Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fond R01 EY029751-04

Dyr blev brugt i henhold til retningslinjerne fra Oakland University IACUC dyreprotokolnummer 21063 og retningslinjerne i ARVO-erklæringen for brug af dyr i oftalmisk og synsforskning.
1. Forberedelse af opløsning
<ol><li>Forbered det komplette RPE-cellekulturmedie ved at supplere Dulbeccos modificerede Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) med 25% Føtal Bovin Serum (FBS), 1,5% penicillin / streptomycin og 0,02% gentamicin.</li>
	<li>Forbered enzym A ved at su...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

Den nuværende protokol er en rapporteret, ændret og forenklet detaljeret procedure for RPE-isolering fra museøjne. Protokollen inkluderer enukleation, dissektion, indsamling, såning, kultur og karakterisering af RPE-celler isoleret fra museøjne.
Der er nogle begrænsninger og kritiske trin, der skal opfyldes for en vellykket RPE-isolering, såsom musens alder, antallet af dissekerede øjne, størrelsen på vævskulturpladen eller skålen og advarsler efter såning, opbevaring og passaging...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Retinale pigmenterede epitelceller (RPE) er placeret mellem choroid og neurale nethinden og danner et simpelt monolag af kuboidale celler, der ligger bag fotoreceptorcellerne (PR)1. RPE spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af et sundt miljø for PR-celler, hovedsageligt ved at reducere overdreven ophobning af reaktive iltarter (ROS) og deraf følgende oxidative skader1. RPE-celler overvåger mange funktioner, såsom omdannelse og opbevaring af retinoider, absorption af spredt lys-, væske- og iontransport og fagocytose af skurets PR-ydre segmentmembran 2,3. Ændringer i RPE (morfologi/funktion) kan forringe deres funktion, hvilket fører til retinopati, og dette er et fælles træk, der deles af mange okulære lidelser4. Mange okulære sygdomme er forbundet med ændringer i RPE-cellernes morfologi og funktion, herunder nogle genetiske sygdomme såsom retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurose og albinisme 4,5,6 samt aldersrelaterede okulære lidelser såsom diabetisk retinopati (DR) og aldersrelateret makuladegeneration (AMD)7,8 . Humane celler er de mest ønskelige, og det ville derfor være ideelt at studere RPE-lidelser i primære humane RPE-celler til dannelse af RPE-monolag. Etiske spørgsmål og den begrænsede tilgængelighed af humane donorer på grund af det faktum, at de fleste af disse lidelser fører til sygelighed9, men ikke nødvendigvis dødelighed10, forhindrer derved isolering af primære humane RPE-celler. Dette gør dyrkning af RPE-celler fra ikke-menneskelige dyredonorer til et foretrukket alternativ. Gnavere, især mus, betragtes som en god model til undersøgelse af forskellige okulære sygdomme, da transgen teknologi er mere omfattende etableret i disse arter11. Selvom brugen af dyrkede primære RPE-celler giver mange fordele, har det været svært at vedligeholde voksende celler i mange passager eller at opbevare og genbruge cellerne. Den største begrænsning af denne protokol er musenes alder; mus, der bruges til RPE-isolering, bør være i en meget ung alder (18-21 dage gammel er optimal), da det har været vanskeligt at dyrke RPE-celler fra voksne mus11,12,13. RPE-celler kan isoleres fra museøjne i alle aldre, men op til fire cellepassager var kun vellykkede med unge mus (18-21 dage gamle). RPE-isolering fra musenethinder ved hjælp af både C57BL6-mus og transgene mus med sletning af N-methyl-D-aspartatreceptorerne (NMDAR'er) ved RPE-cellerne blev udført for at studere effekten af forhøjet aminosyrehomocystein på udviklingen og progressionen af AMD14. Derudover hjalp isolerede primære RPE-celler med at foreslå et terapeutisk mål for AMD ved hæmning af NMDAR'erne ved RPE-celler14. Der er nogle NMDAR-blokkere, der er godkendt af Food and Drug Administration (FDA) og bruges i øjeblikket til behandling af moderat til svær forvirring (demens) relateret til Alzheimers sygdom (AD), såsom memantin16, som kan være et potentielt terapeutisk mål for AMD14. Desuden blev isolerede primære muse-RPE-celler anvendt til påvisning af inflammatoriske markører og den foreslåede induktion af inflammation som en underliggende mekanisme for homocysteininducerede træk ved AMD og AD ved anvendelse af en genetisk modificeret mus (CBS), som præsenterer et højt niveau af homocystein16,17.
Denne protokol blev brugt til at isolere RPE-celler fra både vildtype C57BL/6-mus og transgene mus udviklet i vores laboratorium som en forenklet tilpasning af andre offentliggjorte isolationsprotokoller13,18,19 for at nå en let anvendelig og pålidelig protokol. Der er ingen sexpræference i denne protokol. Mens mus aldre er kritiske for isolationsprocessen, blev unge, gamle mus (18-21 dage gamle) og ældre mus i alle aldre (op til 12 måneder) brugt til RPE-isolering. Vi bemærkede imidlertid, at RPE-cellerne isoleret fra de unge ældre mus levede længere, og op til fire passager kunne udføres. RPE-cellerne isoleret fra ældre mus kunne passeres en eller to gange, så ville de stoppe med at vokse med en normal hastighed og ændre deres form til at være mere langstrakt (fibroblastlignende celler). Tab af pigmentering og nedsat vedhæftning til vævskulturpladen efterfulgt af løsrivelse blev også observeret.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

Det retinale pigmenterede epitel (RPE) lag ligger umiddelbart bag fotoreceptorerne og har et komplekst metabolisk system, der spiller flere kritiske roller i opretholdelsen af fotoreceptorernes funktion. Således er RPE-strukturen og -funktionen afgørende for at opretholde et normalt syn. Dette manuskript præsenterer en etableret protokol for primær RPE-celleisolering af mus. RPE-isolering er et godt værktøj til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for RPE-patologi i de forskellige musemodeller af okulære lidelser. Desuden kan RPE-isolering hjælpe med at sammenligne primære muse-RPE-celler isoleret fra vildtype og genetisk modificerede mus samt teste lægemidler, der kan fremskynde udviklingen af terapi for synsforstyrrelser. Manuskriptet præsenterer en trin-for-trin RPE-isolationsprotokol; Hele proceduren, fra enukleation til såning, tager cirka 4 timer. Medierne bør ikke ændres i 5-7 dage efter såning for at tillade vækst af de isolerede celler uden forstyrrelse. Denne proces efterfølges af karakterisering af morfologi, pigmentering og specifikke markører i cellerne via immunfluorescens. Celler kan passeres maksimalt tre eller fire gange.

Validering af specificitet, renhed og barrierefunktion/dannelse af isolerede RPE-celler De isolerede celler blev undersøgt under et lysmikroskop for at verificere deres levedygtighed, morfologi og pigmentering. Billeder fra P0 og P1 (figur 1A, B) og billeder fra P0 og P4 blev taget (figur 1C, D) for at vise ændringerne i cellerne; form, størrelse og pigmentering, da passagerne fortsatte til den fjerde passage (sorte pile pe...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Dette manuskript beskriver en forenklet protokol til isolering af retinale pigmenterede epitel (RPE) celler fra museøjne på en trinvis måde. Protokollen inkluderer enukleation og dissektion af museøjne efterfulgt af isolering, såning og dyrkning af RPE-celler.

Isolering af primære muse retinale pigmenterede epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Denne protokol vil skitsere en nem og effektiv måde at med succes isolere primære muse retinale pigmenterede epitelceller. Retinale pigmenterede epitelceller spiller en meget vigtig rolle for at opretholde fotoreceptorcellerne og for at sikre nethindens normale funktion. Vores laboratorium har isoleret primære musepigmenterede epitelceller som et vigtigt redskab til at studere den ydre blod-retinale barriere og relaterede sygdomme såsom aldersrelateret makuladegeneration.For at udtrække museøjnene skal du etisk aflive musen i henhold til din institutions godkendte metoder, derefter placere musen på en steril underpude og nukleere øjet ved at trykke på en 5/45-stil pincet på kredsløbsområdet for at fremkalde proptose, derefter flytte pincetten til det bageste af øjet og forsigtigt trække for at fjerne øjet, hvilket sikrer, at synsnerven stadig er intakt. Mens du bruger tang, nedsænkes øjnene i et 2-milliliter mikrocentrifugerør indeholdende 5% povidonjod. Inkuber øjnene ved stuetemperatur i 2 til 3 minutter.Fjern øjnene fra povidonjod og læg dem i en petriskål. Mens du bruger en steril overførselspipette, skal du vaske øjnene med Hanks'Balanced Saline Solution, indtil den orange farve på povidonjod er væk. Dette tager cirka 2 til 3 vaske.Placer øjnene i en ny petriskål og nedsænk dem i kolde komplette RPE-cellevækstmedier. Derfra kan du begynde at dissekere under et dissekerende mikroskop. Under mikroskopet skal du bruge pincet og / eller Vannas saks til at trække eller skære bindevæv væk i ekstraokulære muskler.Øjne kan derefter holdes i en time i kolde RPE-cellekulturmedier. Det foretrækkes dog at gå direkte til næste trin efter rengøring af øjeæblet. Overfør øjnene til et 2-milliliter mikrocentrifugerør indeholdende enzymet A-opløsningen, og inkuber derefter øjnene inde i en inkubator ved 37 grader Celsius i 40 minutter.Fjern øjnene fra enzym A-opløsningen, og læg dem i et nyt 2-milliliter mikrocentrifugerør indeholdende enzym B-opløsningen, anbring dem derefter i en inkubator og inkuber ved 37 grader Celsius i 50 minutter. Fjern øjnene fra enzym B og læg dem i en 60 millimeter petriskål og nedsænk dem og komplet RPE-cellevækstmedier, og inkuber derefter øjnene ved 4 grader Celsius i 30 minutter. Placer skålen under dissekeringsmikroskopet og begynd at dissekere.Brug M5S-tang og en nål på en sprøjte til at lave et snit i ora seratta-sektionen. Tag nu fat i den indre del af snittet med to tang og tag fat i hornhinden med den anden tang. Begynd langsomt at rive hornhinden fra nethinden ved at trække hornhinden.Sørg for at rive i små trin og flytte tåren ned, når du fjerner hornhinden. Dette vil sikre, at RPE forbliver for det meste intakt, og du får en renere tåre. Når hornhinden er helt løsrevet, skal du kunne se iris og linse.Fjern både iris og linse med tang for at opretholde isolationens renhed. For at fjerne den neurale nethinde fra RPE-laget skal du tage fat i det ydre lag af øjenkoppen med en pincet og placere en arm af en anden pincet mellem både RPE og neurale lag. Derfra skal du forsigtigt trække eller øse den neurale nethinde væk fra RPE-laget og derefter kassere den neurale nethinde.Flyt RPE-laget til et andet sted på fadet uden snavs. For at adskille RPE fra choroid og sclera skal du forsigtigt skrabe indersiden af øjenkoppen med en pincet i 5/45-stil for at sikre adskillelsen af RPE-cellerne. RPE-cellerne ser uklare ud, når de er suspenderet, og komplette RPE-cellevækstmedier.Aspirer cellerne ved hjælp af en 3,2 ml steril overførselspipette og overfør til et nyt 15 milliliter centrifugerør indeholdende komplet RPE-cellevækstmedie. Cellerne kan centrifugeres ved 300 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Du kan derefter aspirere supernatanten ud og suspendere pelleten i opvarmet RPE-cellevækstmedie.Plad cellerne på en 100 millimeter petriskål og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Disse billeder viser en vellykket isolering ved passage 0 og passage 1, hvilket er tydeligt ved pigmenteringen af RPE-cellerne. Ved passage 4 bliver cellerne mindre karakteristiske og udviser mindre pigment, viser et spindellignende udseende eller bliver mere robuste med et større overfladeareal.Vi validerede RPE-cellerne med en RPE-specifik markør, RPE65 og et cytoskeletalt protein F-actin. Vi kontrollerede også for potentiel forurening med Muller-celler ved farvning med en Muller-cellespecifik markør, vimentin. Denne protokol er en forenklet tilpasning af eksisterende protokoller.Protokollen bruger materialer og tilhørende udstyr, der er tilgængeligt i de fleste forskningslaboratorier, hvilket vil hjælpe med at isolere primære muse-RPE-celler på en effektiv måde.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA Expression Profiler af menneskelige iPS celler, retinale pigmentepitel arvet fra iPS og Føtal retinale pigmentepitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primære cellekulturer fra mus retinale Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effektiv dissektion og kultur af primære mus Retinal Pigment Epitel celler

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolering og karakterisering af musens primære lever sinusformede endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primær kultur af porcine retinale pigmentepitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...