Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo R01 EY029751-04 del National Eye Institute (NEI)

Gli animali sono stati utilizzati secondo le linee guida del protocollo animale IACUC dell'università di Oakland numero 21063 e le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.
1. Preparazione della soluzione
<ol><li>Preparare il terreno di coltura cellulare RPE completo integrando il mezzo di coltura Modified Eagle / Nutrient Mixture F-12 di Dulbecco (DMEM / F12) con il 25% di siero bovino fetale (FBS), l'1,5% di penicillina / ...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

Il protocollo attuale è una procedura dettagliata segnalata, modificata e semplificata per l'isolamento RPE dagli occhi del mouse. Il protocollo include enucleazione, dissezione, raccolta, semina, coltura e caratterizzazione di cellule RPE isolate dagli occhi di topo.
Ci sono alcune limitazioni e passaggi critici che devono essere soddisfatti per un isolamento RPE di successo, come l'età dei topi, il numero di occhi sezionati, le dimensioni della piastra o del piatto di coltura tissutale e l...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) si trovano tra la coroide e la retina neurale, formando un semplice monostrato di cellule cuboidali che si trova dietro le cellule dei fotorecettori (PR)1. L'RPE svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento di un ambiente sano per le cellule PR, principalmente riducendo l'eccessivo accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il conseguente danno ossidativo1. Le cellule RPE sovrintendono a molte funzioni, come la conversione e lo stoccaggio dei retinoidi, l'assorbimento della luce diffusa, il trasporto di fluidi e ioni e la fagocitosi della membrana del segmento esterno PR 2,3. Alterazioni dell'RPE (morfologia/funzione) possono compromettere la loro funzione portando alla retinopatia e questa è una caratteristica comune condivisa da molti disturbi oculari4. Molte malattie oculari sono associate ad alterazioni della morfologia e della funzione delle cellule RPE, tra cui alcune malattie genetiche come la retinite pigmentosa, l'amaurosi congenita di Leber e l'albinismo 4,5,6, nonché disturbi oculari legati all'età come la retinopatia diabetica (DR) e la degenerazione maculare legata all'età (AMD)7,8 . Le cellule umane sono le più desiderabili, quindi sarebbe ideale studiare i disturbi RPE nelle cellule RPE umane primarie per formare monostrati RPE. Tuttavia, le questioni etiche e la limitata disponibilità di donatori umani a causa del fatto che la maggior parte di questi disturbi portano alla morbilità9, ma non necessariamente alla mortalità10, impediscono così l'isolamento delle cellule RPE umane primarie. Ciò rende la coltura di cellule RPE da donatori animali non umani un'alternativa preferita. I roditori, in particolare i topi, sono considerati un ottimo modello per lo studio di diverse malattie oculari poiché la tecnologia transgenica è più ampiamente affermata in queste specie11. Anche se l'uso di cellule RPE primarie in coltura offre molti vantaggi, è stato difficile mantenere le cellule in crescita per molti passaggi, o immagazzinare e riutilizzare le cellule. La principale limitazione di questo protocollo è l'età dei topi; i topi utilizzati per l'isolamento RPE dovrebbero essere di età molto giovane (18-21 giorni è ottimale) poiché è stato difficile coltivare cellule RPE da topi adulti11,12,13. Le cellule RPE possono essere isolate dagli occhi dei topi a qualsiasi età, tuttavia fino a quattro passaggi cellulari hanno avuto successo solo con topi giovani (18-21 giorni di età). L'isolamento RPE dalle retine di topo, utilizzando sia topi C57BL6 che topi transgenici con delezione dei recettori N-metil-D-aspartato (NMDAR) nelle cellule RPE, è stato eseguito per studiare l'effetto dell'omocisteina aminoacidica elevata sullo sviluppo e la progressione dell'AMD14. Inoltre, cellule RPE primarie isolate hanno contribuito a proporre un bersaglio terapeutico per AMD mediante l'inibizione degli NMDAR alle cellule RPE14. Ci sono alcuni bloccanti NMDAR che sono approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) e sono attualmente utilizzati per trattare la confusione da moderata a grave (demenza) correlata alla malattia di Alzheimer (AD), come la memantina16, che potrebbe essere un potenziale bersaglio terapeutico per AMD14. Inoltre, cellule RPE primarie di topo isolate sono state utilizzate per la rilevazione di marcatori infiammatori e l'induzione proposta dell'infiammazione come meccanismo sottostante per le caratteristiche indotte dall'omocisteina di AMD e AD utilizzando un topo geneticamente modificato (CBS), che presenta un alto livello di omocisteina16,17.
Questo protocollo è stato utilizzato per isolare le cellule RPE sia da topi C57BL / 6 wild-type che da topi transgenici sviluppati nel nostro laboratorio come adattamento semplificato di altri protocolli di isolamento pubblicati13,18,19 per raggiungere un protocollo facilmente applicabile e affidabile. Non c'è preferenza sessuale in questo protocollo. Mentre l'età dei topi è fondamentale per il processo di isolamento, per l'isolamento RPE sono stati utilizzati topi giovani e anziani (18-21 giorni) e topi più anziani di qualsiasi età (fino a 12 mesi). Tuttavia, abbiamo notato che le cellule RPE isolate dai topi di giovane età vivevano più a lungo e potevano essere eseguiti fino a quattro passaggi. Le cellule RPE isolate dai topi più anziani potrebbero essere fatte passare una o due volte, quindi smetterebbero di crescere a un ritmo normale e cambierebbero la loro forma per essere più allungate (cellule simili ai fibroblasti). È stata osservata anche perdita di pigmentazione e diminuzione dell'adesione alla piastra di coltura tissutale seguita da distacco.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

Lo strato di epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova immediatamente dietro i fotorecettori e ospita un complesso sistema metabolico che svolge diversi ruoli critici nel mantenimento della funzione dei fotorecettori. Pertanto, la struttura e la funzione RPE sono essenziali per sostenere la visione normale. Questo manoscritto presenta un protocollo stabilito per l'isolamento delle celle RPE primarie del topo. L'isolamento RPE è un ottimo strumento per studiare i meccanismi molecolari alla base della patologia RPE nei diversi modelli murini di disturbi oculari. Inoltre, l'isolamento RPE può aiutare a confrontare le cellule RPE primarie di topo isolate da topi wild-type e geneticamente modificati, oltre a testare farmaci che possono accelerare lo sviluppo della terapia per i disturbi visivi. Il manoscritto presenta un protocollo di isolamento RPE passo-passo; L'intera procedura, dall'enucleazione alla semina, richiede circa 4 ore. Il terreno non deve essere cambiato per 5-7 giorni dopo la semina, per consentire la crescita delle cellule isolate senza disturbi. Questo processo è seguito dalla caratterizzazione della morfologia, della pigmentazione e dei marcatori specifici nelle cellule tramite immunofluorescenza. Le celle possono essere fatte passare un massimo di tre o quattro volte.

Validazione della specificità, purezza e funzione/formazione barriera di celle RPE isolate Le cellule isolate sono state esaminate al microscopio ottico per verificarne la vitalità, la morfologia e la pigmentazione. Sono state catturate immagini da P0 e P1 (Figura 1A,B) e immagini da P0 e P4 (Figura 1C,D) per mostrare i cambiamenti nelle celle; forma, dimensione e pigmentazione man mano che i passaggi procedevano verso il qu...

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Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Questo manoscritto descrive un protocollo semplificato per l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi dei topi in modo graduale. Il protocollo include l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule RPE.

Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Questo protocollo delineerà un modo semplice ed efficiente per isolare con successo le cellule dell'epitelio pigmentato retinico primario del topo. Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico svolgono un ruolo molto importante per mantenere le cellule fotorecettrici e per garantire la normale funzione della retina. Il nostro laboratorio ha isolato le cellule primarie dell'epitelio pigmentato del topo come uno strumento importante per studiare la barriera emato-retinica esterna e le malattie correlate come la degenerazione maculare legata all'età.Per estrarre gli occhi del topo, eutanasia etica del topo secondo i metodi approvati dalla tua istituzione, quindi posiziona il topo su un sottoscocca sterile e nuclea l'occhio premendo una pinzetta stile 5/45 sull'area orbitale per indurre la proptosi, quindi sposta la pinzetta nella parte posteriore dell'occhio e tira delicatamente per rimuovere l'occhio assicurandoti che il nervo ottico sia ancora intatto. Durante l'utilizzo di una pinza, immergere gli occhi in un tubo di microcentrifuga da 2 millilitri contenente il 5% di iodio povidone. Incubare gli occhi a temperatura ambiente per 2 o 3 minuti.Rimuovere gli occhi dallo iodio povidone e metterli in una capsula di Petri. Durante l'utilizzo di una pipetta di trasferimento sterile, lavare gli occhi con la soluzione salina bilanciata di Hanks fino a quando il colore arancione dello iodio povidone è sparito. Questo richiede circa 2 o 3 lavaggi.Posizionare gli occhi in una nuova capsula di Petri e immergerli in mezzi di crescita cellulare RPE completi e freddi. Da lì, puoi iniziare a sezionare sotto un microscopio da dissezione. Al microscopio, utilizzare pinzette e / o forbici Vannas per tirare o tagliare via il tessuto connettivo nei muscoli extraoculari.Gli occhi possono quindi essere tenuti per un'ora in terreni di coltura cellulare RPE freddi. Tuttavia, è preferibile procedere direttamente al passaggio successivo dopo aver pulito il bulbo oculare. Trasferire gli occhi in un tubo di microcentrifuga da 2 millilitri contenente la soluzione di enzima A, quindi incubare gli occhi all'interno di un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 40 minuti.Rimuovere gli occhi dalla soluzione dell'enzima A e metterli in una nuova provetta da microcentrifuga da 2 millilitri contenente la soluzione di enzima B, quindi posizionarli all'interno di un incubatore e incubare a 37 gradi Celsius per 50 minuti. Rimuovere gli occhi dall'enzima B e metterli in una piastra di Petri da 60 millimetri e immergerli e completare i mezzi di crescita delle cellule RPE, quindi incubare gli occhi a 4 gradi Celsius per 30 minuti. Posizionare il piatto sotto il microscopio da dissezione e iniziare a sezionare.Utilizzare una pinza M5S e un ago di una siringa per fare un'incisione nella sezione ora seratta. Ora con due pinze, afferrare la parte interna dell'incisione con una pinza e afferrare la cornea con l'altra pinza. Inizia a strappare lentamente la cornea dalla retina tirando la cornea.Assicurati di strappare in piccoli incrementi e spostarti verso il basso mentre rimuovi la cornea. Ciò garantirà che l'RPE rimanga per lo più intatto e si otterrà uno strappo più pulito. Una volta che la cornea è completamente staccata, dovresti essere in grado di vedere l'iride e la lente.Rimuovere sia l'iride che la lente con una pinza per mantenere la purezza dell'isolamento. Per rimuovere la retina neurale dallo strato RPE, afferrare lo strato esterno del bulbo oculare con una pinzetta e posizionare un braccio di una seconda pinzetta tra entrambi gli strati RPE e neurali. Da lì, tirare delicatamente o raccogliere la retina neurale lontano dallo strato RPE, quindi scartare la retina neurale.Spostate il livello RPE in un punto diverso del piatto privo di detriti. Per separare l'RPE dalla coroide e dalla sclera, raschiare delicatamente l'interno della concia oculare con una pinzetta stile 5/45 per garantire la separazione delle cellule RPE. Le celle RPE appaiono torbide quando sospese e completano il mezzo di crescita delle cellule RPE.Aspirare le cellule utilizzando una pipetta di trasferimento sterile da 3,2 millilitri e trasferirle in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente un mezzo di crescita completo delle cellule RPE. Le celle possono essere centrifugate a 300g per 10 minuti a temperatura ambiente. È quindi possibile aspirare il surnatante e risospendere il pellet in mezzi di crescita cellulari RPE riscaldati.Placcare le cellule su una piastra di Petri da 100 millimetri e incubare a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Queste immagini mostrano un isolamento riuscito al passaggio 0 e al passaggio 1, che è evidente dalla pigmentazione delle cellule RPE. Al passaggio 4, le cellule diventano meno caratteristiche e mostrano meno pigmento, mostrano un aspetto simile a un fuso o diventano più robuste con una superficie più ampia.Abbiamo convalidato le cellule RPE con un marcatore specifico RPE, RPE65 e una proteina citoscheletrica F-actina. Abbiamo anche controllato la potenziale contaminazione con le cellule di Muller colorando con un marcatore specifico della cellula di Muller, la vimentina. Questo protocollo è un adattamento semplificato dei protocolli esistenti.Il protocollo utilizza materiali e attrezzature associate disponibili nella maggior parte dei laboratori di ricerca, che aiuteranno a isolare le cellule RPE primarie del topo in modo efficace.

Research

JoVE Journal

Biology

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