Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par le National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fund R01 EY029751-04

Les animaux ont été utilisés conformément aux directives du protocole animal IACUC numéro 21063 de l’Université d’Oakland et aux directives de la déclaration ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.
1. Préparation de la solution
<ol><li>Préparer le milieu complet de culture cellulaire EPR en complétant le mélange F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco avec 25 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1,5 % de pénicilline/streptomycine et 0,...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

Le protocole actuel est une procédure détaillée rapportée, modifiée et simplifiée pour l’isolement de l’EPR à partir des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation, la dissection, la collecte, l’ensemencement, la culture et la caractérisation des cellules EPR isolées dans les yeux de souris.
Certaines limites et étapes critiques doivent être respectées pour une isolation réussie de l’EPR, telles que l’âge des souris, le nombre d’yeux disséqués, la taill...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Les cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) sont situées entre la choroïde et la rétine neurale, formant une simple monocouche de cellules cuboïdes qui se trouve derrière les cellules photoréceptrices (PR)1. L’EPR joue un rôle essentiel dans le maintien d’un environnement sain pour les cellules PR, principalement en réduisant l’accumulation excessive d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et les dommages oxydatifs qui en découlent1. Les cellules EPR supervisent de nombreuses fonctions, telles que la conversion et le stockage des rétinoïdes, l’absorption de la lumière diffusée, le transport des fluides et des ions et la phagocytose dela membrane du segment externe 2,3 du PR. Les altérations de l’EPR (morphologie/fonction) peuvent altérer leur fonction conduisant à la rétinopathie et c’est une caractéristique commune à de nombreux troubles oculaires4. De nombreuses maladies oculaires sont associées à des altérations de la morphologie et de la fonction des cellules EPR, y compris certaines maladies génétiques comme la rétinite pigmentaire, l’amaurose congénitale de Leber et l’albinisme 4,5,6, ainsi que des troubles oculaires liés à l’âge comme la rétinopathie diabétique (RD) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)7,8 . Les cellules humaines sont les plus souhaitables, il serait donc idéal d’étudier les troubles de l’EPR dans les cellules RPE humaines primaires pour former des monocouches d’EPR. Cependant, les questions éthiques et la disponibilité limitée des donneurs humains en raison du fait que la plupart de ces troubles entraînent une morbidité9, mais pas nécessairement la mortalité10, empêchant ainsi l’isolement des cellules humaines primaires de l’EPR. Cela fait de la culture de cellules EPR provenant de donneurs animaux non humains une alternative privilégiée. Les rongeurs, en particulier les souris, sont considérés comme un excellent modèle pour l’étude de différentes maladies oculaires puisque la technologie transgénique est plus largement établie chez ces espèces11. Même si l’utilisation de cellules EPR primaires en culture offre de nombreux avantages, il a été difficile de maintenir des cellules en croissance pendant de nombreux passages, ou de stocker et de réutiliser les cellules. La principale limitation de ce protocole est l’âge des souris; les souris utilisées pour l’isolement de l’EPR doivent être très jeunes (18-21 jours est optimal) car il a été difficile de cultiver des cellules EPR à partir de souris adultes11,12,13. Les cellules EPR peuvent être isolées des yeux de souris à tout âge, mais jusqu’à quatre passages cellulaires n’ont été efficaces qu’avec de jeunes souris (âgées de 18 à 21 jours). L’isolement de l’EPR à partir de la rétine de souris, en utilisant à la fois des souris C57BL6 et des souris transgéniques avec délétion des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) au niveau des cellules EPR, a été réalisé pour étudier l’effet de l’homocystéine d’acides aminés élevés sur le développement et la progression de la DMLA14. De plus, des cellules RPE primaires isolées ont aidé à proposer une cible thérapeutique pour la DMLA par inhibition des NMDARs sur les cellules RPE14. Certains bloqueurs NMDAR sont approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) et sont actuellement utilisés pour traiter la confusion modérée à grave (démence) liée à la maladie d’Alzheimer (MA), comme la mémantine16, qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour la DMLA14. De plus, des cellules RPE primaires isolées de souris ont été utilisées pour la détection de marqueurs inflammatoires et l’induction proposée de l’inflammation comme mécanisme sous-jacent des caractéristiques induites par l’homocystéine de la DMLA et de la MA à l’aide d’une souris génétiquement modifiée (CBS), qui présente un niveau élevé d’homocystéine16,17.
Ce protocole a été utilisé pour isoler des cellules EPR de souris C57BL/6 de type sauvage et de souris transgéniques développées dans notre laboratoire comme une adaptation simplifiée d’autres protocoles d’isolement publiés13,18,19 pour atteindre un protocole facilement applicable et fiable. Il n’y a pas de préférence sexuelle dans ce protocole. Bien que l’âge des souris soit essentiel pour le processus d’isolement, des souris jeunes et âgées (âgées de 18 à 21 jours) et des souris plus âgées de tout âge (jusqu’à 12 mois) ont été utilisées pour l’isolement de l’EPR. Cependant, nous avons remarqué que les cellules EPR isolées des souris jeunes vivaient plus longtemps et que jusqu’à quatre passages pouvaient être effectués. Les cellules EPR isolées de souris plus âgées pourraient être transmises une ou deux fois, puis elles cesseraient de croître à un rythme normal et changeraient de forme pour être plus allongées (cellules ressemblant à des fibroblastes). Une perte de pigmentation et une diminution de l’adhérence à la plaque de culture tissulaire suivies d’un décollement ont également été observées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

La couche d’épithélium pigmenté rétinien (EPR) se trouve immédiatement derrière les photorécepteurs et abrite un système métabolique complexe qui joue plusieurs rôles critiques dans le maintien de la fonction des photorécepteurs. Ainsi, la structure et la fonction de l’EPR sont essentielles pour maintenir une vision normale. Ce manuscrit présente un protocole établi pour l’isolement primaire des cellules EPR de souris. L’isolement de l’EPR est un excellent outil pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la pathologie de l’EPR dans les différents modèles murins de troubles oculaires. En outre, l’isolement de l’EPR peut aider à comparer les cellules RPE primaires de souris isolées de souris de type sauvage et génétiquement modifiées, ainsi qu’à tester des médicaments qui peuvent accélérer le développement de thérapies pour les troubles visuels. Le manuscrit présente un protocole d’isolement RPE étape par étape; L’ensemble de la procédure, de l’énucléation à l’ensemencement, prend environ 4 heures. Le milieu ne doit pas être changé pendant 5 à 7 jours après l’ensemencement, pour permettre la croissance des cellules isolées sans perturbation. Ce processus est suivi par la caractérisation de la morphologie, de la pigmentation et des marqueurs spécifiques dans les cellules via l’immunofluorescence. Les cellules peuvent être traversées un maximum de trois ou quatre fois.

Validation de la spécificité, de la pureté et de la fonction/formation de barrière des cellules EPR isolées Les cellules isolées ont été examinées au microscope optique pour vérifier leur viabilité, leur morphologie et leur pigmentation. Des images de P0 et P1 (Figure 1A,B) et des images de P0 et P4 ont été capturées (Figure 1C,D) pour montrer les changements dans les cellules; forme, taille et pigmentation au fu...

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Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Ce manuscrit décrit un protocole simplifié pour l’isolement progressif des cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules EPR.

Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Ce protocole décrira un moyen simple et efficace d’isoler avec succès les cellules primaires pigmentées de l’épithélium pigmenté de la rétine de souris. Les cellules de l’épithélium pigmentées de la rétine jouent un rôle très important pour maintenir les cellules photoréceptrices et assurer le fonctionnement normal de la rétine. Notre laboratoire a isolé les cellules épithéliales pigmentées primaires de souris comme un outil important pour étudier la barrière hémato-rétinienne externe et les maladies connexes telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge.Pour extraire les yeux de souris, euthanasiez éthiquement la souris selon les méthodes approuvées de votre établissement, puis placez la souris sur un coussinet stérile et nucléez l’œil en appuyant sur une pince à épiler de style 5/45 sur la zone orbitale pour induire la proptose, puis déplacez la pince à épiler vers la partie postérieure de l’œil et tirez doucement pour enlever l’œil en vous assurant que le nerf optique est toujours intact. Lors de l’utilisation de forceps, immergez les yeux dans un tube microcentrifuge de 2 millilitres contenant 5% de povidone iodée. Incuber les yeux à température ambiante pendant 2 à 3 minutes.Retirez les yeux de la povidone iodée et placez-les dans une boîte de Pétri. Lors de l’utilisation d’une pipette de transfert stérile, lavez les yeux avec la solution saline équilibrée de Hanks jusqu’à ce que la couleur orange de la povidone iodée ait disparu. Cela prend environ 2 à 3 lavages.Placez les yeux dans une nouvelle boîte de Petri et immergez-les dans un milieu de croissance complet des cellules EPR froides. À partir de là, vous pouvez commencer à disséquer sous un microscope à dissection. Au microscope, utilisez une pince à épiler et/ou des ciseaux Vannas pour tirer ou couper le tissu conjonctif dans les muscles extraoculaires.Les yeux peuvent ensuite être maintenus pendant une heure dans des milieux de culture cellulaire EPR froids. Cependant, il est préférable de passer directement à l’étape suivante après avoir nettoyé le globe oculaire. Transférer les yeux dans un tube microcentrifuge de 2 millilitres contenant la solution d’enzyme A, puis incuber les yeux dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes.Retirez les yeux de la solution d’enzyme A et placez-les dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 millilitres contenant la solution d’enzyme B, puis placez-les dans un incubateur et incuber à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes. Retirez les yeux de l’enzyme B et placez-les dans une boîte de Petri de 60 millimètres et immergez-les et complétez le milieu de croissance des cellules EPR, puis incuber les yeux à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes. Placez la capsule sous le microscope à dissection et commencez à disséquer.Utilisez des pinces M5S et une aiguille de seringue pour faire une incision dans la section ora seratta. Maintenant, avec deux pinces, saisissez la partie interne de l’incision avec une pince et saisissez la cornée avec l’autre pince. Commencez à déchirer lentement la cornée de la rétine en tirant la cornée.Assurez-vous de déchirer par petits incréments et de descendre la déchirure lorsque vous retirez la cornée. Cela garantira que le RPE restera en grande partie intact et vous obtiendrez une déchirure plus propre. Une fois que la cornée est complètement détachée, vous devriez pouvoir voir l’iris et le cristallin.Retirez à la fois l’iris et la lentille avec une pince pour maintenir la pureté de l’isolement. Pour retirer la rétine neurale de la couche EPR, saisissez la couche externe de l’œilleton avec une pince à épiler et placez un bras d’une deuxième pince à épiler entre les couches RPE et neurale. De là, retirez doucement ou retirez la rétine neurale de la couche d’EPR, puis jetez la rétine neurale.Déplacez la couche RPE à un autre endroit de la capsule, exempte de débris. Pour séparer l’EPR de la choroïde et de la sclérotique, grattez doucement l’intérieur de l’œilleton avec une pince à épiler de style 5/45 pour assurer la séparation des cellules EPR. Les cellules EPR semblent troubles lorsqu’elles sont en suspension et complètent le milieu de croissance des cellules EPR.Aspirer les cellules à l’aide d’une pipette de transfert stérile de 3,2 millilitres et transférer dans un nouveau tube centrifuge de 15 millilitres contenant un milieu de croissance complet des cellules EPR. Les cellules peuvent être centrifugées à 300g pendant 10 minutes à température ambiante. Vous pouvez ensuite aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un milieu de croissance de cellules EPR chauffé.Plaquez les cellules sur une boîte de Petri de 100 millimètres et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de CO2. Ces images montrent une isolation réussie au passage 0 et au passage 1, ce qui est évident par la pigmentation des cellules EPR. Au passage 4, les cellules deviennent moins caractéristiques et présentent moins de pigments, montrent un aspect fusiforme ou deviennent plus robustes avec une plus grande surface.Nous avons validé les cellules EPR avec un marqueur spécifique de l’EPR, RPE65 et une protéine F-actine du cytosquelette. Nous avons également vérifié la contamination potentielle par les cellules de Muller en colorant avec un marqueur spécifique aux cellules de Muller, la vimentine. Ce protocole est une adaptation simplifiée des protocoles existants.Le protocole utilise des matériaux et des équipements connexes disponibles dans la plupart des laboratoires de recherche, ce qui aidera à isoler efficacement les cellules RPE primaires de souris.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

L&#39;isolement des cellules souches rétiniennes de l&#39;Oeil de la souris

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Recherche

Biologie

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolement des cellules immunitaires des tumeurs primitives

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

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Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Culture primaire de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...