Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

この研究は、国立眼研究所(NEI)、国立眼研究所(NEI)基金R01 EY029751-04によってサポートされました。

動物は、オークランド大学IACUC動物プロトコル番号21063のガイドラインおよび眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントのガイドラインに従って使用されました。
1. 溶液調製
<ol><li>ダルベッコの改変イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)に25%ウシ胎児血清(FBS)、1.5%ペニシリン/ストレプトマイシン、および0.02%ゲンタマイシンを添加し?...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

現在のプロトコルは、マウスの目からRPEを分離するための報告、修正、および簡略化された詳細な手順です。このプロトコルには、マウスの目から分離されたRPE細胞の核摘出、解剖、収集、播種、培養、および特性評価が含まれます。
マウスの年齢、解剖された目の数、組織培養プレートまたは皿のサイズ、播種、保管、継代後の注意など、RPE分離を成功させるために?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

網膜色素上皮(RPE)細胞は、脈絡膜と神経網膜の間に位置し、視細胞(PR)細胞の背後にある直方体細胞の単純な単層を形成する1。RPEは、主に活性酸素種(ROS)の過剰な蓄積とその結果として生じる酸化的損傷を減らすことにより、PR細胞の健康な環境を維持する上で重要な役割を果たします1。RPE細胞は、レチノイドの変換と貯蔵、散乱光の吸収、流体とイオンの輸送、および脱落したPR外セグメント膜の食作用など、多くの機能を監督しています2,3。RPE(形態/機能)の変化は、網膜症につながる機能を損なう可能性があり、これは多くの眼疾患に共通する特徴です4。多くの眼疾患は、網膜色素変性症、レーバー先天性無気力症、白皮症などの遺伝性疾患を含むRPE細胞の形態と機能の変化に関連しています4,5,6、および糖尿病性網膜症(DR)や加齢黄斑変性症(AMD)などの加齢性眼疾患7,8。.ヒト細胞が最も望ましいため、RPE単層を形成するための初代ヒトRPE細胞におけるRPE障害を研究することが理想的です。しかしながら、倫理的問題およびこれらの障害のほとんどが罹患率9につながるが必ずしも死亡率10ではないという事実によるヒトドナーの限られた利用可能性は、それによって初代ヒトRPE細胞の単離を妨げる。これにより、ヒト以外の動物ドナーからのRPE細胞を培養することが好ましい代替手段になります。げっ歯類、特にマウスは、トランスジェニック技術がこれらの種でより広く確立されているため、さまざまな眼疾患を研究するための優れたモデルと見なされています11。初代RPE培養細胞を用いることには、多くの利点がありますが、増殖細胞を何回も継代維持したり、細胞を保存・再利用したりすることは困難でした。このプロトコルの主な制限はマウスの年齢です。RPE単離に使用されるマウスは、成体マウス11、12、13からRPE細胞を培養することが困難であったため、非常に若い年齢(18〜21日齢が最適)であるべきである。RPE細胞はどの年齢でもマウスの目から単離することができますが、最大4つの細胞継代は若いマウス(18〜21日齢)でのみ成功しました。C57BL6マウスとRPE細胞でN-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)を欠失したトランスジェニックマウスの両方を使用して、マウス網膜からのRPE単離を実施し、AMD14の発生と進行に対するアミノ酸ホモシステインの上昇の影響を研究しました。さらに、単離された初代RPE細胞は、RPE細胞14におけるNMDARの阻害によるAMDの治療標的の提案に役立った。食品医薬品局(FDA)によって承認され、現在、AMD14の潜在的な治療標的となる可能性のあるメマンチン16など、アルツハイマー病(AD)に関連する中等度から重度の混乱(認知症)の治療に使用されているNMDAR遮断薬がいくつかあります。さらに、単離された初代マウスRPE細胞を炎症マーカーの検出に使用し、高レベルのホモシステインを示す遺伝子改変マウス(CBS)を使用して、AMDおよびADのホモシステイン誘発機能の根底にあるメカニズムとして炎症の誘発を提案しました16,17。
このプロトコルは、他の公開された分離プロトコル13,18,19の単純化された適応として、私たちの研究室で開発された野生型C57BL/6マウスとトランスジェニックマウスの両方からRPE細胞を単離するために使用され、容易に適用可能で信頼性の高いプロトコルに到達しました。このプロトコルには性別の好みはありません。マウスの年齢は単離プロセスにとって重要ですが、RPE単離には、若齢の高齢マウス(18〜21日齢)および任意の年齢(12か月まで)の高齢マウスが使用されました。しかし、若齢マウスから分離されたRPE細胞は生存期間が長く、最大4回の継代を行うことができることに気づきました。年配のマウスから単離されたRPE細胞は、1回または2回継代することができ、その後、それらは正常な速度で成長を停止し、より細長い(線維芽細胞様細胞)形状に変化する。色素沈着の喪失および組織培養プレートへの接着性の低下とそれに続く剥離も観察された。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

網膜色素上皮(RPE)層は、光受容体のすぐ後ろにあり、光受容体の機能を維持する上でいくつかの重要な役割を果たす複雑な代謝システムを持っています。したがって、RPEの構造と機能は、正常な視力を維持するために不可欠です。この原稿は、初代マウスRPE細胞単離のための確立されたプロトコルを提示します。RPE単離は、眼疾患のさまざまなマウスモデルにおけるRPE病理の根底にある分子メカニズムを調査するための優れたツールです。さらに、RPE単離は、野生型マウスと遺伝子改変マウスから単離された初代マウスRPE細胞の比較や、視覚障害の治療法の開発を加速できる薬剤の試験に役立ちます。原稿は、段階的なRPE分離プロトコルを提示します。除核から播種までの全手順は約4時間かかります。培地は、単離された細胞を乱すことなく増殖させるために、播種後5〜7日間は交換しないでください。このプロセスに続いて、免疫蛍光 法による 細胞内の形態、色素沈着、および特異的マーカーの特性評価が行われます。細胞は最大3〜4回継代することができる。

単離されたRPE細胞の特異性、純度、バリア機能/形成の検証 単離した細胞を光学顕微鏡で検査し、生存率、形態、および色素沈着を検証しました。P0とP1からの画像(図1A、B)とP0とP4からの画像(図1C、D)をキャプチャして、細胞の変化を示しました。継代が4番目の継代に進むにつれての形状、サイズ、および色素沈着(黒い矢...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

この原稿では、網膜色素上皮(RPE)細胞をマウスの目から段階的に単離するための簡略化されたプロトコルについて説明しています。このプロトコルには、マウスの目の除核と解剖、それに続くRPE細胞の単離、播種、培養が含まれます。

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

このプロトコルでは、初代マウス網膜色素性上皮細胞を単離するための簡単で効率的な方法を概説します。網膜色素上皮細胞は、視細胞を維持し、網膜の正常な機能を確保するために非常に重要な役割を果たしています。当研究室では、初代マウス色素上皮細胞を、網膜外関門や加齢黄斑変性症などの関連疾患を研究するための重要なツールとして分離しています。マウスの目を抽出するには、施設の承認された方法に従ってマウスを倫理的に安楽死させ、マウスを滅菌アンダーパッドに置き、眼窩領域の5/45スタイルのピンセットを押して眼球を核形成してプロプトーシスを誘発し、ピンセットを目の後部に移動し、視神経がまだ無傷であることを確認するためにゆっくりと引っ張って目を取り除きます。鉗子を使用しながら、5%ポビドンヨウ素を含む2ミリリットルの微量遠心チューブに目を浸します。室温で2〜3分間目をインキュベートします。ポビドンヨードから目を取り除き、ペトリ皿に入れます。滅菌トランスファーピペットを使用しながら、ポビドンヨードのオレンジ色がなくなるまでハンクスのバランス生理食塩水で目を洗います。これには約2〜3回の洗浄が必要です。目を新しいペトリ皿に入れ、冷たい完全なRPE細胞増殖培地に浸します。そこから、解剖顕微鏡で解剖を開始できます。顕微鏡下で、ピンセットおよび/またはバンナスハサミを使用して、外眼筋の結合組織を引き抜くか切り取ります。その後、冷たいRPE細胞培養培地で1時間目を保持することができます。ただし、眼球を洗浄した後はそのまま次のステップに進むことが好ましい。酵素A溶液を入れた2ミリリットルの微量遠心チューブに目を移し、インキュベーター内で摂氏37度で40分間インキュベートします。酵素A溶液から目を取り除き、酵素B溶液を入れた新しい2ミリリットルの微量遠心チューブに入れ、インキュベーター内に置き、摂氏37度で50分間インキュベートします。酵素Bから目を取り除き、60ミリメートルのペトリ皿に入れて水没させ、RPE細胞増殖培地を完成させてから、摂氏4度で30分間インキュベートします。皿を解剖顕微鏡の下に置き、解剖を開始します。M5S鉗子と注射器の針を使用して、オラセラッタセクションを切開します。次に、2つの鉗子で、1つの鉗子で切開の内側部分をつかみ、もう一方の鉗子で角膜をつかみます。角膜を引っ張って網膜から角膜をゆっくりと引き裂き始めます。角膜を取り除くときは、必ず少しずつ裂き、裂け目を下に移動します。これにより、RPEはほとんど無傷のままになり、よりきれいな裂け目が得られます。角膜が完全に剥離すると、虹彩と水晶体が見えるはずです。アイソレーションの純度を維持するために、鉗子で虹彩とレンズの両方を取り外します。RPE層から神経網膜を除去するには、1つのピンセットでアイカップの外層をつかみ、RPE層と神経層の両方の間に2番目のピンセットのアームを配置します。そこから、神経網膜をRPE層からそっと引っ張るかすくい取り、神経網膜を捨てます。RPEレイヤーを破片のない皿の別の場所に移動します。脈絡膜と強膜からRPEを分離するには、5/45スタイルのピンセットでアイカップの内側をそっとこすり、RPE細胞を確実に分離します。RPE細胞は、懸濁すると白濁して見え、RPE細胞増殖培地を完成させます。3.2ミリリットルの滅菌トランスファーピペットを使用して細胞を吸引し、完全なRPE細胞増殖培地を含む新しい15ミリリットルの遠沈管に移します。細胞は、室温で300gで10分間遠心分離することができる。その後、上清を吸引し、加温したRPE細胞増殖培地にペレットを再懸濁します。細胞を100ミリメートルのペトリ皿にプレートし、摂氏37度と5%CO2でインキュベートします。これらの画像は、継代0および継代1での単離の成功を示しており、これはRPE細胞の色素沈着によって明らかである。継代4では、細胞は特性が低下し、色素が少なくなり、紡錘状の外観を示すか、またはより大きな表面積でより堅牢になります。RPE特異的マーカーであるRPE65と細胞骨格タンパク質F-アクチンを用いてRPE細胞を検証しました。また、ミュラー細胞特異的マーカーであるビメンチンで染色することにより、ミュラー細胞による潜在的な汚染をチェックしました。このプロトコルは、既存のプロトコルを単純化したものです。このプロトコルは、ほとんどの研究室で利用可能な材料と関連機器を使用しており、初代マウスRPE細胞を効果的に分離するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

マウスの眼から網膜幹細胞の単離

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

マウスの主栄養膜細胞と絨毛浸潤アッセイの分離

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

原発腫瘍から免疫細胞の分離

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...