Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج أبحاث مؤسسة جمعية الصدر الأمريكية ، ومؤسسة نيو جيرسي الصحية ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (جائزة CAREER 2143620) إلى J.K. ؛ والمعاهد الوطنية للصحة (P41 EB027062) إلى G.V.N.

تمت الموافقة على بروتوكول الأنسجة الحيوانية أدناه من قبل المبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة برعاية الحيوان ولوائح لجنة معهد رعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في معهد ستيفنز للتكنولوجيا ، وهو يتوافق مع المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) لاستخدام التجارب.
1. تصميم...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+the+epithelium+in+chronic+upper+airways+diseases.">Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).</li><li>Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+function+of+airway+tract+epithelium.">Barrier function of airway tract epithelium.</a> Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).</li><li>De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium+dysfunction+in+cystic+fibrosis+and+COPD.">Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD.</a> Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).</li><li>Horani, A., Ferkol, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+genetics+of+primary+ciliary+dyskinesia:+Clinical+implications.">Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications.</a> Chest. 154 (3), 645-652 (2018).</li><li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis.">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).</li><li>Shrestha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-on-a-chip:+the+future+of+respiratory+disease+models+and+pharmacological+studies.">Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).</li><li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro.">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li><li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pulmonary+cystic+fibrosis+in+a+human+lung+airway-on-a-chip.">Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip.</a> Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).</li><li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Gilpin, S. E., Wagner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+lung+scaffolds+to+model+lung+disease+and+tissue+regeneration.">Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration.</a> European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+lungs+for+transplantation.">Bioengineering lungs for transplantation.</a> Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).</li><li>Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+regeneration:+steps+toward+clinical+implementation+and+use.">Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).</li><li>Planchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).</li><li>Coward, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).</li><li>Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+decellularization+using+a+combination+of+chemical,+physical+and+bioreactor+methods.">Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods.</a> The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).</li><li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds.">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

في هذا العمل ، أنشأنا مفاعلا حيويا موجها بالتصوير يمكن أن يسمح (i) بمراقبة تجويف القصبة الهوائية في الموقع بعد إزالة الخلية وتوصيل الخلايا الخارجية و (ii) على المدى الطويل في المختبر لأنسجة القصبة الهوائية المزروعة بالخلايا. باستخدام هذا المفاعل الحيوي المصمم خصيصا ، أظهرنا (i) الإ?...

يصطف السطح المضيء للجهاز التنفسي بطبقة من الظهارة تتكون أساسا من الخلايا الجذعية متعددة الأهداب والنادي والكأس والخلايا الجذعية القاعدية 1,2. تعمل الطبقة الظهارية كآلية دفاعية أولية للرئة ، حيث تعمل كحاجز فيزيائي حيوي يحمي أنسجة مجرى الهواء الأساسي من مسببات الأمراض المستنشقة أو الجسيمات أو الغازات الكيميائية. يحمي أنسجة مجرى الهواء عبر آليات متعددة ، بما في ذلك تكوين تقاطع ضيق بين الخلايا ، وإزالة الغشاء المخاطي الهدبي ، وإفراز مضادات الميكروبات ومضادات الأكسدة 3,4. ترتبط ظهارة مجرى الهواء المعيبة بأمراض الجهاز التنفسي المدمرة، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)5، وخلل الحركة الهدبية الأولية (PCD)6، والتليف الكيسي (CF)7.
يمثل التقدم في تكنولوجيا الرئة على الرقاقة (LOC) فرصة لدراسة تطور الرئة البشرية ، ونمذجة أمراض الرئة المختلفة ، وتطوير مواد علاجية جديدة في بيئات مختبرية منظمة بإحكام. على سبيل المثال ، يمكن استزراع ظهارة مجرى الهواء والبطانة على الجانبين المتقابلين من غشاء رقيق مسامي لتقليد الغاز الذي يتبادل أنسجة الرئة ، مما يسمح بنمذجة الأمراض المخلصة واختبار الأدوية8. وبالمثل ، تم إنشاء نماذج الأمراض في المختبر لنمذجة أمراض مجرى الهواء في المختبر ، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن9 والتليف الكيسي10. ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي لأجهزة LOC هو تلخيص البنية المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) لأنسجة الرئة وتفاعلات مصفوفة الأنسجة الخلوية الديناميكية في المختبر11.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير منهجيات هندسة الأنسجة المبتكرة التي تسمح بالتلاعب بأنسجة الرئة خارج الجسم الحي 12. باستخدام هذه المنهجيات ، يمكن تحضير طعوم الأنسجة الخالية أو الغريبة عن طريق إزالة الخلايا الداخلية من أنسجة الرئة عن طريق العلاجات الكيميائية والفيزيائية والميكانيكية13. بالإضافة إلى ذلك ، توفر مصفوفة الأنسجة الأصلية خارج الخلية المحفوظة (ECM) في سقالات الرئة المنزوعة الخلايا الإشارات الهيكلية والكيميائية الحيوية والميكانيكية الحيوية للخلايا المزروعة لربط وتكاثر وتمييز14,15.
هنا ، يتم الإبلاغ عن نظام مفاعل حيوي موجه بالتصوير تم إنشاؤه من خلال الجمع بين تقنيات LOC وهندسة الأنسجة للسماح في المختبر بمعالجة الأنسجة وزراعة أنسجة القصبة الهوائية للفئران المزروعة. باستخدام هذا المفاعل الحيوي لأنسجة مجرى الهواء ، يوضح البروتوكول الإزالة الانتقائية للخلايا الظهارية الداخلية دون تعطيل المكونات الخلوية والكيميائية الحيوية تحت الظهارية الأساسية لأنسجة مجرى الهواء. نعرض بعد ذلك التوزيع المتجانس والترسب الفوري للخلايا الخارجية المبذرة حديثا ، مثل الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، على تجويف مجرى الهواء العارية عن طريق غرس محلول الكولاجين I المحمل بالخلية I قبل الهلام. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام جهاز التصوير الضوئي الدقيق المدمج في المفاعل الحيوي ، يتم أيضا تصور تجويف القصبة الهوائية أثناء إزالة الظهارة وتوصيل الخلايا الذاتية. علاوة على ذلك ، تبين أنه يمكن زراعة القصبة الهوائية والخلايا المزروعة حديثا في المفاعل الحيوي دون موت ملحوظ للخلايا وتدهور الأنسجة لمدة 4 أيام. نحن نتصور أن منصة المفاعل الحيوي التي تدعم التصوير ، وتقنية إزالة الظهارة القائمة على الأغشية الرقيقة ، وطريقة توصيل الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة يمكن أن تكون مفيدة لتوليد أنسجة مجرى الهواء لنمذجة الأمراض في المختبر وفحص الأدوية.
يتضمن المفاعل الحيوي غرفة مستطيلة متصلة بمضخة حقنة قابلة للبرمجة ومضخة تروية وجهاز تهوية لزراعة القصبة الهوائية للفئران المعزولة. يتميز المفاعل الحيوي بمداخل ومنافذ متصلة بالقصبة الهوائية أو غرفة زراعة الأنسجة لتزويد الكواشف بشكل منفصل (مثل وسائط الاستزراع) بالمساحات الداخلية والخارجية للقصبة الهوائية (الشكل 1). يمكن استخدام نظام تصوير مصمم خصيصا لتصور الجزء الداخلي من القصبة الهوائية للفئران المستزرعة في المختبر على المستوى الخلوي (الشكل 2). تتم إزالة الظهارة الداخلية للقصبة الهوائية عن طريق تقطير محلول إزالة الخلايا القائم على المنظفات يليه غسل مجرى الهواء بمساعدة الاهتزاز (الشكل 3). يستخدم محلول الهيدروجيل ، مثل الكولاجين من النوع الأول ، كوسيلة توصيل لبذر الخلايا الخارجية بشكل موحد وفوري عبر تجويف القصبة الهوائية العارية (الشكل 4). يتم توفير جميع المواد المستخدمة لبناء المفاعل الحيوي وإجراء التجارب في جدول المواد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

يمكن أن تؤدي الإصابة المتكررة لأنسجة مجرى الهواء إلى إضعاف وظائف الرئة والتسبب في أمراض الرئة المزمنة، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن. يوفر التقدم في الطب التجديدي وتقنيات المفاعلات الحيوية فرصا لإنتاج أنسجة وظيفية مزروعة في المختبر وهياكل الأعضاء التي يمكن استخدامها لفحص الأدوية ونمذجة الأمراض وهندسة استبدال الأنسجة. هنا ، يتم وصف مفاعل حيوي مصغر مقترن بطريقة تصوير تسمح في الموقع بتصور التجويف الداخلي للقصبة الهوائية للفئران المسحوبة أثناء التلاعب بالأنسجة في المختبر والزراعة. باستخدام هذا المفاعل الحيوي ، يوضح البروتوكول الإزالة الانتقائية الموجهة بالتصوير للمكونات الخلوية الداخلية مع الحفاظ على الميزات الكيميائية الحيوية الجوهرية والبنية الفائقة لمصفوفة أنسجة مجرى الهواء. علاوة على ذلك ، يتم عرض التسليم والتوزيع الموحد والاستزراع المطول اللاحق للخلايا الخارجية على تجويف مجرى الهواء الخالي من الخلايا مع المراقبة البصرية في الموقع . وتسلط النتائج الضوء على أنه يمكن استخدام المفاعل الحيوي الموجه بالتصوير لتسهيل توليد أنسجة مجرى الهواء الوظيفية في المختبر .

يمكن أن تسمح طريقة التصوير في الموقع القائمة على عدسة GRIN بتصور التجويف الداخلي للقصبة الهوائية في الموقع (الشكل 5A). باستخدام طريقة التصوير هذه ، يمكن الحصول على صور المجال الساطع والفلورسنت للقصبة الهوائية الأصلية وغير الظهارية (الشكل 5B ، C</str...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

يصف البروتوكول مفاعلا حيويا ممكنا للتصوير يسمح بالإزالة الانتقائية للظهارة الداخلية من القصبة الهوائية للفئران والتوزيع المتجانس للخلايا الخارجية على سطح التجويف ، يليه زراعة طويلة الأجل في المختبر لبناء أنسجة الخلية.

مفاعل حيوي موجه بالتصوير لتوليد أنسجة مجرى الهواء المهندسة بيولوجيا

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

يسمح هذا البروتوكول بالزراعة في المختبر والتصور المجهري المباشر لأنسجة مجرى الهواء المعزولة أثناء إجراءات معالجة الأنسجة المختلفة ، مثل إزالة الظهارة وتجديد أنسجة مجرى الهواء. يسمح التصوير في الموقع المقترح في هذه الدراسة بالمراقبة السريعة وغير المدمرة لتجويف القصبة الهوائية أثناء الإزالة الخاضعة للرقابة الموجهة بالتصوير للظهارة الداخلية وتوصيل الخلايا الخارجية. يمكن استخدام منصة التفاعل الحيوي الموجهة بالتصوير وبروتوكولات معالجة الأنسجة لتوليد أنسجة مجرى الهواء المهندسة بيولوجيا لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية.سيتم عرض بناء واستخدام المفاعل الحيوي لأنسجة مجرى الهواء المدعوم بالتصوير من قبل اثنين من طلاب الدكتوراه من مجموعتنا البحثية ، محمد مير ، وجياوين تشن. لبدء إنشاء جهاز تصوير في الموقع، أدخل عدسة أنبوبية في أنبوب عدسة قابل للتكديس وقم بتأمينه باستخدام حلقة استبقاء. بعد ذلك، قم بتركيب مجموعة طاولة العدسة على كاميرا CMOS علمية عبر محول C-mount.استخدم برنامج Micromanager لتشغيل الكاميرا والحصول على الصور ومقاطع الفيديو. أثناء استهداف كائن يقع على بعد 10 أمتار من الكاميرا ، اضبط المسافة بين عدسة الأنبوب ومستشعر التصوير الخاص بالكاميرا حتى يتم تشكيل صورة مركزة للكائن على شاشة الكمبيوتر. بعد ذلك ، استخدم مكونات نظام القفص البصري ، مثل قضيب التجميع ولوحة القفص الملولبة ومكعب القفص لتركيب عدسة مرشح على مرآة ثنائية اللون ذات حواف مزدوجة وفائقة الدقة وليزر على الجهاز.قم بتوصيل عدسة موضوعية مقاس 20 ضعفا بالجهاز. بعد ذلك، قم بتركيب عدسة خضراء يبلغ قطرها 500 ميكرومتر في الطرف البعيد من أنبوب العدسة عبر مترجم X-Y. اضبط المسافة بين العدسات الخضراء والعدسات الموضوعية لتشكيل الصور المجهرية المركزة.لتصور تجويف القصبة الهوائية للفئران المعزولة في المجال الساطع أو الفلورسنت ، ضع المفاعل الحيوي على مرحلة التصوير. بعد ذلك ، قم بغرس 500 ميكرولتر من استر الكربوكسي فلوريسين سوكسينيميديل المحضر حديثا ، أو محلول CFSE ، بمعدل تدفق قدره خمسة ملليلتر في الدقيقة عبر القصبة الهوائية عبر مضخة المحقنة المتصلة بأنابيب قنية القصبة الهوائية. بمجرد أن يملأ محلول CFSE القصبة الهوائية ، أوقف المضخة.بعد 10 دقائق ، اغسل تجويف القصبة الهوائية عن طريق غرس 10 ملليلتر من PBS باستخدام مضخة المحقنة لإزالة كواشف CFSE المتبقية غير المدمجة. بعد الغسيل، أدخل نهاية التصوير البعيدة للعدسة الخضراء في القصبة الهوائية عبر موصل luer المتصل بأحد طرفي القصبة الهوائية. ثم حرك العدسة الخضراء برفق داخل القصبة الهوائية حتى يتم تركيز سطح القصبة الهوائية.لالتقاط صور المجال الساطع في برنامج micromanager ، قم بإضاءة تجويف القصبة الهوائية بضوء أبيض من خلال مكعب القفص. ثم انقر فوق الرمز Live لإظهار سطح Lumenal للقصبة الهوائية في الوقت الفعلي. استخدم علامتي التبويب إعداد التصوير والتعريض الضوئي لتغيير وقت التعرض إلى القيمة المطلوبة.لضبط تباين الصور وسطوعها، استخدم نافذة قياس الرسم البياني والكثافة لنقل الأسهم بالأبيض والأسود في نقطة نهاية شاشة الرسم البياني التفاعلي. انقر على إيقاف البث المباشر لتنشيط أيقونة Snap ، ثم انقر فوق رمز Snap لتجميد الصورة. بعد ذلك ، استخدم الإعداد تصدير ثم الصور كعلامات تبويب نازحة لحفظ الصور بالتنسيق المطلوب.للحصول على الصور ومقاطع الفيديو في وضع الفلورسنت ، قم بإضاءة تجويف القصبة الهوائية بضوء ليزر خاص ب CFSE من خلال مكعب القفص واحصل على الصور في الوقت الفعلي عن طريق تحريك مسبار التصوير ذهابا وإيابا. بمجرد الحصول على الصور ومقاطع الفيديو ، قم بإزالة العدسة الخضراء بلطف من القصبة الهوائية. لإزالة الظهارة من القصبة الهوائية ، غرس 50 ميكرولتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم الطازجة 2٪ من خلال قنية القصبة الهوائية لتوليد طبقة رقيقة من محلول المنظفات على تجويف القصبة الهوائية.بعد التقطير ، أغلق وصلات أنابيب المفاعل الحيوي باستخدام سدادات luer من الذكور أو الإناث ونقل المفاعل الحيوي إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح ل SDS بالسكن داخل القصبة الهوائية. كرر التقطير مرة واحدة. بعد التقطير الثاني ، قم بإزالة الظهارة المحللة و SDS عن طريق ري تجويف القصبة الهوائية ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من PBS عبر مضخة حقنة بمعدل تدفق 10 ملليلتر في الدقيقة.ثم ضع المفاعل الحيوي على شاكر ليهتز ميكانيكيا بتردد 20 هرتز وسعة إزاحة تبلغ 0.3 ملم لتعزيز انفصال الخلايا الظهارية المعالجة ب SDS جسديا عن تجويف القصبة الهوائية. في حين أن القصبة الهوائية تهتز ميكانيكيا ، قم بغرس 500 ميكرولتر من PBS مرتين من خلال تجويف القصبة الهوائية لإزالة SDS المتبقي وحطام الخلايا. بعد إزالة الظهارة ، قم بتقييم إزالة الطبقة الظهارية عن طريق قياس شدة CFSE باستخدام جهاز تصوير العدسة الخضراء.بعد تحضير القصبة الهوائية للفئران غير الظهارية ، قم بإذابة الخلايا الجذعية الوسيطة المجمدة ، أو MSCs ، لمدة 30 ثانية في حمام مائي 37 درجة مئوية. ثم ، عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، يليه إعداد محلول خلوي بتركيز خمسة في 10 إلى ست خلايا لكل ملليلتر. ثم ، قم بتسمية الخلايا بشكل فلوري عن طريق احتضانها بملليلترين من محلول CFSE 100 ميكرومولار في درجة حرارة الغرفة.بعد 15 دقيقة ، اشطف الخلايا بخمسة ملليلتر من PBS ثلاث مرات قبل تعليقها في وسط ثقافة DMEM طازج بتركيز نهائي يبلغ ثلاثة أضعاف 10 إلى سبع خلايا لكل ملليلتر. مباشرة بعد تحضير الكولاجين I هيدروجيل ، كما هو موضح في المخطوطة ، أضف الخلايا إلى محلول الهيدروجيل بالتركيز المطلوب. ثم ، امزج الخلايا ومحلول الجل مع ماصة دقيقة للحصول على خليط موحد من الهلام الخلوي المائي.بعد ذلك ، قم بتوصيل أحد طرفي القصبة الهوائية داخل المفاعل الحيوي بمضخة حقنة قابلة للبرمجة من خلال موصل luer وتوصيل خمسة ملليلترات من وسط الاستزراع الطازج إلى غرفة المفاعل الحيوي عند 37 درجة مئوية لتغطية السطح الخارجي للقصبة الهوائية. بعد ذلك ، قم بإعطاء 10 ميكرولترات من خليط الخلية والهيدروجيل في القصبة الهوائية غير الظهارية داخل المفاعل الحيوي لتوليد طبقة هيدروجيل خلوية على تجويف القصبة الهوائية. بعد حقن الخلايا، ضع المفاعل الحيوي في حاضنة زراعة الخلايا المعقمة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون للتبلور لمدة 30 دقيقة للسماح بالتبلور.لتصور توزيع الخلايا المزروعة ، قم بتعقيم العدسة الخضراء بكحول الأيزوبروبيل أو الإيثانول بنسبة 70٪ ووضع المفاعل الحيوي على مرحلة التصوير للحصول على الصور ومقاطع الفيديو في كل من أوضاع المجال الساطع والفلورسنت. بعد 30 دقيقة من بذر الخلايا ، قم بغرس ملليلتر واحد من وسط الثقافة في تجويف القصبة الهوائية بمعدل تدفق ملليلتر واحد في الدقيقة. وأخيرا، استزرع القصبة الهوائية المزروعة بالخلية داخل المفاعل الحيوي في حاضنة عند 37 درجة مئوية للوقت المطلوب.أثناء زراعة الخلية، حافظ على الوسائط داخل التجويف ثابتة، في حين أن الوسائط خارج القصبة الهوائية يتم تشغيلها باستمرار عبر تدفق أحادي الاتجاه. في صور المجال الساطع والفلورسنت للقصبة الهوائية غير الظهارية ، لم تلاحظ أي إشارة فلورية قبل وضع علامة CFSE. مع CFSE ، لوحظت إشارة فلورسنت موحدة في جميع أنحاء الظهارة.بعد إزالة الظهارة ، انخفضت كثافة الفلورسنت بشكل كبير ، مما يشير إلى استئصال الظهارة. ويوضح تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين للقصبة الهوائية غير الظهارية إزالة الظهارة الطبقية الزائفة من تجويف القصبة الهوائية، والحفاظ على الخلايا والمصفوفة خارج الخلية، أو الهياكل الدقيقة ECM، في طبقات الأنسجة الأساسية. علاوة على ذلك ، أكد تلطيخ الخماسي والثلاثي الكروم الحفاظ على بنية أنسجة القصبة الهوائية ومكونات ECM ، مثل الكولاجين والبروتين.التألق المناعي للخلايا الظهارية والكولاجين الأول كشف عن إزالة كاملة للظهارة والحفاظ على الكولاجين I داخل الأنسجة دون الظاهرية. أشارت الصور المجهرية الإلكترونية الماسحة إلى أن القصبة الهوائية الأصلية كانت مأهولة بخلايا متعددة الرؤوس والكأس. في القصبة الهوائية غير الظهارية ، تعرض الغشاء السفلي ، كما هو موضح في شبكة شبكية من ألياف المصفوفة خارج الخلية وغياب الخلايا الظهارية.تظهر هنا الصور الفلورية للقصبة الهوائية غير الظهارية ، عند البذر باستخدام PBS والكولاجين. بالمقارنة مع الخلايا التي تم زرعها عبر وسط الاستزراع ، ظلت الخلايا ذات العلامات الفلورية التي يتم تسليمها عبر الهيدروجيل ملتصقة بشكل أكثر اتساقا عبر التجويف. أظهرت دراسة جدوى الخلايا أن قابلية البقاء لم تتأثر بإجراء توصيل الخلايا، وظل أكثر من 90٪ من الخلايا قابلة للحياة.يعد إنشاء طبقة رقيقة من المنظفات في عملية إزالة الظهارة واستخدام الهيدروجيل كوسيلة توصيل للخلايا خطوات أساسية لنجاح هذا البروتوكول. هدفنا البحثي التالي هو زرع خلايا مجرى الهواء الأولية أو الجذعية المزروعة في المختبر على أنسجة مجرى الهواء غير الظهارية للتحقق مما إذا كان يمكن إعداد أنسجة مجرى الهواء الوظيفية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

تصميم مفاعل حيوي ذو محورين الميكانيكية جار للهندسة الأنسجة

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

تشغيل الفوق تفاعلات الاحيائية

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

في المختبر خلية الثقافة نموذج لاستنشاق الفحوصات الكيميائية السامة

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

تكييف عملية Electrospinning لتوفير ثلاث بيئات فريدة من نوعها لثلاثي الطبقات<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج جدار مجرى الهواء

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

جيل من خلايا الفأر مجرى الهواء طلائي المشتقة ESC عن طريق Decellularized الرئة السقالات

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D تجميع المغناطيسي الخلايا الجذعية ومفاعل حيوي النضج لتجديد الغضروف

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

المؤتلف الكولاجين أنا ميكروكاريرس الببتيد لتوسيع الخلية وإمكانية استخدامها كنظام إيصال خلية في مفاعل حيوي نموذج

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

الـ 25: الفيزياء القلبية كما في الأنسجة الحيوية للقلب لدراسة أمراض القلب البشري

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

مفاعل حيوي متعدد التيار للتروية مدمج مع تجزئة المخرج لزراعة الخلايا الديناميكية

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...