Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fond R01 EY029751-04

Dyr ble brukt i henhold til retningslinjene fra Oakland University IACUC dyreprotokoll nummer 21063 og retningslinjene i ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning.
1. Klargjøring av oppløsning
<ol><li>Forbered det komplette RPE-cellekulturmediet ved å supplere Dulbeccos modifiserte Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) med 25% Fetal Bovine Serum (FBS), 1,5% penicillin / streptomycin og 0,02% gentamicin.</li>
	<li>Forbered enzym A ved å...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

Den nåværende protokollen er en rapportert, modifisert og forenklet detaljert prosedyre for RPE-isolasjon fra museøyne. Protokollen inkluderer enukleasjon, disseksjon, innsamling, såing, kultur og karakterisering av RPE-celler isolert fra museøyne.
Det er noen begrensninger og kritiske trinn som må oppfylles for vellykket RPE-isolasjon, for eksempel musealder, antall øyne dissekert, størrelsen på vevskulturplaten eller parabolen, og forsiktighetsregler etter såing, lagring og passeri...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Retinal pigmentert epitel (RPE) celler ligger mellom choroid og nevrale retina, og danner et enkelt monolag av kuboidale celler som ligger bak fotoreceptor (PR) celler1. RPE spiller en kritisk rolle i å opprettholde et sunt miljø for PR-celler, hovedsakelig ved å redusere overdreven akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) og påfølgende oksidativ skade1. RPE-celler overvåker mange funksjoner, for eksempel konvertering og lagring av retinoider, absorpsjon av spredt lys-, væske- og ionetransport og fagocytose av skur PR ytre segmentmembran 2,3. Endringer i RPE (morfologi / funksjon) kan svekke deres funksjon som fører til retinopati, og dette er et vanlig trekk som deles av mange okulære lidelser4. Mange okulære sykdommer er forbundet med endringer i morfologien og funksjonen til RPE-celler, inkludert noen genetiske sykdommer som retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurose og albinisme 4,5,6, samt aldersrelaterte okulære lidelser som diabetisk retinopati (DR) og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)7,8 . Menneskelige celler er de mest ønskelige, og det ville derfor være ideelt å studere RPE-lidelser i primære menneskelige RPE-celler for å danne RPE-monolag. Etiske forhold og den begrensede tilgjengeligheten av menneskelige givere skyldes imidlertid at de fleste av disse lidelsene fører til sykelighet9, men ikke nødvendigvis dødelighet10, og forhindrer dermed isolering av primære humane RPE-celler. Dette gjør dyrking av RPE-celler fra ikke-menneskelige dyredonorer til et foretrukket alternativ. Gnagere, spesielt mus, regnes som en flott modell for å studere forskjellige okulære sykdommer siden transgen teknologi er mer omfattende etablert i disse artene11. Selv om bruken av dyrkede primære RPE-celler gir mange fordeler, har det vært vanskelig å opprettholde voksende celler i mange passasjer, eller å lagre og gjenbruke cellene. Hovedbegrensningen i denne protokollen er musens alder; mus som brukes til RPE-isolasjon bør være i svært ung alder (18-21 dager gammel er optimal) da det har vært vanskelig å dyrke RPE-celler fra voksne mus11,12,13. RPE-celler kan isoleres fra museøyne i alle aldre, men opptil fire cellepassasjer var bare vellykket med unge mus (18-21 dager gamle). RPE-isolasjon fra musehinner, ved bruk av både C57BL6-mus og transgene mus med delesjon av N-metyl-D-aspartatreseptorene (NMDARer) ved RPE-cellene, ble utført for å studere effekten av forhøyet aminosyrehomocystein på utvikling og progresjon av AMD14. I tillegg bidro isolerte primære RPE-celler til å foreslå et terapeutisk mål for AMD ved inhibering av NMDARene ved RPE-celler14. Det er noen NMDAR-blokkere som er godkjent av Food and Drug Administration (FDA) og brukes for tiden til å behandle moderat til alvorlig forvirring (demens) relatert til Alzheimers sykdom (AD), for eksempel memantin16, som kan være et potensielt terapeutisk mål for AMD14. Videre ble isolerte primære muse-RPE-celler brukt til påvisning av inflammatoriske markører og den foreslåtte induksjonen av betennelse som en underliggende mekanisme for homocysteininduserte egenskaper av AMD og AD ved hjelp av en genetisk modifisert mus (CBS), som presenterer et høyt nivå av homocystein16,17.
Denne protokollen ble brukt til å isolere RPE-celler fra både villtype C57BL / 6-mus og transgene mus utviklet i vårt laboratorium som en forenklet tilpasning av andre publiserte isolasjonsprotokoller13,18,19 for å nå en lett anvendelig og pålitelig protokoll. Det er ingen kjønnspreferanse i denne protokollen. Mens musealder er kritiske for isolasjonsprosessen, ble unge, eldre mus (18-21 dager gamle) og eldre mus i alle aldre (opptil 12 måneder) brukt til RPE-isolasjon. Vi la imidlertid merke til at RPE-cellene isolert fra de unge musene levde lenger, og opptil fire passasjer kunne utføres. RPE-cellene isolert fra eldre mus kunne passeres en eller to ganger, da ville de slutte å vokse med normal hastighet og endre form for å bli lengre (fibroblastlignende celler). Tap av pigmentering og redusert vedheft til vevskulturplaten etterfulgt av løsrivelse ble også observert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

Det retinale pigmenterte epitellaget (RPE) ligger rett bak fotoreceptorene og har et komplekst metabolsk system som spiller flere kritiske roller for å opprettholde fotoreceptorenes funksjon. Dermed er RPE-strukturen og funksjonen avgjørende for å opprettholde normal syn. Dette manuskriptet presenterer en etablert protokoll for primær mus RPE-celleisolasjon. RPE-isolasjon er et flott verktøy for å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn for RPE-patologi i de forskjellige musemodellene av okulære lidelser. Videre kan RPE-isolasjon bidra til å sammenligne primære muse-RPE-celler isolert fra villtype og genetisk modifiserte mus, samt teste stoffer som kan akselerere utviklingen av terapi for synsforstyrrelser. Manuskriptet presenterer en trinnvis RPE-isolasjonsprotokoll; Hele prosedyren, fra enukleasjon til såing, tar omtrent 4 timer. Mediene bør ikke endres i 5-7 dager etter såing, for å tillate vekst av de isolerte cellene uten forstyrrelser. Denne prosessen etterfølges av karakterisering av morfologi, pigmentering og spesifikke markører i cellene via immunfluorescens. Celler kan passeres maksimalt tre eller fire ganger.

Validering av spesifisitet, renhet og barrierefunksjon/dannelse av isolerte RPE-celler De isolerte cellene ble undersøkt under et lysmikroskop for å verifisere deres levedyktighet, morfologi og pigmentering. Bilder fra P0 og P1 (figur 1A, B) og bilder fra P0 og P4 ble tatt (figur 1C, D) for å vise endringene i cellene; form, størrelse og pigmentering da passasjene gikk videre til fjerde passasje (svarte piler peker på de ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Dette manuskriptet beskriver en forenklet protokoll for isolering av retinale pigmenterte epitelceller (RPE) fra museøyne på en trinnvis måte. Protokollen inkluderer enukleasjon og disseksjon av museøyne, etterfulgt av isolering, såing og dyrking av RPE-celler.

Isolering av primære retinale retinale pigmenterte epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Denne protokollen vil skissere en enkel og effektiv måte å lykkes med å isolere primære mus retinale pigmenterte epitelceller. Retinale pigmenterte epitelceller spiller en svært viktig rolle for å opprettholde fotoreceptorcellene og for å sikre normal funksjon av netthinnen. Vårt laboratorium har isolert primære musepigmenterte epitelceller som et viktig verktøy for å studere den ytre blod-retinale barrieren og relaterte sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon.For å trekke ut museøynene må du avlive musen etisk i henhold til institusjonens godkjente metoder, deretter plassere musen på en steril underpad og nukleere øyet ved å trykke en pinsett i 5/45-stil på baneområdet for å indusere proptose, flytt deretter pinsetten til øyets bakre del og trekk forsiktig for å fjerne øyet slik at synsnerven fortsatt er intakt. Mens du bruker tang, senk øynene i et 2 milliliter mikrosentrifugerør som inneholder 5% povidonjod. Inkuber øynene ved romtemperatur i 2 til 3 minutter.Fjern øynene fra povidonjodet og legg dem i en petriskål. Mens du bruker en steril overføringspipette, vask øynene med Hanks'Balanced Saline Solution til den oransje fargen på povidonjodet er borte. Dette tar omtrent 2 til 3 vasker.Plasser øynene i en ny petriskål og senk dem i kalde, komplette RPE-cellevekstmedier. Derfra kan du begynne å dissekere under et dissekeringsmikroskop. Under mikroskopet, bruk pinsett og / eller Vannas saks for å trekke eller kutte bort bindevev i ekstraokulære muskler.Øynene kan deretter holdes i en time i kalde RPE-cellekulturmedier. Det er imidlertid foretrukket å fortsette direkte til neste trinn etter rengjøring av øyebollet. Overfør øynene til et 2 milliliter mikrosentrifugerør som inneholder enzymet A-løsningen, og inkuber øynene inne i en inkubator ved 37 grader Celsius i 40 minutter.Fjern øynene fra enzym A-løsningen og legg dem i et nytt 2-milliliter mikrosentrifugerør som inneholder enzymet B-løsningen, plasser dem deretter inne i en inkubator og inkuber ved 37 grader Celsius i 50 minutter. Fjern øynene fra enzym B og legg dem i en 60 millimeter petriskål og senk dem og fullfør RPE-cellevekstmedier, og inkuber øynene ved 4 grader Celsius i 30 minutter. Plasser parabolen under dissekeringsmikroskopet og begynn å dissekere.Bruk M5S tang og en nål av en sprøyte for å lage et snitt i ora seratta delen. Nå med to tang, ta tak i den indre delen av snittet med en tang og ta tak i hornhinnen med den andre tangen. Begynn å sakte rive hornhinnen fra netthinnen ved å trekke hornhinnen.Pass på å rive i små trinn og flytt ned tåren når du fjerner hornhinnen. Dette vil sikre at RPE forblir stort sett intakt, og du vil få en renere tåre. Når hornhinnen er helt løsrevet, bør du kunne se iris og linse.Fjern både iris og linse med tang for å opprettholde renheten av isolasjonen. For å fjerne nevrale netthinnen fra RPE-laget, ta tak i det ytre laget av øyekoppen med en pinsett og plasser en arm av en annen pinsett mellom både RPE og nevrale lag. Derfra trekker eller øser du forsiktig den nevrale netthinnen bort fra RPE-laget, og kaster deretter den nevrale netthinnen.Flytt RPE-laget til et annet sted på tallerkenen uten rusk. For å skille RPE fra choroid og sclera, skrap forsiktig innsiden av øyekoppen med en 5/45-stil pinsett for å sikre separasjon av RPE-cellene. RPE-cellene virker uklare når de er deaktivert og fullfører RPE-cellevekstmedier.Aspirer cellene ved hjelp av en 3,2 milliliter steril overføringspipette og overfør til et nytt 15 milliliter sentrifugerør som inneholder komplette RPE-cellevekstmedier. Cellene kan sentrifugeres ved 300g i 10 minutter ved romtemperatur. Du kan deretter aspirere ut supernatanten og resuspendere pelleten i oppvarmede RPE-cellevekstmedier.Plate cellene på en 100 millimeter petriskål og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Disse bildene viser en vellykket isolasjon ved passasje 0 og passasje 1, noe som fremgår av pigmenteringen av RPE-cellene. Ved passering 4 blir cellene mindre karakteristiske og viser mindre pigment, viser et spindellignende utseende eller blir mer robuste med større overflateareal.Vi validerte RPE-cellene med en RPE-spesifikk markør, RPE65 og et cytoskjelettprotein F-aktin. Vi sjekket også for potensiell forurensning med Muller-celler ved å fargelegge med en Muller-cellespesifikk markør, vimentin. Denne protokollen er en forenklet tilpasning av eksisterende protokoller.Protokollen bruker materialer og tilhørende utstyr som er tilgjengelig i de fleste forskningslaboratorier, noe som vil bidra til å isolere primære mus RPE-celler på en effektiv måte.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA uttrykk profiler av menneskelige iPS celler, retinal pigment epitelet avledet fra iPS, og Fetal Netthinne Pigment Epitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primært cellekulturer fra musen netthinnens Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effektiv disseksjon og kultur av primære mus retinal pigment epitelceller

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolasjon og karakterisering av musens primære lever sinusformede endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primær kultur av svin retinal pigment epitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...