Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана Фондом Национального института глаз (NEI), Национального института глаз (NEI) R01 EY029751-04

Животные использовались в соответствии с руководящими принципами оклендского университета IACUC для животных No 21063 и руководящими принципами Заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.
1. Приготовление раствора
<ol><li>...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

Текущий протокол представляет собой отчетную, модифицированную и упрощенную подробную процедуру изоляции RPE от глаз мыши. Протокол включает энуклеацию, рассечение, сбор, посев, культивирование и характеристику клеток RPE, выделенных из глаз мыши.
Существуют некоторые огр...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Клетки пигментированного эпителия сетчатки (RPE) расположены между сосудистой оболочкой и нервной сетчаткой, образуя простой монослой кубоидальных клеток, который лежит за фоторецепторными (PR) клетками1. RPE играет решающую роль в поддержании здоровой окружающей среды для PR-клеток, главным образом путем уменьшения чрезмерного накопления активных форм кислорода (АФК) и последующего окислительного повреждения1. Клетки RPE контролируют многие функции, такие как преобразование и хранение ретиноидов, поглощение рассеянного света, транспорт жидкости и ионов и фагоцитоз сброшенной PR наружной сегментной мембраны 2,3. Изменения в RPE (морфология / функция) могут ухудшить их функцию, ведущую к ретинопатии, и это общая черта, общая для многих глазных расстройств4. Многие глазные заболевания связаны с изменениями в морфологии и функции клеток RPE, включая некоторые генетические заболевания, такие как пигментный ретинит, врожденный амавроз Лебера и альбинизм 4,5,6, а также возрастные глазные расстройства, такие как диабетическая ретинопатия (DR) и возрастная макулярная дегенерация (AMD)7,8 . Клетки человека являются наиболее желательными, поэтому было бы идеально изучать нарушения RPE в первичных клетках RPE человека для формирования монослоев RPE. Однако этические вопросы и ограниченная доступность человеческих доноров обусловлены тем, что большинство из этих расстройств приводят к заболеваемости9, но не обязательно к смертности10, тем самым предотвращая выделение первичных клеток РПЭ человека. Это делает культивирование клеток RPE от нечеловеческих доноров животных предпочтительной альтернативой. Грызуны, особенно мыши, считаются отличной моделью для изучения различных глазных заболеваний, поскольку трансгенная технология более широко распространена у этих видов11. Несмотря на то, что использование культивируемых первичных клеток RPE предлагает много преимуществ, было трудно поддерживать растущие клетки в течение многих проходов или хранить и повторно использовать клетки. Основным ограничением этого протокола является возраст мышей; мыши, которые используются для изоляции RPE, должны быть очень молодого возраста (оптимально 18-21 день), так как было трудно культивировать клетки RPE у взрослых мышей 11,12,13. Клетки RPE могут быть выделены из глаз мыши в любом возрасте, однако до четырех клеточных проходов были успешными только у молодых мышей (18-21 день). Изоляция RPE от сетчатки мышей с использованием как мышей C57BL6, так и трансгенных мышей с делецией рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDAR) в клетках RPE была выполнена для изучения влияния повышенного уровня аминокислотного гомоцистеина на развитие и прогрессирование AMD14. Кроме того, изолированные первичные клетки RPE помогли предложить терапевтическую мишень для ВМД путем ингибирования NMDAR в клетках RPE14. Существуют некоторые блокаторы NMDAR, которые одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и в настоящее время используются для лечения умеренной и тяжелой путаницы (деменции), связанной с болезнью Альцгеймера (БА), таких как мемантин16, который может быть потенциальной терапевтической мишенью для ВМД14. Кроме того, изолированные первичные мышиные клетки RPE были использованы для обнаружения воспалительных маркеров и предполагаемой индукции воспаления в качестве основного механизма гомоцистеин-индуцированных признаков ВМД и AD с использованием генетически модифицированной мыши (CBS), которая представляет высокий уровень гомоцистеина16,17.
Этот протокол был использован для изоляции клеток RPE как от мышей дикого типа C57BL/6, так и от трансгенных мышей, разработанных в нашей лаборатории в качестве упрощенной адаптации других опубликованных протоколов изоляции 13,18,19 для достижения легко применимого и надежного протокола. В этом протоколе нет предпочтения пола. В то время как возраст мышей имеет решающее значение для процесса изоляции, молодые, пожилые мыши (18-21 день) и пожилые мыши в любом возрасте (до 12 месяцев) использовались для изоляции RPE. Тем не менее, мы заметили, что клетки RPE, выделенные у молодых мышей, жили дольше, и можно было выполнить до четырех проходов. Клетки RPE, выделенные у старых мышей, могут быть пройдены один или два раза, затем они перестанут расти с нормальной скоростью и изменят свою форму, чтобы быть более вытянутыми (фибробластоподобные клетки). Также наблюдалась потеря пигментации и снижение адгезии к тканевой культуральной пластине с последующим отслоением.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

Слой пигментированного эпителия сетчатки (RPE) находится непосредственно за фоторецепторами и содержит сложную метаболическую систему, которая играет несколько критических ролей в поддержании функции фоторецепторов. Таким образом, структура и функция RPE необходимы для поддержания нормального зрения. В этой рукописи представлен установленный протокол для первичной изоляции клеток RPE мыши. Изоляция RPE является отличным инструментом для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе патологии RPE в различных мышиных моделях глазных расстройств. Кроме того, изоляция RPE может помочь в сравнении первичных клеток RPE мышей, выделенных у диких и генетически модифицированных мышей, а также в тестировании лекарств, которые могут ускорить разработку терапии зрительных расстройств. В рукописи представлен пошаговый протокол изоляции RPE; вся процедура, от энуклеации до посева, занимает примерно 4 часа. Среда не должна быть изменена в течение 5-7 дней после посева, чтобы обеспечить рост изолированных клеток без нарушения. За этим процессом следует характеристика морфологии, пигментации и специфических маркеров в клетках посредством иммунофлуоресценции. Клетки могут быть пройдены максимум три или четыре раза.

Валидация специфичности, чистоты и барьерной функции/формирования изолированных клеток RPE Изолированные клетки исследовали под световым микроскопом, чтобы проверить их жизнеспособность, морфологию и пигментацию. Были получены изображения из P0 и P1 (рисуно?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Эта рукопись описывает упрощенный протокол для выделения клеток пигментированного эпителия сетчатки (RPE) из глаз мыши ступенчатым образом. Протокол включает в себя энуклеацию и рассечение глаз мыши с последующим выделением, посевом и культивированием клеток RPE.

Выделение первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

В этом протоколе будет описан простой и эффективный способ успешного выделения первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши. Пигментированные клетки эпителия сетчатки играют очень важную роль в поддержании фоторецепторных клеток и обеспечении нормальной функции сетчатки. Наша лаборатория выделяет первичные пигментированные клетки эпителия мыши в качестве важного инструмента для изучения внешнего гемато-ретинального барьера и связанных с ним заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация.Чтобы извлечь глаза мыши, этически усыпьте мышь в соответствии с утвержденными вашим учреждением методами, затем поместите мышь на стерильную нижнюю панель и зародышайте глаз, нажав пинцет в стиле 5/45 на орбитальную область, чтобы вызвать проптоз, затем переместите пинцет к задней части глаза и осторожно потяните, чтобы удалить глаз, гарантируя, что зрительный нерв все еще неповрежден. При использовании щипцов погружайте глаза в 2-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую 5% повидон-йода. Инкубировать глаза при комнатной температуре в течение 2 - 3 минут.Извлеките глаза из повидонового йода и поместите их в чашку Петри. При использовании стерильной переносной пипетки промывайте глаза сбалансированным физиологическим раствором Хэнкса до тех пор, пока оранжевый цвет повидонового йода не исчезнет. Это занимает примерно от 2 до 3 стирок.Поместите глаза в новую чашку Петри и погрузите их в холодную полную среду роста клеток RPE. Оттуда вы можете начать рассечение под рассекающим микроскопом. Под микроскопом используйте пинцет и / или ножницы Vannas, чтобы вытянуть или отрезать соединительную ткань в экстраокулярных мышцах.Затем глаза можно удерживать в течение часа в холодной среде культивирования клеток RPE. Однако предпочтительнее переходить непосредственно к следующему этапу после очистки глазного яблока. Переложите глаза в 2-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую раствор фермента А, затем высиживают глаза внутри инкубатора при 37 градусах Цельсия в течение 40 минут.Извлеките глаза из раствора фермента А и поместите их в новую 2-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую раствор фермента В, затем поместите их внутрь инкубатора и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 50 минут. Извлеките глаза из фермента В и поместите их в 60-миллиметровую чашку Петри и погрузите их и завершите RPE клеточную среду роста, затем инкубируйте глаза при 4 градусах Цельсия в течение 30 минут. Поместите блюдо под рассекающий микроскоп и начните рассечение.Используйте щипцы M5S и иглу шприца, чтобы сделать разрез в секции ora seratta. Теперь двумя щипцами захватите внутреннюю часть разреза одним щипцом и схватите роговицу другим щипцом. Начните медленно отрывать роговицу от сетчатки, вытягивая роговицу.Обязательно разрывайте небольшими шагами и двигайтесь вниз по разрыву, когда вы удаляете роговицу. Это гарантирует, что RPE останется в основном нетронутым, и вы получите более чистый разрыв. Как только роговица полностью отделится, вы сможете увидеть радужную оболочку и хрусталик.Удалите и радужную оболочку, и линзу щипцами, чтобы сохранить чистоту изоляции. Чтобы удалить нервную сетчатку из слоя RPE, захватите внешний слой глазника одним пинцетом и расположите руку второго пинцета между RPE и нейронным слоями. Оттуда осторожно потяните или зачерпните нервную сетчатку от слоя RPE, а затем отбросьте нервную сетчатку.Переместите слой RPE в другое место на блюде, свободное от мусора. Чтобы отделить RPE от сосудистой оболочки и склеры, аккуратно соскоблите внутреннюю часть наглазника пинцетом в стиле 5/45, чтобы обеспечить разделение клеток RPE. Клетки RPE кажутся мутными при подвешенной и полной среде роста клеток RPE.Аспирируйте клетки с помощью 3,2-миллилитровой стерильной трансферной пипетки и переносите в новую 15-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую полную среду роста клеток RPE. Ячейки могут быть центрифугированы при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем вы можете аспирировать супернатант и повторно использовать гранулу в подогретой среде роста клеток RPE.Разложите ячейки на 100-миллиметровой чашке Петри и высиживайте при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. Эти изображения показывают успешную изоляцию при прохождении 0 и пассаже 1, что проявляется пигментацией клеток RPE. При прохождении 4 клетки становятся менее характерными и проявляют меньше пигмента, показывают веретенообразный вид или становятся более прочными с большей площадью поверхности.Мы проверили клетки RPE с помощью RPE-специфического маркера RPE65 и цитоскелетного белка F-актина. Мы также проверили потенциальное загрязнение клетками Мюллера, окрашивая клеточным маркером Мюллера, виментином. Данный протокол представляет собой упрощенную адаптацию существующих протоколов.Протокол использует материалы и связанное с ними оборудование, которые доступны в большинстве исследовательских лабораторий, что поможет эффективно изолировать первичные клетки RPE мыши.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Выделение стволовых клеток сетчатки от мыши глаз

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Изоляция первичной мышь клетки трофобласта и анализа трофобласта Вторжение

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Выделение иммунных клеток из первичной опухоли

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Профили микроРНК выражение человеческой плюрипотентных клеток, пигментного эпителия сетчатки, полученных из IPS, и плода пигментного эпителия сетчатки

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Эффективное рассечение и культура первичной мыши сетчатки Пигмент эпителиальных клеток

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Выделение и характеристика первичных синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Первичная культура пигментных эпителиальных клеток свиньи свиней

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...