Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) Fonds R01 EY029751-04

Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien des IACUC-Tierprotokolls Nr. 21063 der Universität Oakland und den Richtlinien der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung verwendet.
1. Lösungsvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie das komplette RPE-Zellkulturmedium vor, indem Sie Dulbeccos modifizierte Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) mit 25% fetalem Rinderserum (FBS), 1,5% Penicillin / Streptomycin und 0,02% Gentamicin ergänzen.</li...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

Das aktuelle Protokoll ist ein berichtetes, modifiziertes und vereinfachtes detailliertes Verfahren zur RPE-Isolierung von Mausaugen. Das Protokoll umfasst Enukleation, Dissektion, Sammlung, Seeding, Kultur und Charakterisierung von RPE-Zellen, die aus Mausaugen isoliert wurden.
Es gibt einige Einschränkungen und kritische Schritte, die für eine erfolgreiche RPE-Isolierung erfüllt werden müssen, z. B. das Alter der Mäuse, die Anzahl der sezierten Augen, die Größe der Gewebekulturplatte ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Retinale pigmentierte Epithelzellen (RPE) befinden sich zwischen der Aderhaut und der neuronalen Netzhaut und bilden eine einfache Monoschicht von quaderförmigen Zellen, die hinter den Photorezeptorzellen (PR) liegen1. Das RPE spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer gesunden Umgebung für PR-Zellen, hauptsächlich durch die Verringerung der übermäßigen Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der daraus resultierenden oxidativen Schäden1. RPE-Zellen überwachen viele Funktionen, wie die Umwandlung und Speicherung von Retinoide, die Absorption von Streulicht, den Flüssigkeits- und Ionentransport und die Phagozytose der abgestoßenen PR-Außensegmentmembran 2,3. Veränderungen in der RPE (Morphologie/Funktion) können ihre Funktion beeinträchtigen und zu einer Retinopathie führen, und dies ist ein gemeinsames Merkmal vieler Augenerkrankungen4. Viele Augenerkrankungen sind mit Veränderungen in der Morphologie und Funktion von RPE-Zellen verbunden, darunter einige genetische Erkrankungen wie Retinitis pigmentosa, Lebersche kongenitale Amaurose und Albinismus 4,5,6 sowie altersbedingte Augenerkrankungen wie diabetische Retinopathie (DR) und altersbedingte Makuladegeneration (AMD)7,8 . Menschliche Zellen sind am wünschenswertesten, daher wäre es ideal, RPE-Störungen in primären menschlichen RPE-Zellen zur Bildung von RPE-Monoschichten zu untersuchen. Ethische Fragen und die begrenzte Verfügbarkeit menschlicher Spender aufgrund der Tatsache, dass die meisten dieser Störungen zu Morbiditätführen 9, aber nicht unbedingt zur Mortalität10, verhindern dadurch die Isolierung primärer humaner RPE-Zellen. Dies macht die Kultivierung von RPE-Zellen von nichtmenschlichen Tierspendern zu einer bevorzugten Alternative. Nagetiere, insbesondere Mäuse, gelten als hervorragendes Modell für die Untersuchung verschiedener Augenerkrankungen, da die transgene Technologie bei diesen Arten weiter verbreitet ist11. Obwohl die Verwendung von kultivierten primären RPE-Zellen viele Vorteile bietet, war es schwierig, wachsende Zellen für viele Passagen aufrechtzuerhalten oder die Zellen zu speichern und wiederzuverwenden. Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist das Alter der Mäuse; Mäuse, die für die RPE-Isolierung verwendet werden, sollten ein sehr junges Alter haben (18-21 Tage alt ist optimal), da es schwierig war, RPE-Zellen von erwachsenen Mäusen zu kultivieren11,12,13. RPE-Zellen können in jedem Alter aus Mausaugen isoliert werden, jedoch waren bis zu vier Zellpassagen nur bei jungen Mäusen (18-21 Tage alt) erfolgreich. Die RPE-Isolierung aus Mausnetzhäuten unter Verwendung von C57BL6-Mäusen und transgenen Mäusen mit Deletion der N-Methyl-D-Aspartatrezeptoren (NMDARs) an den RPE-Zellen wurde durchgeführt, um die Wirkung von erhöhtem Aminosäure-Homocystein auf die Entwicklung und das Fortschreiten von AMD14 zu untersuchen. Darüber hinaus halfen isolierte primäre RPE-Zellen dabei, ein therapeutisches Ziel für AMD vorzuschlagen, indem sie die NMDARs an RPE-Zellen hemmten14. Es gibt einige NMDAR-Blocker, die von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassen sind und derzeit zur Behandlung von mittelschwerer bis schwerer Verwirrung (Demenz) im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit (AD) eingesetzt werden, wie Memantin16, das ein potenzielles therapeutisches Ziel für AMD14 sein könnte. Darüber hinaus wurden isolierte primäre Maus-RPE-Zellen für den Nachweis von Entzündungsmarkern und die vorgeschlagene Induktion von Entzündungen als zugrunde liegenden Mechanismus für Homocystein-induzierte Merkmale von AMD und AD unter Verwendung einer genetisch veränderten Maus (CBS) verwendet, die einen hohen Homocysteinspiegel aufweist16,17.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um RPE-Zellen sowohl von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen als auch von transgenen Mäusen zu isolieren, die in unserem Labor als vereinfachte Anpassung anderer veröffentlichter Isolationsprotokolle13,18,19 entwickelt wurden, um ein leicht anwendbares und zuverlässiges Protokoll zu erreichen. Es gibt keine Geschlechtspräferenz in diesem Protokoll. Während das Alter der Mäuse für den Isolationsprozess entscheidend ist, wurden junge, ältere Mäuse (18-21 Tage alt) und ältere Mäuse in jedem Alter (bis zu 12 Monate) für die RPE-Isolierung verwendet. Wir stellten jedoch fest, dass die RPE-Zellen, die aus den jungen Mäusen isoliert wurden, länger lebten und bis zu vier Passagen durchgeführt werden konnten. Die RPE-Zellen, die aus älteren Mäusen isoliert wurden, könnten ein- oder zweimal durchquert werden, dann würden sie aufhören zu wachsen und ihre Form ändern, um länglicher zu sein (Fibroblasten-ähnliche Zellen). Ein Verlust der Pigmentierung und eine verminderte Adhäsion an der Gewebekulturplatte, gefolgt von einer Ablösung, wurden ebenfalls beobachtet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

Die retinale pigmentierte Epithelschicht (RPE) liegt unmittelbar hinter den Photorezeptoren und beherbergt ein komplexes Stoffwechselsystem, das mehrere entscheidende Rollen bei der Aufrechterhaltung der Funktion der Photorezeptoren spielt. Daher sind die RPE-Struktur und -Funktion unerlässlich, um ein normales Sehvermögen aufrechtzuerhalten. Dieses Manuskript stellt ein etabliertes Protokoll für die primäre RPE-Zellisolierung von Mäusen vor. Die RPE-Isolierung ist ein großartiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der RPE-Pathologie in den verschiedenen Mausmodellen für Augenerkrankungen zugrunde liegen. Darüber hinaus kann die RPE-Isolierung helfen, primäre Maus-RPE-Zellen zu vergleichen, die aus Wildtyp- und genetisch veränderten Mäusen isoliert wurden, sowie Medikamente zu testen, die die Entwicklung von Therapien für Sehstörungen beschleunigen können. Das Manuskript stellt ein schrittweises RPE-Isolationsprotokoll vor; Der gesamte Vorgang von der Enukleation bis zur Aussaat dauert ca. 4 Stunden. Das Medium sollte 5-7 Tage nach der Aussaat nicht gewechselt werden, damit die isolierten Zellen ungestört wachsen können. Diesem Prozess folgt die Charakterisierung von Morphologie, Pigmentierung und spezifischen Markern in den Zellen mittels Immunfluoreszenz. Zellen können maximal drei- oder viermal durchlaufen werden.

Validierung der Spezifität, Reinheit und Barrierefunktion/-bildung isolierter RPE-Zellen Die isolierten Zellen wurden unter einem Lichtmikroskop untersucht, um ihre Lebensfähigkeit, Morphologie und Pigmentierung zu überprüfen. Bilder von P0 und P1 (Abbildung 1A,B) und Bilder von P0 und P4 wurden aufgenommen (Abbildung 1C,D), um die Veränderungen in den Zellen zu zeigen; Form, Größe und Pigmentierung, als die Passagen zu...

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Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Dieses Protokoll wird einen einfachen und effizienten Weg zur erfolgreichen Isolierung primärer pigmentierter Epithelzellen der Maus skizzieren. Retinale pigmentierte Epithelzellen spielen eine sehr wichtige Rolle, um die Photorezeptorzellen zu erhalten und die normale Funktion der Netzhaut zu gewährleisten. Unser Labor isoliert primäre pigmentierte Epithelzellen der Maus als wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der äußeren Blut-Netzhaut-Barriere und verwandter Krankheiten wie altersbedingter Makuladegeneration.Um die Mausaugen zu extrahieren, euthanasieren Sie die Maus ethisch nach den von Ihrer Institution zugelassenen Methoden, legen Sie dann die Maus auf eine sterile Unterlage und kernisieren Sie das Auge, indem Sie eine 5/45-Pinzette auf den Orbitalbereich drücken, um Proptose zu induzieren, dann bewegen Sie die Pinzette zum hinteren Teil des Auges und ziehen Sie vorsichtig, um das Auge zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Sehnerv noch intakt ist. Tauchen Sie die Augen mit einer Pinzette in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 5% Povidon-Jod enthält. Inkubieren Sie die Augen bei Raumtemperatur für 2 bis 3 Minuten.Entfernen Sie die Augen vom Povidonjod und legen Sie sie in eine Petrischale. Während Sie eine sterile Transferpipette verwenden, waschen Sie die Augen mit Hanks' Balanced Saline Solution, bis die orange Farbe des Povidon-Jods verschwunden ist. Dies dauert ungefähr 2 bis 3 Wäschen.Legen Sie die Augen in eine neue Petrischale und tauchen Sie sie in kalte, vollständige RPE-Zellwachstumsmedien. Von dort aus können Sie mit dem Sezieren unter einem Seziermikroskop beginnen. Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine Pinzette und / oder eine Vannas-Schere, um Bindegewebe in extraokularen Muskeln zu ziehen oder wegzuschneiden.Die Augen können dann eine Stunde lang in kalten RPE-Zellkulturmedien gehalten werden. Es wird jedoch bevorzugt, nach der Reinigung des Augapfels direkt mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Übertragen Sie die Augen in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das das Enzym A-Lösung enthält, und inkubieren Sie die Augen dann 40 Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.Entfernen Sie die Augen aus der Enzym-A-Lösung und legen Sie sie in ein neues 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das die Enzym-B-Lösung enthält, legen Sie sie dann in einen Inkubator und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 50 Minuten. Entfernen Sie die Augen von Enzym B und legen Sie sie in eine 60-Millimeter-Petrischale und tauchen Sie sie und vervollständigen Sie RPE-Zellwachstumsmedien, dann inkubieren Sie die Augen bei 4 Grad Celsius für 30 Minuten. Stellen Sie die Schale unter das Seziermikroskop und beginnen Sie mit dem Sezieren.Verwenden Sie eine M5S-Pinzette und eine Nadel einer Spritze, um einen Schnitt im Ora Seratta-Abschnitt zu machen. Fassen Sie nun mit zwei Pinzetten den inneren Teil des Einschnitts mit einer Pinzette und greifen Sie die Hornhaut mit der anderen Zange. Beginnen Sie, die Hornhaut langsam von der Netzhaut zu reißen, indem Sie die Hornhaut ziehen.Achten Sie darauf, in kleinen Schritten zu reißen und die Träne nach unten zu bewegen, während Sie die Hornhaut entfernen. Dadurch wird sichergestellt, dass der RPE größtenteils intakt bleibt und Sie einen saubereren Riss erhalten. Sobald die Hornhaut vollständig abgelöst ist, sollten Sie die Iris und die Linse sehen können.Entfernen Sie sowohl die Iris als auch die Linse mit einer Pinzette, um die Reinheit der Isolierung zu erhalten. Um die neuronale Netzhaut von der RPE-Schicht zu entfernen, greifen Sie die äußere Schicht der Augenmuschel mit einer Pinzette und positionieren Sie einen Arm einer zweiten Pinzette zwischen der RPE- und der Neuralschicht. Von dort ziehen oder schöpfen Sie die neuronale Netzhaut vorsichtig von der RPE-Schicht weg und werfen Sie dann die neuronale Netzhaut weg.Verschieben Sie die RPE-Ebene an eine andere Stelle auf der Schale, frei von Ablagerungen. Um die RPE von Aderhaut und Sklera zu trennen, kratzen Sie die Innenseite der Augenmuschel vorsichtig mit einer 5/45-Pinzette ab, um die Trennung der RPE-Zellen sicherzustellen. Die RPE-Zellen erscheinen trüb, wenn sie suspendiert und vollständig RPE-Zellwachstumsmedien sind.Die Zellen werden mit einer sterilen 3,2-Milliliter-Transferpipette abgesaugt und in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit kompletten RPE-Zellwachstumsmedien überführt. Die Zellen können bei 300g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert werden. Sie können dann den Überstand aussaugen und das Pellet in erwärmten RPE-Zellwachstumsmedien resuspendieren.Die Zellen auf eine 100-Millimeter-Petrischale legen und bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 inkubieren. Diese Bilder zeigen eine erfolgreiche Isolierung bei Passage 0 und Passage 1, was sich in der Pigmentierung der RPE-Zellen zeigt. Bei Passage 4 werden die Zellen weniger charakteristisch und weisen weniger Pigment auf, zeigen ein spindelartiges Aussehen oder werden mit einer größeren Oberfläche robuster.Wir validierten die RPE-Zellen mit einem RPE-spezifischen Marker, RPE65 und einem Zytoskelettprotein F-Aktin. Wir überprüften auch auf eine mögliche Kontamination mit Muller-Zellen durch Färbung mit einem Muller-Zell-spezifischen Marker, Vimentin. Dieses Protokoll ist eine vereinfachte Anpassung bestehender Protokolle.Das Protokoll verwendet Materialien und zugehörige Geräte, die in den meisten Forschungslabors verfügbar sind, was dazu beiträgt, primäre RPE-Zellen der Maus effektiv zu isolieren.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Forschung

Biologie

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...