Name: isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Göz Enstitüsü (NEI), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) fonu R01 EY029751-04 tarafından desteklenmiştir.

Hayvanlar, Oakland Üniversitesi IACUC hayvan protokolü numarası 21063 yönergelerine ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Beyanı'nın kılavuzlarına göre kullanılmıştır.
1. Çözelti hazırlama
<ol><li>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı / Besin Karışımı F-12'yi (DMEM / F12) % 25 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 1.5 penisilin / streptomisin ve% 0.02 gentamisin ile destekleyerek RPE hücre kültürü ortamının tamamını ...

<ol>
	<li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones.">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene.">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li><li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis.">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li><li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes.">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li><li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+human+RPE:+morphometric+analysis+of+macular,+equatorial,+and+peripheral+cells.">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li><li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration.">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+review+of+pathogenesis.">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li><li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies.">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration.">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).</li><li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer's+disease.">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li><li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain.">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).</li><li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases:+role+of+inflammation.">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07.">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020)</li><li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65:+role+in+the+visual+cycle,+human+retinal+disease,+and+gene+therapy.">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li><li>P&#233;rez-&#193;lvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2.">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li><li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+(BRB)+dysfunction.">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).</li><li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomethylfumarate+induces+&#947;-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+and+erythroid+cells,+and+in+intact+retina.">Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li></ol>

Geçerli protokol, fare gözlerinden RPE yalıtımı için raporlanmış, değiştirilmiş ve basitleştirilmiş ayrıntılı bir yordamdır. Protokol, fare gözlerinden izole edilen RPE hücrelerinin enükleasyonu, diseksiyonu, toplanması, tohumlanması, kültürü ve karakterizasyonunu içerir.
Başarılı RPE izolasyonu için farelerin yaşı, disseke edilen göz sayısı, doku kültürü tabağının veya kabının büyüklüğü ve tohumlama, depolama ve pasajdan sonra uyarılar gibi yer...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Retinal pigmentli epitel (RPE) hücreleri, koroid ve nöral retina arasında bulunur ve fotoreseptör (PR) hücrelerinin arkasında yatan basit bir küboidal hücre tabakası oluşturur1. RPE, PR hücreleri için sağlıklı bir ortamın korunmasında, esas olarak reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı birikimini ve bunun sonucunda oksidatif hasarı azaltarak kritik bir rol oynar1. RPE hücreleri, retinoidlerin dönüşümü ve depolanması, dağınık ışığın emilimi, sıvı ve iyon taşınması ve dökülen PR dış segment membranının fagositozu 2,3 gibi birçok işlevi denetler. RPE'deki değişiklikler (morfoloji/fonksiyon) retinopatiye yol açan fonksiyonlarını bozabilir ve bu birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan ortak bir özelliktir4. Birçok oküler hastalık, retinitis pigmentosa, Leber konjenital amauroz ve albinizm 4,5,6 gibi bazı genetik hastalıkların yanı sıra diyabetik retinopati (DR) ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi yaşa bağlı oküler bozukluklar da dahil olmak üzere RPE hücrelerinin morfolojisi ve fonksiyonundaki değişikliklerle ilişkilidir7,8 . İnsan hücreleri en çok arzu edilenlerdir, bu nedenle RPE monokatmanları oluşturmak için birincil insan RPE hücrelerindeki RPE bozukluklarını incelemek ideal olacaktır. Bununla birlikte, etik konular ve bu bozuklukların çoğunun morbiditeye yol açması nedeniyle insan donörlerinin sınırlı mevcudiyeti9, ancak mutlaka mortalite10 değil, böylece birincil insan RPE hücrelerinin izolasyonunu engellemektedir. Bu, insan olmayan hayvan donörlerinden RPE hücrelerinin kültürlenmesini tercih edilen bir alternatif haline getirir. Kemirgenler, özellikle fareler, farklı oküler hastalıkları incelemek için harika bir model olarak kabul edilir, çünkü transgenik teknoloji bu türlerde daha yaygın olarak kurulmuştur11. Kültürlenmiş primer RPE hücrelerinin kullanımı birçok avantaj sunsa da, birçok pasaj için büyüyen hücreleri korumak veya hücreleri depolamak ve yeniden kullanmak zor olmuştur. Bu protokolün ana sınırlaması farelerin yaşıdır; RPE izolasyonu için kullanılan fareler çok genç yaşta olmalıdır (18-21 günlüklük en uygunudur), çünkü yetişkin farelerden RPE hücrelerini kültürlemek zor olmuştur11,12,13. RPE hücreleri her yaşta fare gözlerinden izole edilebilir, ancak dört hücreye kadar pasaj sadece genç farelerde (18-21 günlük) başarılı olmuştur. RPE hücrelerinde N-metil-D-aspartat reseptörlerinin (NMDAR'lar) silinmesiyle hem C57BL6 fareleri hem de transgenik fareler kullanılarak fare retinalarından RPE izolasyonu, yüksek amino asit homosisteinin AMD14'ün gelişimi ve ilerlemesi üzerindeki etkisini incelemek için gerçekleştirildi. Ek olarak, izole primer RPE hücreleri, RPE hücrelerinde NMDAR'ların inhibisyonu ile AMD için terapötik bir hedef önerilmesine yardımcı oldu14. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan ve şu anda AMD14 için potansiyel bir terapötik hedef olabilecek memantin16 gibi Alzheimer hastalığına (AD) bağlı orta ila şiddetli karışıklığı (demans) tedavi etmek için kullanılan bazı NMDAR blokerleri vardır. Ayrıca, izole primer fare RPE hücreleri, enflamatuar belirteçlerin tespiti ve yüksek düzeyde homosistein16,17 sunan genetiği değiştirilmiş bir fare (CBS) kullanılarak AMD ve AD'nin homosistein kaynaklı özellikleri için altta yatan bir mekanizma olarak inflamasyonun önerilen indüksiyonu için kullanılmıştır.
Bu protokol, RPE hücrelerini hem vahşi tip C57BL / 6 farelerden hem de laboratuvarımızda geliştirilen transgenik farelerden, kolayca uygulanabilir ve güvenilir bir protokole ulaşmak için diğer yayınlanmış izolasyon protokollerinin 13,18,19'unun basitleştirilmiş bir uyarlaması olarak izole etmek için kullanılmıştır. Bu protokolde cinsiyet tercihi yoktur. Farelerin yaşları izolasyon süreci için kritik öneme sahipken, RPE izolasyonu için genç, yaşlı fareler (18-21 günlük) ve herhangi bir yaştaki (12 aya kadar) yaşlı fareler kullanılmıştır. Bununla birlikte, genç yaşlı farelerden izole edilen RPE hücrelerinin daha uzun yaşadığını ve dört pasajın gerçekleştirilebileceğini fark ettik. Yaşlı farelerden izole edilen RPE hücreleri bir veya iki kez geçirilebilir, daha sonra normal bir oranda büyümeyi durdurur ve şekillerini daha uzun olacak şekilde değiştirirler (fibroblast benzeri hücreler). Pigmentasyon kaybı ve doku kültürü plağına yapışmanın azalması ve ardından dekolmanı da gözlendi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7657-25MG</td>
			<td>For working enzyme, A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>&#160;gibco&#160;</td>
			<td>11330</td>
			<td>Media to grow RPE cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88284</td>
			<td>For working enzymes (A&#38;B)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td>For working enzyme A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td>
			<td>ab78036</td>
			<td>For IF staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete RPE cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>2186962</td>
			<td>For working enzyme B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium cells

Retinal pigmentli epitel (RPE) tabakası, fotoreseptörlerin hemen arkasında yer alır ve fotoreseptörlerin işlevini sürdürmede birkaç kritik rol oynayan karmaşık bir metabolik sistemi barındırır. Bu nedenle, RPE yapısı ve işlevi normal görüşü sürdürmek için gereklidir. Bu yazıda primer fare RPE hücre izolasyonu için belirlenmiş bir protokol sunulmaktadır. RPE izolasyonu, oküler bozuklukların farklı fare modellerinde RPE patolojisinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için harika bir araçtır. Ayrıca, RPE izolasyonu, vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş farelerden izole edilen birincil fare RPE hücrelerinin karşılaştırılmasında ve görme bozuklukları için tedavinin gelişimini hızlandırabilecek ilaçların test edilmesinde yardımcı olabilir. Makale adım adım RPE izolasyon protokolü sunmaktadır; enükleasyondan tohumlamaya kadar tüm prosedür yaklaşık 4 saat sürer. İzole hücrelerin bozulmadan büyümesine izin vermek için tohumlamadan sonra 5-7 gün boyunca ortam değiştirilmemelidir. Bu süreci, immünofloresan yoluyla hücrelerdeki morfoloji, pigmentasyon ve spesifik belirteçlerin karakterizasyonu izler. Hücreler en fazla üç veya dört kez geçirilebilir.

İzole RPE hücrelerinin özgüllüğünün, saflığının ve bariyer fonksiyonunun/oluşumunun doğrulanması İzole edilen hücreler, canlılıklarını, morfolojilerini ve pigmentasyonlarını doğrulamak için bir ışık mikroskobu altında incelendi. Hücrelerdeki değişiklikleri göstermek için P0 ve P1'den görüntüler (Şekil 1A,B) ve P0 ve P4'ten görüntüler (Şekil 1C,D) yakalandı; Pasajlar dördüncü pasaja...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Bu protokol, birincil fare retinal pigmentli epitel hücrelerini başarılı bir şekilde izole etmenin kolay ve etkili bir yolunu özetleyecektir. Retina pigmentli epitel hücreleri, fotoreseptör hücrelerin korunmasında ve retinanın normal fonksiyonunun sağlanmasında çok önemli bir rol oynar. Laboratuvarımız primer fare pigmentli epitel hücrelerini, dış kan-retina bariyerini ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi ilgili hastalıkları incelemek için önemli bir araç olarak izole etmektedir.Fare gözlerini çıkarmak için, fareyi kurumunuzun onaylı yöntemlerine göre etik olarak ötenazi yapın, ardından fareyi steril bir alt tabana yerleştirin ve proptozu indüklemek için orbital bölgeye 5/45 tarzı bir cımbız basarak gözü çekirdeklendirin, ardından cımbızı gözün arkasına doğru hareket ettirin ve optik sinirin hala sağlam olmasını sağlamak için gözü çıkarmak için yavaşça çekin. Forseps kullanırken, gözleri% 5 povidon iyot içeren 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne batırın. Gözleri oda sıcaklığında 2 ila 3 dakika kuluçkaya yatırın.Gözleri povidon iyottan çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin. Steril bir transfer pipeti kullanırken, povidon iyotun turuncu rengi gidene kadar gözleri Hanks'Balanced Saline Solution ile yıkayın. Bu yaklaşık 2 ila 3 yıkama gerektirir.Gözleri yeni bir Petri kabına yerleştirin ve soğuk tam RPE hücre büyüme ortamına batırın. Oradan, diseksiyon mikroskobu altında diseksiyona başlayabilirsiniz. Mikroskop altında, ekstraoküler kaslardaki bağ dokusunu çekmek veya kesmek için cımbız ve / veya Vannas makası kullanın.Gözler daha sonra soğuk RPE hücre kültürü ortamında bir saat tutulabilir. Ancak göz küresini temizledikten sonra doğrudan bir sonraki adıma geçmek tercih edilir. Gözleri, A enzimi çözeltisini içeren 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, ardından gözleri 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörün içinde inkübe edin.Gözleri A enzimi çözeltisinden çıkarın ve B enzimi çözeltisini içeren yeni bir 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, ardından bir inkübatörün içine yerleştirin ve 50 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Gözleri B enziminden çıkarın ve 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve batırın ve RPE hücresi büyüme ortamını tamamlayın, ardından gözleri 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Çanağı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve diseksiyona başlayın.Ora seratta bölümünde bir kesi yapmak için M5S forseps ve bir şırınga iğnesi kullanın. Şimdi iki forseps ile, bir forseps ile insizyonun iç kısmını kavrayın ve korneayı diğer forseple kavrayın. Korneayı çekerek retinadan yavaşça yırtmaya başlayın.Küçük artışlarla yırttığınızdan ve korneayı çıkarırken yırtığı aşağı doğru hareket ettirdiğinizden emin olun. Bu, RPE'nin çoğunlukla bozulmadan kalmasını ve daha temiz bir gözyaşı elde etmenizi sağlayacaktır. Kornea tamamen ayrıldıktan sonra, iris ve lensi görebilmelisiniz.İzolasyonun saflığını korumak için hem irisi hem de lensi forseps ile çıkarın. Nöral retinayı RPE katmanından çıkarmak için, vizör adaptörünün dış tabakasını bir cımbızla kavrayın ve ikinci bir cımbızın bir kolunu hem RPE hem de nöral katmanlar arasında konumlandırın. Oradan, nöral retinayı RPE katmanından yavaşça çekin veya kepçeyle uzaklaştırın, ardından nöral retinayı atın.RPE katmanını tabakta döküntü içermeyen farklı bir yere taşıyın. RPE'yi koroid ve skleradan ayırmak için, RPE hücrelerinin ayrılmasını sağlamak için vizör adaptörünün içini 5/45 tarzı bir cımbızla hafifçe kazıyın. RPE hücreleri askıya alındığında bulutlu görünür ve RPE hücresi büyüme ortamını tamamlar.3,2 mililitrelik steril transfer pipeti kullanarak hücreleri aspire edin ve eksiksiz RPE hücre büyüme ortamı içeren 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300g'da santrifüj edilebilir. Daha sonra süpernatantı aspire edebilir ve peleti ısıtılmış RPE hücre büyüme ortamında yeniden askıya alabilirsiniz.Hücreleri 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Bu görüntüler, RPE hücrelerinin pigmentasyonu ile belirgin olan pasaj 0 ve pasaj 1'de başarılı bir izolasyon göstermektedir. 4. pasajda, hücreler daha az karakteristik hale gelir ve daha az pigment sergiler, iğ benzeri bir görünüm gösterir veya daha geniş bir yüzey alanı ile daha sağlam hale gelir.RPE hücrelerini RPE'ye özgü bir belirteç, RPE65 ve bir sitoiskelet proteini F-aktin ile doğruladık. Ayrıca, Muller hücresine özgü bir belirteç olan vimentin ile boyayarak Muller hücreleri ile potansiyel kontaminasyonu kontrol ettik. Bu protokol, mevcut protokollerin basitleştirilmiş bir uyarlamasıdır.Protokol, çoğu araştırma laboratuvarında bulunan ve birincil fare RPE hücrelerinin etkili bir şekilde izole edilmesine yardımcı olacak malzemeleri ve ilgili ekipmanları kullanır.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...