Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fond R01 EY029751-04

Djur användes enligt riktlinjerna från Oakland University IACUC djurprotokoll nummer 21063 och riktlinjerna i ARVO-uttalandet för användning av djur i oftalmisk och synforskning.
1. Beredning av lösningen
<ol><li>Förbered det kompletta RPE-cellodlingsmediet genom att komplettera Dulbeccos modifierade Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) med 25% Fetal Bovine Serum (FBS), 1.5% penicillin / streptomycin och 0.02% gentamicin.</li>
	<li>Bered enzym A genom att ...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

Det nuvarande protokollet är ett rapporterat, modifierat och förenklat detaljerat förfarande för RPE-isolering från musögon. Protokollet inkluderar enucleation, dissektion, insamling, sådd, odling och karakterisering av RPE-celler isolerade från musögon.
Det finns vissa begränsningar och kritiska steg som måste uppfyllas för framgångsrik RPE-isolering, såsom mössålder, antalet ögon som dissekerats, storleken på vävnadsodlingsplattan eller skålen och försiktighetsåtgärder...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Retinala pigmenterade epitelceller (RPE) är belägna mellan choroid och neural näthinna och bildar ett enkelt monolager av kuboidala celler som ligger bakom fotoreceptorcellerna (PR)1. RPE spelar en avgörande roll för att upprätthålla en hälsosam miljö för PR-celler, främst genom att minska överdriven ackumulering av reaktiva syrearter (ROS) och därmed oxidativ skada1. RPE-celler övervakar många funktioner, såsom omvandling och lagring av retinoider, absorption av spritt ljus, vätske- och jontransport och fagocytos av skjulets yttre segmentmembran 2,3. Förändringar i RPE (morfologi/funktion) kan försämra deras funktion vilket leder till retinopati och detta är en vanlig egenskap som delas av många okulära störningar4. Många okulära sjukdomar är förknippade med förändringar i morfologin och funktionen hos RPE-celler, inklusive vissa genetiska sjukdomar som retinitis pigmentosa, Leber medfödd amauros och albinism 4,5,6, liksom åldersrelaterade okulära störningar som diabetisk retinopati (DR) och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD)7,8 . Mänskliga celler är de mest önskvärda, så det skulle vara idealiskt att studera RPE-störningar i primära humana RPE-celler för att bilda RPE-monolager. Etiska frågor och den begränsade tillgången på mänskliga givare på grund av det faktum att de flesta av dessa störningar leder till sjuklighet9, men inte nödvändigtvis dödlighet10, förhindrar därmed isolering av primära mänskliga RPE-celler. Detta gör odling av RPE-celler från icke-mänskliga djurdonatorer till ett föredraget alternativ. Gnagare, särskilt möss, anses vara en bra modell för att studera olika ögonsjukdomar eftersom transgen teknik är mer omfattande etablerad i dessa arter11. Även om användningen av odlade primära RPE-celler erbjuder många fördelar, har det varit svårt att behålla växande celler för många passager, eller att lagra och återanvända cellerna. Huvudbegränsningen i detta protokoll är mössens ålder; möss som används för RPE-isolering bör vara i mycket ung ålder (18-21 dagar är optimalt) eftersom det har varit svårt att odla RPE-celler från vuxna möss11,12,13. RPE-celler kan isoleras från musögon i alla åldrar, men upp till fyra cellpassager lyckades bara med unga möss (18-21 dagar gamla). RPE-isolering från musnäthinnor, med användning av både C57BL6-möss och transgena möss med radering av N-metyl-D-aspartatreceptorerna (NMDAR) vid RPE-cellerna, utfördes för att studera effekten av förhöjd aminosyrahomocystein på utvecklingen och progressionen av AMD14. Dessutom hjälpte isolerade primära RPE-celler till att föreslå ett terapeutiskt mål för AMD genom hämning av NMDARs vid RPE-celler14. Det finns några NMDAR-blockerare som är godkända av Food and Drug Administration (FDA) och används för närvarande för att behandla måttlig till svår förvirring (demens) relaterad till Alzheimers sjukdom (AD), såsom memantin16, vilket kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål för AMD14. Vidare användes isolerade primära mus-RPE-celler för detektion av inflammatoriska markörer och den föreslagna induktionen av inflammation som en underliggande mekanism för homocysteininducerade egenskaper hos AMD och AD med hjälp av en genetiskt modifierad mus (CBS), som presenterar en hög nivå av homocystein16,17.
Detta protokoll användes för att isolera RPE-celler från både vildtyp C57BL / 6-möss och transgena möss som utvecklats i vårt laboratorium som en förenklad anpassning av andra publicerade isoleringsprotokoll13,18,19 för att nå ett lätt tillämpligt och pålitligt protokoll. Det finns ingen könspreferens i detta protokoll. Medan mössens åldrar är avgörande för isoleringsprocessen användes unga, åldrade möss (18-21 dagar gamla) och äldre möss i alla åldrar (upp till 12 månader) för RPE-isolering. Vi märkte dock att RPE-cellerna isolerade från de unga mössen levde längre och upp till fyra passager kunde utföras. RPE-cellerna isolerade från äldre möss kunde passeras en eller två gånger, då skulle de sluta växa i normal takt och ändra sin form för att vara mer långsträckta (fibroblastliknande celler). Förlust av pigmentering och minskad vidhäftning till vävnadsodlingsplattan följt av lossning observerades också.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

Det retinala pigmenterade epitelskiktet (RPE) ligger omedelbart bakom fotoreceptorerna och har ett komplext metaboliskt system som spelar flera kritiska roller för att upprätthålla fotoreceptorernas funktion. Således är RPE-strukturen och funktionen avgörande för att upprätthålla normal syn. Detta manuskript presenterar ett etablerat protokoll för primär mus RPE-cellisolering. RPE-isolering är ett utmärkt verktyg för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom RPE-patologi i de olika musmodellerna av okulära störningar. Dessutom kan RPE-isolering hjälpa till att jämföra primära mus RPE-celler isolerade från vildtyp och genetiskt modifierade möss, samt testa läkemedel som kan påskynda utvecklingen av terapi för synstörningar. Manuskriptet presenterar ett steg-för-steg RPE-isoleringsprotokoll; Hela proceduren, från enucleation till sådd, tar cirka 4 timmar. Media bör inte ändras i 5-7 dagar efter sådd, för att möjliggöra tillväxt av de isolerade cellerna utan störningar. Denna process följs av karakterisering av morfologi, pigmentering och specifika markörer i cellerna via immunofluorescens. Celler kan passeras högst tre eller fyra gånger.

Validering av specificitet, renhet och barriärfunktion/bildning av isolerade RPE-celler De isolerade cellerna undersöktes under ett ljusmikroskop för att verifiera deras livskraft, morfologi och pigmentering. Bilder från P0 och P1 (figur 1A,B) och bilder från P0 och P4 togs (figur 1C,D) för att visa förändringarna i cellerna; form, storlek och pigmentering när passagerna fortsatte till den fjärde passagen (svarta pil...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Detta manuskript beskriver ett förenklat protokoll för isolering av retinala pigmenterade epitelceller (RPE) från musögon på ett stegvis sätt. Protokollet inkluderar enucleation och dissektion av musögon, följt av isolering, sådd och odling av RPE-celler.

Isolering av primära musretinala pigmenterade epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Detta protokoll kommer att beskriva ett enkelt och effektivt sätt att framgångsrikt isolera primära musretinala pigmenterade epitelceller. Retinala pigmenterade epitelceller spelar en mycket viktig roll för att upprätthålla fotoreceptorcellerna och för att säkerställa näthinnans normala funktion. Vårt laboratorium har isolerat primära muspigmenterade epitelceller som ett viktigt verktyg för att studera den yttre blod-retinala barriären och relaterade sjukdomar som åldersrelaterad makuladegeneration.För att extrahera musögonen, avliva musen etiskt enligt din institutions godkända metoder, placera sedan musen på en steril underplatta och kärna ögat genom att trycka på en 5/45-pincett på orbitalområdet för att inducera proptos, flytta sedan pincetten till ögats bakre del och dra försiktigt för att ta bort ögat så att synnerven fortfarande är intakt. När du använder pincett, sänk ner ögonen i ett 2-milliliter mikrocentrifugrör innehållande 5% povidonjod. Inkubera ögonen vid rumstemperatur i 2 till 3 minuter.Ta bort ögonen från povidonjoden och lägg dem i en petriskål. Tvätta ögonen med Hanks'Balanced Saline Solution medan du använder en steril överföringspipett, tills den orange färgen på povidonjoden är borta. Detta tar ungefär 2 till 3 tvättar.Placera ögonen i en ny petriskål och sänk ner dem i kalla kompletta RPE-celltillväxtmedier. Därifrån kan du börja dissekera under ett dissekerande mikroskop. Under mikroskopet, använd pincett och / eller Vannas sax för att dra eller skära bort bindväv i extraokulära muskler.Ögon kan sedan hållas i en timme i kalla RPE-cellodlingsmedier. Det är dock att föredra att fortsätta direkt till nästa steg efter rengöring av ögongloben. Överför ögonen till ett 2-milliliter mikrocentrifugrör innehållande enzymet A-lösningen och inkubera sedan ögonen inuti en inkubator vid 37 grader Celsius i 40 minuter.Ta bort ögonen från enzymet A-lösningen och placera dem i ett nytt 2-milliliter mikrocentrifugrör innehållande enzymet B-lösningen, placera dem sedan i en inkubator och inkubera vid 37 grader Celsius i 50 minuter. Ta bort ögonen från enzym B och placera dem i en 60-millimeter petriskål och sänk ner dem och slutför RPE-celltillväxtmediet och inkubera sedan ögonen vid 4 grader Celsius i 30 minuter. Placera skålen under dissekeringsmikroskopet och börja dissekera.Använd M5S-pincett och en nål av en spruta för att göra ett snitt i ora seratta-sektionen. Nu med två pincett, ta tag i den inre delen av snittet med en tång och ta tag i hornhinnan med den andra tången. Börja långsamt riva hornhinnan från näthinnan genom att dra hornhinnan.Var noga med att riva i små steg och flytta ner tåren när du tar bort hornhinnan. Detta kommer att säkerställa att RPE förblir mestadels intakt och du får en renare tår. När hornhinnan är helt lossnad bör du kunna se iris och lins.Ta bort både iris och lins med pincett för att bibehålla isoleringens renhet. För att ta bort den neurala näthinnan från RPE-skiktet, ta tag i ögonmusslans yttre lager med en pincett och placera en arm av en andra pincett mellan både RPE- och neurala lager. Därifrån drar eller skopar försiktigt den neurala näthinnan bort från RPE-lagret och kasserar sedan den neurala näthinnan.Flytta RPE-lagret till en annan plats på skålen fri från skräp. För att separera RPE från choroid och sclera, skrapa försiktigt insidan av ögonmusslan med en 5/45-stil pincett för att säkerställa separationen av RPE-cellerna. RPE-cellerna verkar grumliga när de är upphängda och kompletterar RPE-celltillväxtmediet.Aspirera cellerna med hjälp av en 3,2-milliliter steril överföringspipett och överför till ett nytt 15-milliliters centrifugrör som innehåller komplett RPE-celltillväxtmedium. Cellerna kan centrifugeras vid 300 g i 10 minuter vid rumstemperatur. Du kan sedan aspirera ut supernatanten och återsuspendera pelleten i uppvärmda RPE-celltillväxtmedier.Platta cellerna på en 100-millimeters petriskål och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% CO2. Dessa bilder visar en framgångsrik isolering vid passage 0 och passage 1, vilket framgår av pigmenteringen av RPE-cellerna. Vid passage 4 blir cellerna mindre karakteristiska och uppvisar mindre pigment, visar ett spindelliknande utseende eller blir mer robusta med en större yta.Vi validerade RPE-cellerna med en RPE-specifik markör, RPE65 och ett cytoskelettprotein F-aktin. Vi kontrollerade också för potentiell kontaminering med Muller-celler genom färgning med en Muller-cellspecifik markör, vimentin. Detta protokoll är en förenklad anpassning av befintliga protokoll.Protokollet använder material och tillhörande utrustning som finns i de flesta forskningslaboratorier, vilket hjälper till att isolera primära mus RPE-celler på ett effektivt sätt.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolering av näthinnan stamceller från mus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolering av primära celler Mus trofoblaster och trofoblaster Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolering av immunceller från primära tumörer

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA Expression Profiler av Human iPS-celler, pigmentepitelet härledas från iPS, och Fetal pigmentepitelet

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primära cellkulturer från mus Retinal pigmentepitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effektiv dissekering och kultur av primära mus retinal pigment epitelceller

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolering och karakterisering av mus primära lever sinusformade endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primär odling av svin retinala pigmentepitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...