Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
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이 작업은 국립 안과 연구소 (NEI), 국립 안과 연구소 (NEI) 기금 R01 EY029751-04의 지원을 받았습니다.

동물은 오클랜드 대학 IACUC 동물 프로토콜 번호 21063의 지침 및 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서의 지침에 따라 사용되었습니다.
1. 용액 준비
<ol><li>Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 / 영양소 혼합물 F-12 (DMEM / F12)에 25 % 태아 소 혈청 (FBS), 1.5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 0.02 % 겐타 마이신을 보충하여 완전한 RPE 세포 배양 배지를 준비하십시오....

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

현재 프로토콜은 마우스 눈에서 RPE 분리를 위해 보고, 수정 및 단순화된 세부 절차입니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈에서 분리된 RPE 세포의 핵 제거, 해부, 수집, 파종, 배양 및 특성 분석이 포함됩니다.
성공적인 RPE 분리를 위해 충족해야 하는 몇 가지 제한 사항과 중요한 단계(예: 마우스 나이, 해부된 눈의 수, 조직 배양 접시 또는 접시의 크기, 파종, 보관 및 계대 배양 후 주...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

망막 색소 상피 (RPE) 세포는 맥락막과 신경 망막 사이에 위치하여 광 수용체 (PR) 세포1 뒤에있는 직육면체 세포의 단순한 단층을 형성합니다. RPE는 주로 활성 산소 종(ROS)의 과도한 축적과 그에 따른 산화적 손상을 줄임으로써 PR 세포의 건강한 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다1. RPE 세포는 레티노이드의 전환 및 저장, 산란광의 흡수, 유체 및 이온 수송, 흘린 PR 외부 분절 막 2,3의 식균 작용과 같은 많은 기능을 감독합니다. RPE (형태 / 기능)의 변화는 망막 병증으로 이어지는 기능을 손상시킬 수 있으며 이는 많은 안구 질환에서 공유하는 공통적 인 특징입니다4. 많은 안구 질환은 색소성 망막염, Leber 선천성 무균증 및 백색증 4,5,6과 같은 일부 유전 질환뿐만 아니라 당뇨병성 망막병증(DR) 및 연령 관련 황반변성(AMD)과 같은 연령 관련 안구 질환을 포함하여 RPE 세포의 형태 및 기능의 변화와 관련이 있습니다.7,8 . 인간 세포가 가장 바람직하므로, RPE 단분자층을 형성하기 위한 1차 인간 RPE 세포에서 RPE 장애를 연구하는 것이 이상적일 것이다. 그러나, 윤리적 문제 및 이들 장애의 대부분이 이환율9을 유도하지만, 반드시 사망률10을 초래한다는 사실로 인한 인간 공여자의 제한된 이용가능성은 일차 인간 RPE 세포의 단리를 방지시킨다. 따라서 비인간 동물 기증자로부터 RPE 세포를 배양하는 것이 선호되는 대안입니다. 설치류, 특히 마우스는 트랜스 제닉 기술이이 종에서 더 광범위하게 확립되기 때문에 다양한 안구 질환을 연구하기위한 훌륭한 모델로 간주됩니다11. 배양된 1차 RPE 세포의 사용은 많은 이점을 제공하지만, 많은 계대 동안 성장하는 세포를 유지하거나 세포를 저장 및 재사용하는 것이 어려웠습니다. 이 프로토콜의 주요 한계는 생쥐의 나이입니다. RPE 분리에 사용되는 마우스는 성체 마우스 11,12,13에서 RPE 세포를 배양하는 것이 어려웠기 때문에 매우 어린 연령(18-21일이 최적임)이어야 합니다. RPE 세포는 모든 연령의 마우스 눈에서 분리 할 수 있지만 최대 4 개의 세포 계대는 어린 마우스 (18-21 일령)에서만 성공적이었습니다. RPE 세포에서 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDAR)가 결실된 C57BL6 마우스와 트랜스제닉 마우스 모두를 사용하여 마우스 망막에서 RPE 분리를 수행하여 상승된 아미노산 호모시스테인이 AMD14의 발달 및 진행에 미치는 영향을 연구했습니다. 또한, 단리된 1차 RPE 세포는 RPE 세포14에서 NMDARs의 억제에 의해 AMD에 대한 치료 표적을 제안하는 것을 도왔다. 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았으며 현재 AMD14의 잠재적 치료 표적이 될 수 있는 메만틴16과 같은 알츠하이머병(AD)과 관련된 중등도에서 중증의 혼란(치매) 치료에 사용되는 일부 NMDAR 차단제가 있습니다. 또한, 분리된 1차 마우스 RPE 세포는 염증 마커의 검출 및 높은 수준의 호모시스테인을 나타내는 유전자 변형 마우스(CBS)를 사용하여 AMD 및 AD의 호모시스테인 유도 기능에 대한 기본 메커니즘으로서 염증의 유도를 제안하는 데 사용되었습니다16,17.
이 프로토콜은 쉽게 적용 가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜에 도달하기 위해 공개된 다른 분리 프로토콜13,18,19의 단순화된 적응으로 우리 실험실에서 개발된 야생형 C57BL/6 마우스와 형질전환 마우스 모두에서 RPE 세포를 분리하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜에는 성별 선호도가 없습니다. 생쥐 연령이 분리 과정에 중요하지만, 어린 늙은 쥐(18-21일령)와 모든 연령(최대 12개월)의 나이든 쥐를 RPE 분리에 사용했습니다. 그러나 우리는 어린 생쥐에서 분리 된 RPE 세포가 더 오래 살았으며 최대 4 개의 계대를 수행 할 수 있음을 발견했습니다. 오래된 마우스에서 분리 된 RPE 세포는 한두 번 계대 할 수 있으며, 정상적인 속도로 성장을 멈추고 모양이 더 길쭉한 (섬유 아세포 유사 세포) 바뀝니다. 색소 침착의 손실 및 조직 배양 용기에 대한 접착력 감소에 이어 박리가 또한 관찰되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

망막 색소 상피 (RPE) 층은 광 수용체 바로 뒤에 있으며 광 수용체의 기능을 유지하는 데 몇 가지 중요한 역할을하는 복잡한 대사 시스템을 보유하고 있습니다. 따라서 RPE 구조와 기능은 정상적인 시력을 유지하는 데 필수적입니다. 이 원고는 1차 마우스 RPE 세포 분리를 위한 확립된 프로토콜을 제시합니다. RPE 분리는 안구 질환의 다양한 마우스 모델에서 RPE 병리의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하는 훌륭한 도구입니다. 또한 RPE 분리는 야생형 및 유전자 변형 마우스에서 분리된 1차 마우스 RPE 세포를 비교하고 시각 장애 치료제 개발을 가속화할 수 있는 약물을 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다. 원고는 단계별 RPE 격리 프로토콜을 제시합니다. 핵 제거에서 파종까지 전체 절차는 약 4 시간이 걸립니다. 분리 된 세포의 성장을 방해받지 않고 허용 할 수 있도록 파종 후 5-7 일 동안 배지를 변경해서는 안됩니다. 이 과정은 면역형광을 통해 세포의 형태학, 색소 침착 및 특정 마커의 특성화로 이어집니다. 세포는 최대 3 또는 4회 계대배양될 수 있다.

분리된 RPE 세포의 특이성, 순도 및 장벽 기능/형성에 대한 검증 분리된 세포를 광학 현미경으로 검사하여 생존력, 형태 및 색소 침착을 확인했습니다. P0 및 P1의 이미지 (그림 1A, B)와 P0 및 P4의 이미지 (그림 1C, D)를 캡처하여 셀의 변화를 보여줍니다. 계대가 제4 계대까지 진행됨에 따라 형태, 크기, 및 색소침착(검은색 화살표?...

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Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

이 프로토콜은 일차 마우스 망막 색소 상피 세포를 성공적으로 분리하는 쉽고 효율적인 방법을 설명합니다. 망막 색소 상피 세포는 광 수용체 세포를 유지하고 망막의 정상적인 기능을 보장하는 데 매우 중요한 역할을합니다. 우리 연구실은 외부 혈액 망막 장벽 및 연령 관련 황반 변성과 같은 관련 질병을 연구하는 중요한 도구로 일차 마우스 색소 상피 세포를 분리해 왔습니다.쥐의 눈을 추출하려면 기관에서 승인한 방법에 따라 윤리적으로 쥐를 안락사시킨 다음 마우스를 멸균 언더패드에 놓고 안와 부위의 5/45 스타일 핀셋을 눌러 안구균을 핵으로 만들어 proptosis를 유도한 다음 핀셋을 눈 뒤쪽으로 옮기고 부드럽게 당겨 눈을 제거하여 시신경이 손상되지 않도록 합니다. 집게를 사용하는 동안 5 % 포비돈 요오드가 들어있는 2 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 눈을 담그십시오. 실온에서 2-3 분 동안 눈을 배양하십시오.포비돈 요오드에서 눈을 제거하고 페트리 접시에 넣으십시오. 멸균 이송 피펫을 사용하는 동안 포비돈 요오드의 주황색이 사라질 때까지 행크스의 균형 잡힌 식염수로 눈을 씻으십시오. 이것은 약 2-3 번의 세척이 필요합니다.눈을 새로운 페트리 접시에 넣고 차가운 완전한 RPE 세포 성장 배지에 담그십시오. 거기에서 해부 현미경으로 해부를 시작할 수 있습니다. 현미경으로 핀셋 및/또는 Vannas 가위를 사용하여 외안근의 결합 조직을 당기거나 잘라냅니다.그런 다음 차가운 RPE 세포 배양 배지에서 한 시간 동안 눈을 유지할 수 있습니다. 그러나 안구를 청소 한 후 다음 단계로 바로 진행하는 것이 좋습니다. 눈을 효소 A 용액이 들어있는 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮긴 다음 섭씨 37 도의 인큐베이터 내부에서 40 분 동안 눈을 배양합니다.효소 A 용액에서 눈을 제거하고 효소 B 용액이 들어있는 새로운 2 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 넣은 다음 인큐베이터 안에 넣고 섭씨 37도에서 50 분 동안 배양합니다. 효소 B에서 눈을 제거하고 60mm 페트리 접시에 넣고 담그고 RPE 세포 성장 배지를 완성한 다음 섭씨 4도에서 30분 동안 눈을 배양합니다. 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 해부를 시작하십시오.M5S 집게와 주사기 바늘을 사용하여 오라 세라타 섹션을 절개하십시오. 이제 두 개의 집게로 한 집게로 절개 부위의 안쪽 부분을 잡고 다른 집게로 각막을 잡습니다. 각막을 당겨 망막에서 각막을 천천히 찢기 시작하십시오.각막을 제거 할 때 조금씩 찢어지고 눈물을 아래로 이동하십시오. 이렇게 하면 RPE가 거의 손상되지 않고 더 깨끗한 찢어짐을 얻을 수 있습니다. 각막이 완전히 분리되면 홍채와 수정체를 볼 수 있습니다.조리개와 렌즈를 겸자로 제거하여 분리의 순도를 유지하십시오. RPE 층에서 신경 망막을 제거하려면 하나의 핀셋으로 아이컵의 바깥층을 잡고 RPE와 신경층 사이에 두 번째 핀셋의 암을 배치합니다. 거기에서 RPE 층에서 신경 망막을 부드럽게 당기거나 퍼낸 다음 신경 망막을 버립니다.RPE 레이어를 이물질이 없는 접시의 다른 위치로 이동합니다. 맥락막 및 공막에서 RPE를 분리하려면 5/45 스타일 핀셋으로 아이컵 내부를 부드럽게 긁어 RPE 세포를 분리합니다. RPE 세포는 현탁되고 완전한 RPE 세포 성장 배지일 때 흐릿하게 나타납니다.3.2밀리리터 멸균 이송 피펫을 사용하여 세포를 흡입하고 완전한 RPE 세포 성장 배지가 들어 있는 새로운 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포는 실온에서 10분 동안 300g에서 원심분리될 수 있다. 그런 다음 상청액을 흡인하고 예열된 RPE 세포 성장 배지에 펠릿을 재현탁할 수 있습니다.세포를 100mm 페트리 접시에 담고 섭씨 37도 및 5%CO2에서 배양합니다. 이들 이미지는 계대 0 및 계대 1에서의 성공적인 분리를 보여주며, 이는 RPE 세포의 색소침착에 의해 명백하다. 계대 4에서 세포는 덜 특징적이되고 안료가 적거나 스핀들과 같은 모양을 나타내거나 더 큰 표면적으로 더 견고 해집니다.우리는 RPE 특이적 마커인 RPE65와 세포골격 단백질 F-액틴으로 RPE 세포를 검증했습니다. 또한 뮬러 세포 특이적 마커인 비멘틴(vimentin)으로 염색하여 뮬러 세포의 오염 가능성을 확인했습니다. 이 프로토콜은 기존 프로토콜을 단순화 한 것입니다.이 프로토콜은 대부분의 연구실에서 사용할 수 있는 재료 및 관련 장비를 사용하므로 일차 마우스 RPE 세포를 효과적인 방식으로 분리하는 데 도움이 됩니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

연구

생물학

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...