Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fonds R01 EY029751-04

Dieren werden gebruikt volgens de richtlijnen van Oakland University IACUC dierprotocol nummer 21063 en de richtlijnen van de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek.
1. Oplossingsvoorbereiding
<ol><li>Bereid de volledige RPE-celkweekmedia voor door Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) aan te vullen met 25% Foetaal Runderserum (FBS), 1,5% penicilline / streptomycine en 0,02% gentamicine.</li>
	<li>Bereid...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

Het huidige protocol is een gerapporteerde, gewijzigde en vereenvoudigde gedetailleerde procedure voor RPE-isolatie van muizenogen. Het protocol omvat enucleatie, dissectie, verzameling, zaaien, cultuur en karakterisering van RPE-cellen geïsoleerd uit muizenogen.
Er zijn enkele beperkingen en kritieke stappen waaraan moet worden voldaan voor succesvolle RPE-isolatie, zoals de leeftijd van muizen, het aantal ontlede ogen, de grootte van de weefselkweekplaat of -schaal en waarschuwingen na het ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Retinaal gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) bevinden zich tussen het vaatvlies en het neurale netvlies en vormen een eenvoudige monolaag van kubusvormige cellen die achter de fotoreceptorcellen (PR) ligt1. De RPE speelt een cruciale rol bij het handhaven van een gezonde omgeving voor PR-cellen, voornamelijk door het verminderen van de overmatige accumulatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de daaruit voortvloeiende oxidatieve schade1. RPE-cellen houden toezicht op vele functies, zoals de conversie en opslag van retinoïden, de absorptie van verstrooid licht, vloeistof- en ionentransport en fagocytose van het pr-buitenmembraan 2,3. Veranderingen in de RPE (morfologie/functie) kunnen hun functie aantasten, wat leidt tot retinopathie en dit is een gemeenschappelijk kenmerk dat door veel oogaandoeningen wordt gedeeld4. Veel oogziekten worden geassocieerd met veranderingen in de morfologie en functie van RPE-cellen, waaronder sommige genetische ziekten zoals retinitis pigmentosa, Leber congenitale amaurosis en albinisme 4,5,6, evenals leeftijdsgebonden oculaire aandoeningen zoals diabetische retinopathie (DR) en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD)7,8 . Menselijke cellen zijn het meest wenselijk, dus het zou ideaal zijn om RPE-stoornissen in primaire menselijke RPE-cellen te bestuderen voor het vormen van RPE-monolagen. Ethische kwesties en de beperkte beschikbaarheid van menselijke donoren vanwege het feit dat de meeste van deze aandoeningen leiden tot morbiditeit9, maar niet noodzakelijkerwijsmortaliteit 10, waardoor de isolatie van primaire menselijke RPE-cellen wordt voorkomen. Dit maakt het kweken van RPE-cellen van niet-menselijke dierlijke donoren een voorkeursalternatief. Knaagdieren, met name muizen, worden beschouwd als een geweldig model voor het bestuderen van verschillende oogziekten, omdat transgene technologie uitgebreider is ingeburgerd in deze soorten11. Hoewel het gebruik van gekweekte primaire RPE-cellen veel voordelen biedt, is het moeilijk geweest om groeiende cellen gedurende vele passages te behouden of om de cellen op te slaan en te hergebruiken. De belangrijkste beperking van dit protocol is de leeftijd van de muizen; muizen die worden gebruikt voor RPE-isolatie moeten van een zeer jonge leeftijd zijn (18-21 dagen oud is optimaal) omdat het moeilijk is geweest om RPE-cellen van volwassen muizen 11,12,13 te kweken. RPE-cellen kunnen op elke leeftijd uit muizenogen worden geïsoleerd, maar tot vier celpassages waren alleen succesvol bij jonge muizen (18-21 dagen oud). RPE-isolatie van het netvlies van muizen, met behulp van zowel C57BL6-muizen als transgene muizen met deletie van de N-methyl-D-aspartaatreceptoren (NMDARs) in de RPE-cellen, werd uitgevoerd om het effect van verhoogd aminozuur homocysteïne op de ontwikkeling en progressie van AMD14 te bestuderen. Bovendien hielpen geïsoleerde primaire RPE-cellen bij het voorstellen van een therapeutisch doelwit voor AMD door remming van de NMDARs bij RPE-cellen14. Er zijn enkele NMDAR-blokkers die zijn goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) en momenteel worden gebruikt voor de behandeling van matige tot ernstige verwarring (dementie) gerelateerd aan de ziekte van Alzheimer (AD), zoals memantine16, die een potentieel therapeutisch doelwit voor AMD14 zou kunnen zijn. Bovendien werden geïsoleerde primaire muis RPE-cellen gebruikt voor de detectie van ontstekingsmarkers en de voorgestelde inductie van ontsteking als een onderliggend mechanisme voor homocysteïne-geïnduceerde kenmerken van AMD en AD met behulp van een genetisch gemodificeerde muis (CBS), die een hoog niveau van homocysteïne16,17 presenteert.
Dit protocol werd gebruikt om RPE-cellen te isoleren van zowel wild-type C57BL/6-muizen als transgene muizen die in ons laboratorium zijn ontwikkeld als een vereenvoudigde aanpassing van andere gepubliceerde isolatieprotocollen 13,18,19 om een gemakkelijk toepasbaar en betrouwbaar protocol te bereiken. Er is geen geslachtsvoorkeur in dit protocol. Hoewel muizenleeftijden van cruciaal belang zijn voor het isolatieproces, werden jonge, oudere muizen (18-21 dagen oud) en oudere muizen op elke leeftijd (tot 12 maanden) gebruikt voor RPE-isolatie. We merkten echter dat de RPE-cellen geïsoleerd uit de jonge muizen langer leefden en dat er maximaal vier passages konden worden uitgevoerd. De RPE-cellen geïsoleerd van oudere muizen kunnen een of twee keer worden gepasseerd, dan zouden ze stoppen met groeien met een normale snelheid en hun vorm veranderen om meer langwerpig te zijn (fibroblastachtige cellen). Verlies van pigmentatie en verminderde hechting aan de weefselkweekplaat gevolgd door loslating werd ook waargenomen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

De retinale gepigmenteerde epitheellaag (RPE) ligt direct achter de fotoreceptoren en herbergt een complex metabolisch systeem dat verschillende cruciale rollen speelt bij het handhaven van de functie van de fotoreceptoren. De RPE-structuur en -functie zijn dus essentieel om een normaal gezichtsvermogen te behouden. Dit manuscript presenteert een vastgesteld protocol voor primaire muis RPE-celisolatie. RPE-isolatie is een geweldig hulpmiddel om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan RPE-pathologie in de verschillende muismodellen van oogaandoeningen. Bovendien kan RPE-isolatie helpen bij het vergelijken van primaire RPE-cellen van muizen die zijn geïsoleerd uit wildtype en genetisch gemodificeerde muizen, evenals het testen van geneesmiddelen die de ontwikkeling van therapie voor visuele stoornissen kunnen versnellen. Het manuscript presenteert een stap-voor-stap RPE-isolatieprotocol; de hele procedure, van enucleatie tot zaaien, duurt ongeveer 4 uur. De media mogen niet worden veranderd gedurende 5-7 dagen na het zaaien, om de groei van de geïsoleerde cellen zonder verstoring mogelijk te maken. Dit proces wordt gevolgd door de karakterisering van morfologie, pigmentatie en specifieke markers in de cellen via immunofluorescentie. Cellen kunnen maximaal drie of vier keer worden gepasseerd.

Validatie van de specificiteit, zuiverheid en barrièrefunctie/vorming van geïsoleerde RPE-cellen De geïsoleerde cellen werden onderzocht onder een lichtmicroscoop om hun levensvatbaarheid, morfologie en pigmentatie te verifiëren. Beelden van P0 en P1 (figuur 1A,B) en beelden van P0 en P4 werden vastgelegd (figuur 1C,D) om de veranderingen in de cellen weer te geven; vorm, grootte en pigmentatie terwijl de passages doorging...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigd protocol voor de isolatie van retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) uit muizenogen op een stapsgewijze manier. Het protocol omvat de enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door de isolatie, zaaiing en kweek van RPE-cellen.

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Dit protocol schetst een eenvoudige en efficiënte manier om met succes primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen te isoleren. Retinale gepigmenteerde epitheelcellen spelen een zeer belangrijke rol om de fotoreceptorcellen te behouden en de normale functie van het netvlies te waarborgen. Ons laboratorium heeft primaire muis gepigmenteerde epitheelcellen geïsoleerd als een belangrijk hulpmiddel om de buitenste bloed-retinale barrière en gerelateerde ziekten zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie te bestuderen.Om de muizenogen te extraheren, euthanaseert u de muis ethisch volgens de goedgekeurde methoden van uw instelling, plaatst u de muis vervolgens op een steriele onderkant en nucleeert u het oog door op een 5/45-stijl pincet op het orbitale gebied te drukken om proptose te induceren, verplaats vervolgens het pincet naar de achterkant van het oog en trek voorzichtig om het oog te verwijderen, zodat de oogzenuw nog steeds intact is. Tijdens het gebruik van een tang dompelt u de ogen onder in een microcentrifugebuis van 2 milliliter met 5% povidonjodium. Incubeer de ogen bij kamertemperatuur gedurende 2 tot 3 minuten.Verwijder de ogen van het povidonjodium en plaats ze in een petrischaaltje. Was tijdens het gebruik van een steriele transferpipet de ogen met Hanks'Balanced Saline Solution totdat de oranje kleur van het povidonjodium verdwenen is. Dit duurt ongeveer 2 tot 3 wasbeurten.Plaats de ogen in een nieuwe petrischaal en dompel ze onder in koude complete RPE-celgroeimedia. Van daaruit kun je beginnen met ontleden onder een ontleedmicroscoop. Gebruik onder de microscoop een pincet en/of Vannas-schaar om bindweefsel in extraoculaire spieren weg te trekken of weg te snijden.Ogen kunnen dan een uur worden vastgehouden in koude RPE-celkweekmedia. Het heeft echter de voorkeur om direct door te gaan naar de volgende stap na het reinigen van de oogbol. Breng de ogen over naar een microcentrifugebuis van 2 milliliter met het enzym A-oplossing en incubeer vervolgens de ogen in een incubator bij 37 graden Celsius gedurende 40 minuten.Verwijder de ogen van het enzym A-oplossing en plaats ze in een nieuwe microcentrifugebuis van 2 milliliter met het enzym B-oplossing, plaats ze vervolgens in een incubator en incubeer gedurende 50 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder de ogen van enzym B en plaats ze in een petrischaaltje van 60 millimeter en dompel ze onder en voltooi de RPE-celgroeimedia en incubeer vervolgens de ogen bij 4 graden Celsius gedurende 30 minuten. Plaats de schaal onder de ontleedmicroscoop en begin met ontleden.Gebruik een M5S-tang en een naald van een spuit om een incisie te maken in het ora seratta-gedeelte. Pak nu met twee tangen het binnenste deel van de incisie vast met de ene tang en grijp het hoornvlies met de andere tang. Begin langzaam het hoornvlies van het netvlies te scheuren door aan het hoornvlies te trekken.Zorg ervoor dat u in kleine stappen scheurt en de scheur naar beneden beweegt terwijl u het hoornvlies verwijdert. Dit zorgt ervoor dat de RPE grotendeels intact blijft en je een schonere scheur krijgt. Zodra het hoornvlies volledig is losgemaakt, zou u de iris en lens moeten kunnen zien.Verwijder zowel de iris als de lens met een tang om de zuiverheid van de isolatie te behouden. Om het neurale netvlies uit de RPE-laag te verwijderen, pak je de buitenste laag van de oogschelp vast met één pincet en plaats je een arm van een tweede pincet tussen zowel de RPE- als de neurale lagen. Trek of schep vanaf daar voorzichtig het neurale netvlies weg van de RPE-laag en gooi vervolgens het neurale netvlies weg.Verplaats de RPE-laag naar een andere plaats op de schaal zonder vuil. Om de RPE van het vaatvlies en de sclera te scheiden, schraapt u voorzichtig de binnenkant van de oogschelp met een 5/45-stijl pincet om de scheiding van de RPE-cellen te garanderen. De RPE-cellen zien er troebel uit wanneer ze worden gesuspendeerd en complete RPE-celgroeimedia voltooien.Aspirateer de cellen met behulp van een steriele transferpipet van 3,2 milliliter en breng ze over naar een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter met volledige RPE-celgroeimedia. De cellen kunnen worden gecentrifugeerd op 300g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens kunt u het supernatant uitzuigen en de pellet resuspeneren in verwarmde RPE-celgroeimedia.Leg de cellen op een petrischaaltje van 100 millimeter en incubeer bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Deze beelden tonen een succesvolle isolatie bij passage 0 en passage 1, wat blijkt uit de pigmentatie van de RPE-cellen. Bij passage 4 worden de cellen minder karakteristiek en vertonen ze minder pigment, vertonen ze een spindelachtig uiterlijk of worden ze robuuster met een groter oppervlak.We valideerden de RPE-cellen met een RPE-specifieke marker, RPE65 en een cytoskeletaal eiwit F-actine. We controleerden ook op mogelijke besmetting met Muller-cellen door kleuring met een Muller-celspecifieke marker, vimentine. Dit protocol is een vereenvoudigde aanpassing van bestaande protocollen.Het protocol maakt gebruik van materialen en bijbehorende apparatuur die beschikbaar zijn in de meeste onderzoekslaboratoria, die zullen helpen bij het isoleren van primaire RPE-cellen van muizen op een effectieve manier.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA expressie profielen van de Mens iPS cellen, retinale pigment epitheel Derived From iPS en Foetale retinale pigment epitheel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primaire celculturen van de muis retinale Pigment epitheel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primaire cultuur van porcine retinale pigmentepitheelcellen

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...