Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Ojo (NEI), el Instituto Nacional del Ojo (NEI) fondo R01 EY029751-04

Los animales se utilizaron según las pautas del protocolo animal IACUC número 21063 de la Universidad de Oakland y las pautas de la Declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.
1. Preparación de la solución
<ol><li>Prepare los medios de cultivo celular RPE completos complementando el medio de águila modificada de Dulbecco / mezcla de nutrientes F-12 (DMEM / F12) con 25% de suero bovino fetal (FBS), 1.5% de penicilina/estrept...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

El protocolo actual es un procedimiento detallado informado, modificado y simplificado para el aislamiento de RPE de los ojos del ratón. El protocolo incluye enucleación, disección, recolección, siembra, cultivo y caracterización de células RPE aisladas de ojos de ratón.
Existen algunas limitaciones y pasos críticos que deben cumplirse para un aislamiento exitoso del EPR, como la edad de los ratones, el número de ojos disecados, el tamaño de la placa o plato de cultivo de tejidos y l...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) se localizan entre la coroides y la retina neural, formando una monocapa simple de células cuboidales que se encuentra detrás de las células fotorreceptoras (PR)1. El EPR desempeña un papel crítico en el mantenimiento de un ambiente saludable para las células PR, principalmente al reducir la acumulación excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el consiguiente daño oxidativo1. Las células del EPR supervisan muchas funciones, como la conversión y almacenamiento de retinoides, la absorción de luz dispersa, el transporte de líquidos e iones, y la fagocitosis de la membrana del segmento externo PR desprendido 2,3. Las alteraciones en el EPR (morfología/función) pueden perjudicar su función conduciendo a la retinopatía y esta es una característica común compartida por muchos trastornos oculares4. Muchas enfermedades oculares están asociadas con alteraciones en la morfología y función de las células del EPR, incluyendo algunas enfermedades genéticas como la retinosis pigmentaria, la amaurosis congénita de Leber y el albinismo 4,5,6, así como trastornos oculares relacionados con la edad como la retinopatía diabética (RD) y la degeneración macular asociada a la edad (DMAE)7,8 . Las células humanas son las más deseables, por lo que sería ideal estudiar los trastornos del EPR en células primarias del EPR humano para formar monocapas del EPR. Sin embargo, las cuestiones éticas y la disponibilidad limitada de donantes humanos debido al hecho de que la mayoría de estos trastornos conducen a la morbilidad9, pero no necesariamente a la mortalidad10, lo que impide el aislamiento de las células humanas primarias del EPR. Esto hace que el cultivo de células RPE de donantes animales no humanos sea una alternativa preferida. Los roedores, particularmente los ratones, son considerados un gran modelo para estudiar diferentes enfermedades oculares, ya que la tecnología transgénica está más ampliamente establecida en estas especies11. Aunque el uso de células RPE primarias cultivadas ofrece muchas ventajas, ha sido difícil mantener las células en crecimiento durante muchos pasajes, o almacenar y reutilizar las células. La principal limitación de este protocolo es la edad de los ratones; Los ratones que se utilizan para el aislamiento de EPR deben ser de una edad muy temprana (18-21 días de edad es óptimo) ya que ha sido difícil cultivar células de EPR de ratones adultos11,12,13. Las células del EPR se pueden aislar de los ojos de ratón a cualquier edad, sin embargo, hasta cuatro pasajes celulares solo tuvieron éxito con ratones jóvenes (18-21 días de edad). El aislamiento del EPR de las retinas de ratón, utilizando ratones C57BL6 y ratones transgénicos con deleción de los receptores N-metil-D-aspartato (NMDAR) en las células del EPR, se realizó para estudiar el efecto de la homocisteína de aminoácidos elevados en el desarrollo y la progresión de la DMAE14. Además, las células primarias aisladas del EPR ayudaron a proponer una diana terapéutica para la DMAE mediante la inhibición de los NMDAR en las células del EPR14. Hay algunos bloqueadores NMDAR que están aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y actualmente se usan para tratar la confusión moderada a severa (demencia) relacionada con la enfermedad de Alzheimer (EA), como la memantina16, que podría ser un objetivo terapéutico potencial para la DMAE14. Además, se utilizaron células primarias aisladas de RPE de ratón para la detección de marcadores inflamatorios y la inducción propuesta de inflamación como mecanismo subyacente para las características de DMAE y EA inducidas por homocisteína utilizando un ratón modificado genéticamente (CBS), que presenta un alto nivel de homocisteína16,17.
Este protocolo se utilizó para aislar células RPE tanto de ratones C57BL / 6 de tipo salvaje como de ratones transgénicos desarrollados en nuestro laboratorio como una adaptación simplificada de otros protocolos de aislamiento publicados13,18,19 para alcanzar un protocolo fácilmente aplicable y confiable. No hay preferencia sexual en este protocolo. Si bien las edades de los ratones son críticas para el proceso de aislamiento, se utilizaron ratones jóvenes y envejecidos (18-21 días de edad) y ratones más viejos a cualquier edad (hasta 12 meses) para el aislamiento del EPR. Sin embargo, notamos que las células del EPR aisladas de los ratones jóvenes vivían más tiempo, y se podían realizar hasta cuatro pasajes. Las células del EPR aisladas de ratones más viejos podrían pasar una o dos veces, luego dejarían de crecer a un ritmo normal y cambiarían su forma para ser más alargadas (células similares a fibroblastos). También se observó pérdida de pigmentación y disminución de la adhesión a la placa de cultivo tisular seguida de desprendimiento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

La capa de epitelio pigmentado de la retina (EPR) se encuentra inmediatamente detrás de los fotorreceptores y alberga un sistema metabólico complejo que desempeña varios papeles críticos en el mantenimiento de la función de los fotorreceptores. Por lo tanto, la estructura y función del EPR son esenciales para mantener la visión normal. Este manuscrito presenta un protocolo establecido para el aislamiento primario de células RPE de ratón. El aislamiento de EPR es una gran herramienta para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la patología del EPR en los diferentes modelos murinos de trastornos oculares. Además, el aislamiento de EPR puede ayudar a comparar células primarias de EPR de ratón aisladas de ratones de tipo salvaje y genéticamente modificados, así como a probar medicamentos que pueden acelerar el desarrollo de la terapia para trastornos visuales. El manuscrito presenta un protocolo de aislamiento de EPR paso a paso; Todo el procedimiento, desde la enucleación hasta la siembra, dura aproximadamente 4 horas. Los medios no deben cambiarse durante 5-7 días después de la siembra, para permitir el crecimiento de las células aisladas sin perturbación. Este proceso es seguido por la caracterización de la morfología, pigmentación y marcadores específicos en las células a través de la inmunofluorescencia. Las células pueden pasar un máximo de tres o cuatro veces.

Validación de la especificidad, pureza y función/formación de barrera de células aisladas del EPR Las células aisladas se examinaron bajo un microscopio óptico para verificar su viabilidad, morfología y pigmentación. Se capturaron imágenes de P0 y P1 ( Figura 1A, B) e imágenes de P0 y P4 (Figura 1C, D) para mostrar los cambios en las células; forma, tamaño y pigmentación a medida que los pasajes avanzaban hacia e...

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Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Este manuscrito describe un protocolo simplificado para el aislamiento de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) de los ojos de ratón de una manera gradual. El protocolo incluye la enucleación y disección de los ojos del ratón, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de células del EPR.

Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Este protocolo describirá una manera fácil y eficiente de aislar con éxito las células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón. Las células del epitelio pigmentado de la retina juegan un papel muy importante para mantener las células fotorreceptoras y para garantizar la función normal de la retina. Nuestro laboratorio ha estado aislando células primarias pigmentadas de epitelio de ratón como una herramienta importante para estudiar la barrera hemato-retiniana externa y enfermedades relacionadas, como la degeneración macular relacionada con la edad.Para extraer los ojos del ratón, eutanasia ética al ratón de acuerdo con los métodos aprobados por su institución, luego coloque el ratón en una almohadilla inferior estéril y nuclee el ojo presionando una pinza estilo 5/45 en el área orbital para inducir proptosis, luego mueva la pinza a la parte posterior del ojo y tire suavemente para extraer el ojo asegurándose de que el nervio óptico aún esté intacto. Mientras usa fórceps, sumerja los ojos en un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contenga 5% de povidona yodada. Incubar los ojos a temperatura ambiente durante 2 a 3 minutos.Retire los ojos de la povidona yodada y colóquelos en una placa de Petri. Mientras usa una pipeta de transferencia estéril, lávese los ojos con la solución salina equilibrada de Hanks hasta que el color naranja de la povidona yodada haya desaparecido. Esto requiere aproximadamente de 2 a 3 lavados.Coloque los ojos en una nueva placa de Petri y sumérjalos en medios fríos de crecimiento celular RPE completo. A partir de ahí, puede comenzar a diseccionar bajo un microscopio de disección. Bajo el microscopio, use pinzas y/o tijeras Vannas para tirar o cortar el tejido conectivo en los músculos extraoculares.Luego, los ojos se pueden sostener durante una hora en medios de cultivo celular RPE fríos. Sin embargo, es preferible proceder directamente al siguiente paso después de limpiar el globo ocular. Transfiera los ojos a un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contenga la solución de la enzima A, luego incube los ojos dentro de una incubadora a 37 grados centígrados durante 40 minutos.Retire los ojos de la solución de enzima A y colóquelos en un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contenga la solución de enzima B, luego colóquelos dentro de una incubadora e incube a 37 grados centígrados durante 50 minutos. Retire los ojos de la enzima B y colóquelos en una placa de Petri de 60 milímetros y sumérjalos y complete los medios de crecimiento de células RPE, luego incube los ojos a 4 grados centígrados durante 30 minutos. Coloque el plato bajo el microscopio de disección y comience a diseccionar.Use fórceps M5S y una aguja de una jeringa para hacer una incisión en la sección de ora serata. Ahora con dos fórceps, agarre la parte interna de la incisión con una pinza y agarre la córnea con la otra pinza. Comience a arrancar lentamente la córnea de la retina tirando de la córnea.Asegúrese de desgarrar en pequeños incrementos y bajar el desgarro a medida que retira la córnea. Esto asegurará que el RPE permanezca casi intacto y obtendrá una lágrima más limpia. Una vez que la córnea esté completamente separada, debería poder ver el iris y el cristalino.Retire tanto el iris como el cristalino con fórceps para mantener la pureza del aislamiento. Para extraer la retina neural de la capa RPE, agarre la capa externa del ocular con una pinza y coloque un brazo de una segunda pinza entre las capas RPE y neural. A partir de ahí, tire suavemente o saque la retina neural de la capa RPE, luego deseche la retina neural.Mueva la capa de RPE a un lugar diferente en el plato libre de residuos. Para separar el EPR de la coroides y la esclerótica, raspe suavemente el interior del ocular con una pinza estilo 5/45 para asegurar la separación de las células del EPR. Las células del EPR aparecen turbias cuando están suspendidas y completan los medios de crecimiento de las células del EPR.Aspirar las células con una pipeta de transferencia estéril de 3,2 mililitros y transferirlas a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros que contenga medios completos de crecimiento celular del EPR. Las células se pueden centrifugar a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego puede aspirar el sobrenadante y resuspender el gránulo en medios de crecimiento de células RPE calentados.Coloque las células en una placa de Petri de 100 milímetros e incube a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Estas imágenes muestran un aislamiento exitoso en el pasaje 0 y el pasaje 1, que es evidente por la pigmentación de las células del EPR. En el pasaje 4, las células se vuelven menos características y exhiben menos pigmento, muestran una apariencia de huso o se vuelven más robustas con un área de superficie más grande.Validamos las células del EPR con un marcador específico del EPR, RPE65 y una proteína citoesquelética F-actina. También verificamos la posible contaminación con células de Muller mediante tinción con un marcador específico de células de Muller, la vimentina. Este protocolo es una adaptación simplificada de los protocolos existentes.El protocolo utiliza materiales y equipos asociados que están disponibles en la mayoría de los laboratorios de investigación, lo que ayudará a aislar las células RPE primarias de ratón de una manera efectiva.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Investigación

Biología

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

El aislamiento de las células inmunes de tumores primarios

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Perfiles de expresión de microARN de las células iPS humanas, de la retina del epitelio pigmentario Derivado de Ips y Fetal epitelio pigmentario de la retina

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Cultivo primario de células epiteliales pigmentarias de la retina porcina

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...