd glykosylering12. Således syftar projektet till att jämföra tidigare testade kemiskt mannosylerade HA-peptider i bindande affinitet och specificitet med korta peptidsekvenser från SARS-relaterade 2019-nCoV-spikar och SARS-CoV-2, naturligt förekommande modifierade av ett litet antal olika N-länkade glykosyleringsställen och O-länkad glykosylering. Med hjälp av kryoelektronmikroskopi och bindningsanalyser rapporterar Pinto och kollegor en monoklonal antikropp, S309, som potentiellt känner igen en epitop på SARS-CoV-2-spikprotein som innehåller en konserverad glykan inom Sarbecovirus-undersläktet, utan att konkurrera med receptorbindning26. Protokollet för denna studie beskriver hur design, uttryck och karakterisering av CV-N-varianter är viktiga för att studera hur CV-N och CVN2 binder till glykosylerade proteiner och syntetiska mannosylerade peptider med hjälp av SPR-tekniken10,12.
Tandembunden dimer CVN2L027 och bindningsplatsvarianter (V2-V5) uttrycks rekombinant och varianter är med disulfidbindningsersättningar (C58E och C73R) (Figur 2A). Dessutom framställs en mutant med en enpunktsmutation E41A eftersom denna position har setts som en intermolekylär korskontaktrest. Denna mutant är en annan intressant molekyl för SPR-bindande mätningar mellan lektin- och högmannosoligosackarider som dechiffrerar bindningsdomäner och möjliggör jämförelse med den dimeriska formen. Den domänbytta kristallstrukturen för CVN2 visar en flexibel länkare som sträcker sig mellan 49 och 54 rester. De två domänerna kan fortsätta att röra sig runt gångjärnet som styva kroppar och utveckla antingen en monomer genom intramolekylära domäninteraktioner (domän A-rester 1-39;90-101- med domän B -rester 40-89) eller en dimer genom intermolekylär domänbyte [domän A (av den första monomeren) med domän B (av den andra) och domän B (av den första monomeren) med domän A (av den andra kopian)]. Det finns inga nära interaktioner mellan de två protomerernas A- och B-domäner, förutom Glu4128. Genen för CV-N kan utvecklas med hjälp av en repetitiv PCR-metod med 40-mer syntetiserade oligos29 och subkloneras sedan till NdeI- och BamHI-platserna för pET11a för transformation (elektroporering) till elektrokompetenta celler som beskrivs av Keeffe, J.R.27. Proteinet, som används för att uppnå respektive kristallstruktur (PDB ID 3S3Y), inkluderar en N-terminal 6-histidinreningstagg följt av en faktor Xa-proteasklyvningsplats. Platsstyrd mutagenes används för att göra punktmutationer, byta kodoner och infoga eller ta bort enstaka eller flera baser eller kodoner för aminosyrautbyte. Dessa transformationer ger ovärderlig insikt i proteinets funktion och struktur. Rekombinant uttryckt och renat CV-N, CVN2 och CVN3 har studerats biofysiskt väl 20,21,27, är billiga att producera och används därför för att karakterisera bindningsanalyser till glykaner immobiliserade på SPR-sensorchips. Konventionell enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) ger mindre reproducerbarhet avseende immobiliseringstekniken för glykanligander och omvandlar realtidsbindning av olika bindningsplatsvarianter, vilket visas för SPR, till slutpunktsanalyser.
Bindningsaffinitetsvariant CVN2L0-V2 (en intakt vik av homodimerisk CV-N med en disulfidbrosubstitution10) uttrycks med en His-tagg i Escherichia coli (E. coli), renad över Ni-NTA-kolonn med affinitetskromatografi och testad för bindning till HA (H3N2), monomannosylerad HA-peptid och dimannosylerad HA-peptid med SPR. Kemiskt mannosylerade peptider, eller HA- och S-protein, är alla ligander och amin kopplade till den hydrofila chipytan via reaktiva estrar eller biotin-streptavidin proteinteknik. Samma procedur för sekventiella körningar tillämpas på dessa ligander, injicering av olika utspädningar av CV-N och varianter av CV-N (och CVN2) för att erhålla kinetisk information för molekylära interaktionsanalyser som beskrivs nedan30. RBD-immobiliserat SPR-sensorchip används för att binda studier på CV-N till S-peptider, och affiniteter jämförs med SARS-CoV-2-bindning med humant ACE2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta primeplus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C7715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampillicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS86655</td>
			<td>silver stainless steel, bar L 33&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gensynthesis</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>#1390661&#160;</td>
			<td>cloning vector: pET27b(+)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50-105-5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UlitMate 3000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I restriction enzyme (10 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ER1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Merck</td>
			<td>39391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Minispin&#160;and MiniSpin Plus personal microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E6133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>55097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA H3 protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab69751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-select Ni2+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kromasil 300-5-C4</td>
			<td>Nouryon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>52062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>19344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2P04</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ amine (casein hydrolysate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD MidiTrap G-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9180-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>70171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET11a</td>
			<td>Merck Millipore (Novagen)</td>
			<td>69436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Software Package Autolink1-1-9</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber2-2012-09-04 for data analysis</td>
			<td>Reichert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11667289001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodim chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate.Trihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>236500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip C19RBDHC30M</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR C19RBDHC30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR sensor chip CMD500D</td>
			<td>XanTec bioanalytics</td>
			<td>SCR CMD500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T5912</td>
			<td>10x, solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Mixer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z258423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Merck</td>
			<td>XGAL-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue Supercompetent Cells</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>#200236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering antiviral agents via surface plasmon resonance

Ytplasmonresonans (SPR) används för att mäta hemagglutinin (HA) bindning till domänbytta Cyanovirin-N (CV-N) dimer och för att övervaka interaktioner mellan mannosylerade peptider och CV-N: s bindningsställe med hög affinitet. Virushöljespikar gp120, HA och Ebolaglykoprotein (GP) 1,2 har rapporterats binda både hög- och lågaffinitetsbindningsställen på dimerisk CVN2. Dimannosylerad HA-peptid är också bunden vid de två bindningsställena med låg affinitet till en konstruerad molekyl av CVN2, som bär ett högaffinitetsställe för respektive ligand och muteras för att ersätta en stabiliserande disulfidbindning i kolhydratbindningsfickan, vilket bekräftar multivalent bindning. HA-bindning visas till ett bindningsställe med hög affinitet för pseudo-antikropp CVN2 vid en dissociationskonstant (KD) på 275 nM som ytterligare neutraliserar humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) genom oligomerisering. Korrelering av antalet disulfidbroar i domänbytta CVN2, som minskas från 4 till 2 genom att ersätta cystiner i polära restpar av glutaminsyra och arginin, resulterar i minskad bindningsaffinitet till HA. Bland de starkaste interaktionerna är Ebola GP1,2 bunden av CVN2 med två bindningsställen med hög affinitet i det lägre nanomolära intervallet med hjälp av kuvertglykanen utan en transmembrandomän. I den aktuella studien mäts bindningen av det multispecifika monomera CV-N till svår akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spik (S) glykoprotein vid K D = 18,6 μM jämfört med nanomolar KD till de andra virusspikarna och via dess receptorbindande domän i mitten av μ-molarområdet.

En dimerisk domänbytad CVN2L0-molekyl testas för bindning till HA-toppregionen i tre separata SPR-experiment och bindningsaffinitet presenteras i KD-värden. Domän B antas omfatta H-bindande ställen, som påverkas genom att ersätta en disulfidbindning till jonrester, och domän A bildar L10,18. Enstaka injektioner av CVN2L0 och varianterna V2 (tre disulfidbroar) och V5 (två disulfidbroar) testas först för bindning till det HA-kopplade sensorchi...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Detta protokoll beskriver nya verktyg för SPR-bindningsanalyser för att undersöka CV-N-bindning till HA, S-glykoprotein, relaterade glykaner av hybridtyp och högmannosoligosackarider. SPR används för att bestämma KD för att binda antingen dimerisk eller monomer CV-N till dessa glykaner.

Tekniska antivirala medel via ytplasmonresonans

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

Ytplasmonresonansspektroskopi har fastställts för bestämning av proteinligand på ett medium genomströmningssätt. Olika affiniteter för bindningsställevarianter av samma molekyl presenteras, nämligen för järnbindande högmannaoligosackarider på virus. SPR är en etikettfri teknik för att studera makromolekylär bindning i realtid av ytimmobiliserade receptorer.Multisiteinteraktioner känns igen i den kinetiska analysen genom konkurrenskraftig bindning oberoende av storleken på de specifika områden inom forskning som använder SPR är läkemedelsutveckling för att söka efter hämmare eller antikroppskarakterisering. Kinetiska konstanter och affiniteter beräknas direkt från sensorsvaret. För att börja, överför 100 mikroliter av lösningen på LB-agarplattor och sprid den försiktigt med en steril cellspridare.Starta en serie provreaktioner med flera koncentrationer av dubbelsträngad DNA-mall som sträcker sig från fem till 50 nanogram samtidigt som primerkoncentrationen hålls konstant. Tillsätt sedan DpnI-restriktionsenzymet under mineraloljeöverlägget och inkubera omedelbart vid 37 grader Celsius i en timme för att smälta det föräldraöverspolade dubbelsträngade DNA: t. För att tina XL1-Blue Supercompetent Cells, alikvotera cellerna till ett förkylt, litet, runt bottenrör.Överför sedan en mikroliter av det DpnI-behandlade enkelsträngade DNA från varje kontroll- och provreaktion till separata alikvoter av de superkompetenta cellerna som syntetiserar den komplementära strängen. Efter virvlande transformationsreaktionerna försiktigt för att blanda, inkubera reaktionerna på is i 30 minuter. Applicera värmepuls på transformationsreaktionerna vid 42 grader Celsius i 45 sekunder och placera sedan reaktionerna på is i två minuter.Tillsätt sedan 0,5 ml NZY+buljong och inkubera transformationsreaktionerna vid 37 grader Celsius med skakning vid 225 till 250 rpm i en timme. Därefter ska du ange rätt volym för varje transformationsreaktion på LB Ampicillin Agar-plattor som visats tidigare. För en frökultur, inokulera en liten mängd ampicillin innehållande LB-media med en enda koloni från den transformerade plattan.Använd nattkulturen för att ympa uttryckskulturen med tillsatser inklusive 10 millimolar magnesiumklorid, 10 millimolar magnesiumsulfat och 20 millimolar glukos, späd frökulturen till en med 100. Därefter växer celler med kraftig skakning vid 37 grader Celsius till absorberande 600 nanometer mellan 0,4 och 0,6 innan cellerna kyls till 20 grader Celsius och inducerar med en millimolär IPTG och växer över natten. Skörda sedan cellerna genom att centrifugera vid 4 000 g i 15 minuter vid fyra grader Celsius och kassera supernatanten.Efter att ha återsuspenderat cellpelleten i fosfatbuffrad saltlösningsbuffert, nyligen tillflyktsort vid 4 000 g i 15 minuter vid fyra grader Celsius. Kassera sedan supernatanten med en pipett. Därefter återsuspendera den återstående pelleten i 10 ml lysbuffert och inkubera suspensionen i en timme vid 37 grader Celsius.Separera sedan lösliga och olösliga fraktioner genom centrifugering vid 4 000 g i 15 minuter vid fyra grader Celsius. Använd dessutom HIS-Select Ni2+Affinity Gel i 14 ml rör för att binda och återsuspendera hans märkta rekombinant uttryckta cyanovirin-N i buffertlösningar med 20 millimolar imidazol respektive 250 millimolar imidazol. Inkubera i batch i minst 30 minuter mellan dessa steg.Tillsats av elueringsbufferten innehållande 250 millimolar imidazol till elutprotein. Överför proteinlösningarna till centrifugeringsrör med ett 10 kilo Dalton cutoff-filter och koncentrera dem genom att centrifugera i 10 minuter vid 4 500 g och fyra grader Celsius. Tillsätt SPR-löpbuffert till en utspädningsfaktor på en till 10 och centrifugera fyra gånger till den ursprungliga volymen i 10 minuter vid 4 500 g och fyra grader Celsius.Därefter bestämmer du proteinkoncentrationen vid 280 nanometer med hjälp av en NanoDrop UV-Visible Spectrophotometer baserat på den beräknade extinktionskoefficienten som är sameffektiv för huvudproteinet CVN2L0 som visar en storlek på 23 474 Dalton. För SPR-systemet med dubbla kanaler, använd HBSCP plus som löpande buffert, 10 millimolar glycinsaltsyra med pH 1,5 till 1,6 som regenereringsbuffert och slå på instrumentavgasaren, autosamplern och pumpen. Tvätta sedan hela systemet med dubbeldestillerat vatten i en timme.Släpp sedan nedsänkningsolja på detektorn och montera ett glassensorchip belagt med en tunn guldfilm. Och på ovansidan, funktionaliserad med karboximetyl dextranhydrogel direkt på detektorn under treportsflödescellen. Fixa sedan inställningen genom att dra ner hanteringen.För att immobilisera de proteinhaltiga liganderna till sensorchips, öppna en körtabell genom att klicka på Form i menyraden och kör tabellredigeraren i den integrerade SPP-autolänkprogramvaran. Välj sedan och klicka på Grundläggande immobilisering från listan över tillgängliga körtabeller och följ stegen i experimentproceduren på datorskärmen. Klicka sedan på Sample Set Editor i formuläravsnittet för att fylla i reagenslistan för två rack placerade i autosampler för vidare analys.Klicka på Autosampler Direct Control som ett verktyg i menyraden för att föra racken framåt eller tillbaka hem och välj fyra grader Celsius som driftstemperatur. Starta pumpen för att infusera dubbeldestillerat vatten genom att klicka på verktyg och pumpa direkt styrning. Och spela in data genom att klicka på SPR Instrument Direct Control.Och varje gång, börja i det nyligen visade fönstret. Efter att ha tillsatt kopplingsreagenserna i 300 mikroliter injektionsflaskor, lägg dem i autosamplerracken och starta körtabellen genom att klicka på Kör. För den enkla protein-proteininteraktionen, efter påfyllning av pumpen vid 25 000 mikroliter per minut, utför baslinjejustering i 30 sekunder.Tillåt efterföljande baslinjejustering med dubbeldestillerat vatten i 1,5 minuter innan den aktiverade spånytan släcks med en molär etanolaminhydroklorid, pH 8,5. Byt sedan rören från vätskeprovtagaren till avgasaren från dubbeldestillerat vatten till flaskan med HBS-EP + Klicka på Form, bläddra ner och byt till efterbehandling genom att klicka på detta driftläge. Klicka sedan på Lägg till för att välja bindningskurvor som genereras över tid i dataplattformen för varje flödescell och exportera överlägget som en skrubberfil.Klicka sedan på Arkiv för att öppna filsparalternativen och få svarskurvor genom att justera vänster och höger kurvor och subtrahera signaler från den andra referenskanalen från ligandkanalens. Enstaka injektioner av CVN2L0 och varians V2 och V5 testades först för bindning till det hemagglutininkopplade sensorchipet för att uppskatta bindningskapaciteten med hjälp av autosamplern och körbordsredigeraren. Upprepade injektioner automatiserades vid olika koncentrationer i det nanomolära och mikromolära området i systemet över tid vilket visade att ingen mättnad på chipytan eller jämviktsbindning uppnåddes.Koncentration kontra respons plottades för CVN-bindning av vildtyp till RBD, förutsatt att specifik inriktning på eventuellt konserverade kolhydrater på RBD S1-underenheten med svagare affinitet med en dissociationshastighetskonstant på 260 mikromol. Samma affinitetsdiagram för CVN2L0-V4-bindning till DM blir inte längre analysbart på grund av ersättning av dissulfidbindningar som stör högaffinitetsbindning till små glykosylerade peptider och ger ett högre svar än svarets maximala värde. CVN vildtypsbindning till RBD på SARS-CoV-2 visar bindning till S-protein och RBD med en dissociationsraskonstant på 18,6 mikromol respektive 260 mikromol.Även om SPR-respons för analytkoncentrationer resulterar i enheter med högt svar och typiska SPR-sensorgram för CVN-vildtyp och E41A-bindning. Mutanten är emellertid instabil när den späds ut. SPR biosensing adresserar hög affinitet och låg affinitetsbindning av renade proteiner och dess varianter till ligander.I vårt fall utnyttjar glykoproteiner optisk avläsning och dubbelkanalflödessystemet på sensorchipytan. Enzym som immunosorbentanalys är en alternativ immunologisk metod som känner igen proteinepitoper men också ger data om koncentrationen av peptider och små molekyler ur komplexa matriser. Testning av rekombinant uttryckta proteiner med SPR-bindande analyser införlivade biosensing av bekräftelseförändringar vilket är användbart för verifiering och förutsägelse av proteinstabilitet genom beräkningsproteinsidan.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Procedure for Lung Engineering

Förfarande för Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Litografi Surface Mönstring för att skapa Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance elastografi Metodik för utvärdering vävnadstekniska Construct tillväxt

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Bifoga Biologiska sönder för att Silica optiska biosensorer med användning av silan Koppling ombud

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analys för SENP1 Proteas Kinetik Fastställande

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillärkraften Litografi för Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Självrapporterings Ställningar för 3-dimensionell cellodling

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

ECM Proteinnanofiber och nanostrukturer Engineered Använda Surface initierad Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Ytpotential Mätning av bakterier Använda Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering av Intrinsic Vascularization i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering avdelningen

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...