Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לעיניים (NEI), קרן מכון העיניים הלאומי (NEI) R01 EY029751-04

נעשה שימוש בבעלי חיים בהתאם להנחיות פרוטוקול החיות IACUC של אוניברסיטת אוקלנד מספר 21063 וההנחיות של הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים בחקר עיניים וראייה.
1. הכנת פתרון
<ol><li>הכינו את מדיית תרבית תאי ה-RPE המלאה על ידי השלמת תערובת הנשר המתוקן הבינוני/מזין F-12 (DMEM/F12) של דולבקו עם 25%...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי הוא הליך מפורט מדווח, שונה ופשוט לבידוד RPE מעיני עכבר. הפרוטוקול כולל אנוקליציה, דיסקציה, איסוף, זריעה, תרבית ואפיון של תאי RPE שבודדו מעיני עכבר.
ישנן כמה מגבלות וצעדים קריטיים שיש למלא לבידוד RPE מוצלח, כגון גיל העכברים, מספר העיניים שנותחו, גודל צלחת תרבית הרק...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

תאי אפיתל פיגמנטי רשתית (RPE) ממוקמים בין הכורואיד לרשתית העצבית, ויוצרים שכבה חד-שכבתית פשוטה של תאים קובואידים הנמצאת מאחורי תאי הפוטורצפטור (PR)1. ה-RPE ממלא תפקיד קריטי בשמירה על סביבה בריאה לתאי PR, בעיקר על ידי הפחתת הצטברות מופרזת של מיני חמצן תגובתי (ROS) ונזקי חמצון כתוצאה מכך1. תאי RPE מפקחים על תפקודים רבים, כגון המרה ואחסון של רטינואידים, קליטת אור מפוזר, הובלת נוזלים ויונים, ופאגוציטוזה של קרום המקטע החיצוני PR 2,3. שינויים ב-RPE (מורפולוגיה/תפקוד) יכולים לפגוע בתפקודם ולהוביל לרטינופתיה וזוהי תכונה משותפת להפרעות עיניים רבות4. מחלות עיניים רבות קשורות לשינויים במורפולוגיה ובתפקוד של תאי RPE, כולל מחלות גנטיות מסוימות כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, אמאורוזיס מולד של לבר ולבקנות 4,5,6, כמו גם הפרעות עיניים הקשורות לגיל כגון רטינופתיה סוכרתית (DR) וניוון מקולרי תלוי גיל (AMD)7,8 . תאים אנושיים הם הרצויים ביותר, ולכן זה יהיה אידיאלי לחקור הפרעות RPE בתאי RPE אנושיים ראשוניים ליצירת מונולרים RPE. עם זאת, עניינים אתיים והזמינות המוגבלת של תורמים אנושיים בשל העובדה שרוב ההפרעות הללו מובילות לתחלואה9, אך לא בהכרח לתמותה10, ובכך מונעות בידוד של תאי RPE אנושיים ראשוניים. עובדה זו הופכת את התרבות של תאי RPE מתורמים לא אנושיים של בעלי חיים לחלופה מועדפת. מכרסמים, במיוחד עכברים, נחשבים למודל נהדר לחקר מחלות עיניים שונות מכיוון שטכנולוגיה מהונדסת מבוססת באופן נרחב יותר במינים אלה11. אף על פי שהשימוש בתאי RPE ראשוניים בתרבית מציע יתרונות רבים, היה קשה לשמור על תאים גדלים במשך מעברים רבים, או לאחסן את התאים ולעשות בהם שימוש חוזר. המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא גיל העכברים; עכברים המשמשים לבידוד RPE צריכים להיות בגיל צעיר מאוד (18-21 ימים הוא אופטימלי) מכיוון שהיה קשה לתרבת תאי RPE מעכברים בוגרים11,12,13. ניתן לבודד תאי RPE מעיני עכברים בכל גיל, אולם עד ארבעה מעברי תאים הצליחו רק עם עכברים צעירים (בני 18-21 ימים). בידוד RPE מרשתיות עכברים, תוך שימוש הן בעכברי C57BL6 והן בעכברים מהונדסים עם מחיקת קולטני N-מתיל-D-אספרטט (NMDARs) בתאי ה-RPE, בוצע כדי לחקור את ההשפעה של הומוציסטאין של חומצת אמינו מוגברת על ההתפתחות וההתקדמות של AMD14. בנוסף, תאי RPE ראשוניים מבודדים סייעו בהצעת מטרה טיפולית ל-AMD על ידי עיכוב של NMDARs בתאי RPE14. ישנם כמה חוסמי NMDAR שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) ומשמשים כיום לטיפול בבלבול בינוני עד חמור (דמנציה) הקשור למחלת אלצהיימר (AD), כגון ממנטין16, אשר יכול להיות מטרה טיפולית פוטנציאלית עבור AMD14. יתר על כן, תאי RPE ראשוניים מבודדים של עכברים שימשו לזיהוי סמני דלקת ולאינדוקציה המוצעת של דלקת כמנגנון בסיסי לתכונות הנגרמות על ידי הומוציסטאין של AMD ו- AD באמצעות עכבר מהונדס גנטית (CBS), המציג רמה גבוהה של הומוציסטאין16,17.
פרוטוקול זה שימש לבידוד תאי RPE הן מעכברי C57BL/6 מסוג בר והן מעכברים מהונדסים שפותחו במעבדה שלנו כהתאמה פשוטה של פרוטוקולי בידודאחרים שפורסמו 13,18,19 כדי להגיע לפרוטוקול ישים ואמין בקלות. אין העדפת מין בפרוטוקול זה. בעוד שגילי עכברים הם קריטיים לתהליך הבידוד, עכברים צעירים ומבוגרים יותר (גילאי 18-21 יום) ועכברים מבוגרים יותר בכל גיל (עד 12 חודשים) שימשו לבידוד RPE. עם זאת, שמנו לב שתאי ה-RPE שבודדו מהעכברים בגיל צעיר חיו זמן רב יותר, וניתן היה לבצע עד ארבעה מעברים. ניתן היה להעביר את תאי ה-RPE שבודדו מעכברים מבוגרים פעם או פעמיים, ואז הם יפסיקו לגדול בקצב רגיל וישנו את צורתם כך שיהיו מוארכים יותר (תאים דמויי פיברובלסט). כמו כן נצפה אובדן פיגמנטציה וירידה בהידבקות לצלחת תרבית הרקמה ואחריה ניתוק.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

שכבת האפיתל הפיגמנטי ברשתית (RPE) נמצאת מיד מאחורי הפוטורצפטורים ומכילה מערכת מטבולית מורכבת הממלאת מספר תפקידים קריטיים בשמירה על תפקודם של הפוטורצפטורים. לפיכך, המבנה והתפקוד של RPE חיוניים לשמירה על ראייה תקינה. כתב יד זה מציג פרוטוקול מבוסס לבידוד תאי RPE של עכבר ראשוני. בידוד RPE הוא כלי נהדר לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפתולוגיה של RPE במודלים שונים של עכברים של הפרעות עיניים. יתר על כן, בידוד RPE יכול לסייע בהשוואת תאי RPE ראשוניים של עכברים שבודדו מעכברים מסוג בר ומעכברים מהונדסים גנטית, כמו גם בבדיקת תרופות שיכולות להאיץ את התפתחות הטיפול בהפרעות ראייה. כתב היד מציג פרוטוקול בידוד RPE שלב אחר שלב; ההליך כולו, מן enucleation כדי זריעה, לוקח בערך 4 שעות. אין לשנות את המדיה במשך 5-7 ימים לאחר הזריעה, כדי לאפשר צמיחה של התאים המבודדים ללא הפרעה. תהליך זה מלווה באפיון של מורפולוגיה, פיגמנטציה וסמנים ספציפיים בתאים באמצעות אימונופלואורסצנציה. ניתן להעביר תאים לכל היותר שלוש או ארבע פעמים.

אימות הספציפיות, הטוהר ותפקוד המחסום/היווצרות של תאי RPE מבודדים התאים שבודדו נבדקו תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא את הכדאיות, המורפולוגיה והפיגמנטציה שלהם. תמונות מ-P0 ו-P1 (איור 1A,B) ותמונות מ-P0 ו-P4 צולמו (איור 1C,D) כדי להראות את השינויים בתאים; ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט לבידוד תאי אפיתל פיגמנטציה ברשתית (RPE) מעיני עכבר באופן מדורג. הפרוטוקול כולל אנוקליזציה ונתיחה של עיני עכבר, ולאחר מכן בידוד, זריעה והתרבות של תאי RPE.

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

פרוטוקול זה יתווה דרך קלה ויעילה לבודד בהצלחה תאי אפיתל פיגמנטים ראשוניים ברשתית של עכברים. תאי אפיתל פיגמנטציה ברשתית ממלאים תפקיד חשוב מאוד בשמירה על תאי הפוטורצפטור ולהבטיח את תפקודה התקין של הרשתית. המעבדה שלנו מבודדת תאי אפיתל פיגמנטיים ראשוניים של עכברים ככלי חשוב לחקר מחסום הדם-רשתית החיצוני ומחלות קשורות כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל.כדי לחלץ את עיני העכבר, יש להרדים את העכבר באופן אתי בהתאם לשיטות המאושרות על ידי המוסד שלך, לאחר מכן להניח את העכבר על משטח תחתון סטרילי ולהניף את העין על ידי לחיצה על פינצטה בסגנון 5/45 על אזור המסלול כדי לגרום לפרופטוזה, ואז להזיז את הפינצטה לחלק האחורי של העין ולמשוך בעדינות כדי להסיר את העין ולוודא שעצב הראייה עדיין שלם. בעת שימוש במלקחיים, טבלו את העיניים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מיליליטר המכיל 5% יוד פובידון. לדגור את העיניים בטמפרטורת החדר במשך 2 עד 3 דקות.הסר את העיניים מן יוד povidone ומניחים אותם בצלחת פטרי. בעת שימוש פיפטה העברה סטרילית, לשטוף את העיניים עם תמיסת מלח מאוזנת של Hanks'Balanced עד הצבע הכתום של יוד פובידון נעלם. זה לוקח בערך 2 עד 3 כביסות.הניחו את העיניים בצלחת פטרי חדשה וטבלו אותן במדיית גדילת תאי RPE מלאה וקרה. משם, אתה יכול להתחיל לנתח תחת מיקרוסקופ לנתח. מתחת למיקרוסקופ, השתמש בפינצטה ו/או במספריים של Vannas כדי למשוך או לחתוך רקמת חיבור בשרירים חוץ-עיניים.לאחר מכן ניתן להחזיק את העיניים במשך שעה במדיה של תרבית תאי RPE קרה. עם זאת, עדיף להמשיך ישירות לשלב הבא לאחר ניקוי גלגל העין. מעבירים את העיניים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מיליליטר המכיל את האנזים A תמיסה, ואז דוגרים את העיניים בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.הסר את העיניים מתמיסת האנזים A והנח אותן בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2 מיליליטר המכיל את תמיסת האנזים B, ולאחר מכן הנח אותן בתוך אינקובטור ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות. הסר את העיניים מהאנזים B והנח אותן בצלחת פטרי של 60 מילימטר וטבל אותן והשלם את מדיית הצמיחה של תאי RPE, ולאחר מכן דגירה של העיניים ב -4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מניחים את התבשיל מתחת למיקרוסקופ המנתח ומתחילים לנתח.השתמש מלקחיים M5S ומחט של מזרק כדי לבצע חתך בקטע ora seratta. עכשיו עם שני מלקחיים, לתפוס את החלק הפנימי של החתך עם מלקחיים אחד ולתפוס את הקרנית עם הכוח השני. מתחילים לקרוע באיטיות את הקרנית מהרשתית על ידי משיכת הקרנית.הקפידו לקרוע במרווחים קטנים ולעבור במורד הקרע כשאתם מסירים את הקרנית. זה יבטיח כי RPE יישאר בעיקר שלם ואתה תקבל קרע נקי יותר. ברגע שהקרנית מנותקת לחלוטין, אתה אמור להיות מסוגל לראות את הקשתית והעדשה.הסר הן את הקשתית והן את העדשה עם מלקחיים כדי לשמור על טוהר הבידוד. כדי להסיר את הרשתית העצבית משכבת ה-RPE, תפסו את השכבה החיצונית של העין בפינצטה אחת והניחו זרוע של פינצטה שנייה בין ה-RPE לשכבה העצבית. משם, משכו בעדינות או הוציאו את הרשתית העצבית הרחק משכבת ה-RPE, ולאחר מכן השליכו את הרשתית העצבית.הזיזו את שכבת ה-RPE למקום אחר על המנה ללא לכלוך. כדי להפריד את ה-RPE מהכורואיד והסקלרה, יש לגרד בעדינות את החלק הפנימי של ה-EYECUP בעזרת פינצטה בסגנון 5/45 כדי להבטיח את הפרדת תאי ה-RPE. תאי ה-RPE נראים מעוננים כאשר הם מושעים ומדיית הצמיחה המלאה של תאי RPE.שאפו את התאים באמצעות פיפטה סטרילית של 3.2 מיליליטר והעבירו לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר המכיל מדיה מלאה לצמיחת תאי RPE. התאים יכולים להיות צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן תוכל לשאוף החוצה את הסופר-נטנט ולהשהות את הכדור במדיית גידול תאי RPE מחוממת.צלחת את התאים על צלחת פטרי 100 מ"מ ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. תמונות אלה מראות בידוד מוצלח במעבר 0 ובמעבר 1, אשר ניכר על ידי פיגמנטציה של תאי RPE. במעבר 4, התאים הופכים פחות אופייניים ומפגינים פחות פיגמנט, מראים מראה דמוי ציר או הופכים לחזקים יותר עם שטח פנים גדול יותר.אימתנו את תאי ה-RPE באמצעות סמן ספציפי ל-RPE, RPE65 וחלבון ציטוסקטלי F-אקטין. בדקנו גם זיהום פוטנציאלי בתאי מולר על ידי צביעה בסמן ספציפי לתא מולר, וימנטין. פרוטוקול זה הוא התאמה פשוטה של פרוטוקולים קיימים.הפרוטוקול משתמש בחומרים ובציוד נלווה הזמינים ברוב מעבדות המחקר, מה שיסייע לבודד תאי RPE ראשוניים של עכברים בצורה יעילה.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...