Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Denne forskning er delvist støttet af American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation og National Science Foundation (CAREER Award 2143620) til J.K.; og National Institutes of Health (P41 EB027062) til G.V.N.

Nedenstående dyrevævsprotokol er godkendt af dyrevelfærdsretningslinjen og -reglerne fra Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Stevens Institute of Technology, og den overholder National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for brugen af forsøgsdyr.
1. Design og konstruktion af billedstyret rottetrachea bioreaktor
<ol><li>Design og fremstilling af rotteluftrørsbioreaktor<ol>
<li>Opret en computerstøttet designmodel (CAD) af bioreaktorkammeret med...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+the+epithelium+in+chronic+upper+airways+diseases.">Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).</li><li>Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+function+of+airway+tract+epithelium.">Barrier function of airway tract epithelium.</a> Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).</li><li>De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium+dysfunction+in+cystic+fibrosis+and+COPD.">Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD.</a> Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).</li><li>Horani, A., Ferkol, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+genetics+of+primary+ciliary+dyskinesia:+Clinical+implications.">Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications.</a> Chest. 154 (3), 645-652 (2018).</li><li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis.">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).</li><li>Shrestha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-on-a-chip:+the+future+of+respiratory+disease+models+and+pharmacological+studies.">Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).</li><li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro.">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li><li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pulmonary+cystic+fibrosis+in+a+human+lung+airway-on-a-chip.">Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip.</a> Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).</li><li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Gilpin, S. E., Wagner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+lung+scaffolds+to+model+lung+disease+and+tissue+regeneration.">Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration.</a> European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+lungs+for+transplantation.">Bioengineering lungs for transplantation.</a> Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).</li><li>Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+regeneration:+steps+toward+clinical+implementation+and+use.">Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).</li><li>Planchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).</li><li>Coward, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).</li><li>Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+decellularization+using+a+combination+of+chemical,+physical+and+bioreactor+methods.">Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods.</a> The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).</li><li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds.">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

I dette arbejde skabte vi en billeddiagnostisk guidet bioreaktor, der kan muliggøre (i) overvågning af luftrøret lumen in situ efter cellefjernelse og eksogen cellelevering og (ii) langsigtet in vitro-kultur af det cellefrøede luftrørsvæv. Ved hjælp af denne specialbyggede bioreaktor demonstrerede vi (i) selektiv fjernelse af de endogene epitelceller fra luftrørets lumen ved hjælp af vaskemiddel og vibrationsassisteret luftvejsvask og (ii) ensartet fordeling af eksogene celler på luminaloverfl...

Den lysende overflade af luftvejene er foret med et lag af epitel, der hovedsageligt består af multicilierede, klub-, bæger- og basale stamceller 1,2. Epitellaget tjener som en primær forsvarsmekanisme i lungen, der fungerer som en biofysisk barriere, der beskytter det underliggende luftvejsvæv mod indåndede patogener, partikler eller kemiske gasser. Det beskytter luftvejsvævet via flere mekanismer, herunder intercellulær tæt krydsdannelse, mucociliær clearance og antimikrobiel og antioxidantsekretion 3,4. Det defekte luftvejsepitel er forbundet med ødelæggende luftvejssygdomme, såsom kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)5, primær ciliær dyskinesi (PCD)6 og cystisk fibrose (CF)7.
Fremskridt inden for lung-on-chip (LOC) teknologi repræsenterer en mulighed for at studere menneskelig lungeudvikling, modellere forskellige lungesygdomme og udvikle nye terapeutiske materialer i tæt regulerede in vitro-miljøer . For eksempel kan luftvejsepitel og endotel dyrkes på modsatte sider af en tynd, porøs membran for at efterligne gasudvekslingen af lungevæv, hvilket muliggør trofast sygdomsmodellering og lægemiddeltest8. Tilsvarende er der skabt in vitro-sygdomsmodeller til modellering af luftvejssygdomme in vitro, såsom KOL9 og cystisk fibrose10. En stor udfordring ved LOC-enheder er imidlertid at rekapitulere den komplekse tredimensionelle (3D) arkitektur i lungevævet og dynamiske celle-vævsmatrixinteraktioner in vitro11.
For nylig er der udviklet innovative vævstekniske metoder, der muliggør manipulation af ex vivo lungevæv12. Ved hjælp af disse metoder kan denuderede allogene eller xenogene vævstransplantater fremstilles ved at fjerne de endogene celler fra lungevævet via kemiske, fysiske og mekaniske behandlinger13. Derudover giver den bevarede indfødte vævs ekstracellulære matrix (ECM) i de decellulariserede lungestilladser de fysio-mimetiske strukturelle, biokemiske og biomekaniske signaler for implanterede celler til at vedhæfte, proliferere og differentiere14,15.
Her rapporteres et billeddiagnostisk styret bioreaktorsystem skabt ved at kombinere LOC og vævstekniske teknologier for at muliggøre in vitro-vævsmanipulation og dyrkning af udplantet rottetrachealvæv. Ved hjælp af denne luftvejsvævsbioreaktor demonstrerer protokollen selektiv fjernelse af de endogene epitelceller uden at forstyrre de underliggende subepitelcellulære og biokemiske komponenter i luftvejsvævet. Vi viser derefter den homogene fordeling og øjeblikkelige aflejring af de nyligt såede eksogene celler, såsom mesenkymale stamceller (MSC'er), på det denuderede luftvejslumen ved at indgyde det cellebelastede kollagen I pre-gel-opløsning. Derudover udføres visualiseringen af luftrørets lumen under epitelfjernelse og endogen cellelevering ved hjælp af den mikrooptiske billeddannelsesenhed, der er integreret i bioreaktoren. Endvidere er det vist, at luftrøret og nyligt implanterede celler kan dyrkes i bioreaktoren uden mærkbar celledød og vævsnedbrydning i 4 dage. Vi forestiller os, at den billeddannende bioreaktorplatform, den tyndfilmsbaserede de-epithelialiseringsteknik og celleleveringsmetoden, der anvendes i denne undersøgelse, kan være nyttige til generering af luftvejsvæv til in vitro-sygdomsmodellering og lægemiddelscreening.
Bioreaktoren omfatter et rektangulært kammer forbundet til en programmerbar sprøjtepumpe, perfusionspumpe og ventilator til dyrkning af isoleret rottetrachea. Bioreaktoren har indløb og udløb, der er forbundet med luftrøret eller vævskulturkammeret for separat at levere reagenser (f.eks. Kulturmedier) til luftrørets indre og ydre rum (figur 1). Et specialbygget billeddannelsessystem kan bruges til at visualisere det indre af den in vitro-dyrkede rottetrachea på celleniveau (figur 2). Luftrørets endogene epitel fjernes via indånding af en vaskemiddelbaseret decellulariseringsopløsning efterfulgt af vibrationsassisteret luftvejsvask (figur 3). Hydrogelopløsning, såsom type I-kollagen, anvendes som et leveringsmiddel til såning af eksogene celler ensartet og øjeblikkeligt over det denuderede luftrørslumen (figur 4). Alle de materialer, der bruges til at konstruere bioreaktoren og udføre eksperimenterne, findes i materialetabellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

Gentagen skade på luftvejsvæv kan forringe lungefunktionen og forårsage kronisk lungesygdom, såsom kronisk obstruktiv lungesygdom. Fremskridt inden for regenerativ medicin og bioreaktorteknologier giver mulighed for at producere laboratoriedyrkede funktionelle vævs- og organkonstruktioner, der kan bruges til at screene lægemidler, modellere sygdomme og konstruere vævsudskiftninger. Her beskrives en miniaturiseret bioreaktor kombineret med en billeddannelsesmodalitet, der muliggør in situ-visualisering af det indre lumen i eksplanteret rottetrachea under in vitro-vævsmanipulation og -kultur. Ved hjælp af denne bioreaktor demonstrerer protokollen billedstyret selektiv fjernelse af endogene cellulære komponenter, samtidig med at de iboende biokemiske egenskaber og ultrastruktur af luftvejsvævsmatrixen bevares. Desuden vises levering, ensartet fordeling og efterfølgende langvarig dyrkning af eksogene celler på det decellulariserede luftvejslumen med optisk overvågning in situ . Resultaterne fremhæver, at den billeddiagnostiske bioreaktor potentielt kan bruges til at lette dannelsen af funktionelle in vitro-luftvejsvæv .

Den GRIN-linsebaserede in situ-billeddannelsesmodalitet kan muliggøre visualisering af det trakeale indre lumen in situ (figur 5A). Ved hjælp af denne billeddannelsesmetode kan der opnås både lysfelt- og fluorescerende billeder af de indfødte og de-epithelialiserede luftrør (figur 5B,C). Der blev ikke observeret noget fluorescerende signal fra det oprindelige luftrør før CFSE-mærkning (figur 5Bii</...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Protokollen beskriver en billeddannelsesaktiveret bioreaktor, der muliggør selektiv fjernelse af det endogene epitel fra rotteluftrøret og homogen fordeling af eksogene celler på lumenoverfladen efterfulgt af langvarig in vitro-kultur af cellevævskonstruktionen.

Billeddirigeret bioreaktor til generering af biomanirigeret luftvejsvæv

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Denne protokol tillader in vitro-dyrkning og direkte mikroskopisk visualisering af det isolerede luftvejsvæv under forskellige vævsmanipulationsprocedurer, såsom deepitelisering og regenerering af luftvejsvæv. Den in situ-billeddannelse, der foreslås i denne undersøgelse, muliggør hurtig og ikke-destruktiv overvågning af trakeal lumen under billeddannelsesstyret kontrolleret fjernelse af det endogene epitel og levering af de eksogene celler. Den billeddiagnostiske bioreaktive platform og vævsmanipulationsprotokollerne kan bruges til at generere biomanirigeret luftvejsvæv til sygdomsmodellering og lægemiddelscreening.Konstruktionen og brugen af den billeddannende luftvejsvævsbioreaktor vil blive demonstreret af to ph.d.-studerende fra vores forskningsgruppe, Mohammad Mir og Jiawen Chen. For at begynde at oprette in situ-billeddannelsesenhed skal du indsætte en rørlinse i et stabelbart linserør og fastgøre det ved hjælp af en holdering. Monter derefter objektivbordsenheden på et videnskabeligt CMOS-kamera via en C-mount-adapter.Brug Micromanager-software til at betjene kameraet og hente fotos og videoer. Mens du sigter mod et objekt, der er placeret 10 meter fra kameraet, skal du justere afstanden mellem rørlinsen og kameraets billedsensor, indtil der dannes et fokuseret billede af objektet på computerskærmen. Brug derefter optiske bursystemkomponenter, såsom monteringsstang, gevindburplade og burkube til at montere en filterlinse på en dobbeltkant, superopløsning, dikroisk spejl og en laser til enheden.Tilslut et 20X objektivobjektiv til enheden. Monter derefter en grøn linse med en diameter på 500 mikrometer i den distale ende af linserøret via X-Y-oversætteren. Juster afstanden mellem de grønne og objektive objektiver for at danne de fokuserede mikroskopiske billeder.For at visualisere det isolerede rotte luftrør lumen i lysfelt eller fluorescerende, skal du placere bioreaktoren på billeddannelsestrinnet. Derefter tilføres 500 mikroliter af den frisklavede carboxyfluorescein succinimidylester eller CFSE-opløsning med en strømningshastighed på fem ml pr. Minut gennem luftrøret via sprøjtepumpen, der er forbundet med slangen i luftrørskyl kanylen. Når CFSE-opløsningen fylder luftrøret, skal du stoppe pumpen.Efter 10 minutter vaskes luftrørets lumen ved at infundere 10 ml PBS ved hjælp af sprøjtepumpen for at fjerne de resterende ikke-inkorporerede CFSE-reagenser. Efter vasken skal du indsætte den distale billeddannelsesende af den grønne linse i luftrøret via luerstikket, der er fastgjort til den ene ende af luftrøret. Flyt derefter forsigtigt den grønne linse inde i luftrøret, indtil luftrørets overflade er fokuseret.For at fange lysfeltbillederne i mikrostyringssoftwaren skal du belyse luftrørets lumen med hvidt lys gennem burkuben. Klik derefter på Live-ikonet for at vise luftrørets lumenale overflade i realtid. Brug fanerne Billedbehandling og Eksponering til at ændre eksponeringstiden til den ønskede værdi.Hvis du vil justere kontrasten og lysstyrken i billeder, skal du bruge histogrammet og intensitetsskaleringsvinduet til at flytte sort-hvide pile i slutpunktet på det interaktive histogramdisplay. Klik på Stop Live for at aktivere Snap-ikonet, og klik derefter på Snap ikon for at fryse billedet. Brug derefter indstillingen Eksporter derefter Billeder som forskudte faner til at gemme billederne i det ønskede format.For at få fotos og videoer i fluorescerende tilstand skal du belyse luftrørets lumen med CFSE-specifikt laserlys gennem burkuben og erhverve billederne i realtid ved at flytte billedsonden frem og tilbage. Når fotos og videoer er opnået, skal du forsigtigt fjerne den grønne linse fra luftrøret. Til de-epithelialisering af luftrøret skal du indgyde 50 mikroliter af det frisklavede 2% natriumdodecylsulfat gennem luftrørskrylen for at generere en tynd film af vaskemiddelopløsningen på luftrørets lumen.Efter indåndingen skal du lukke bioreaktorens slangeforbindelser ved hjælp af mandlige eller kvindelige luerpropper og overføre bioreaktoren til en 37 grader Celsius inkubator i 10 minutter for at lade SDS bo i luftrøret. Gentag indåndingen en gang. Efter den anden indånding fjernes det lyserede epitel og SDS ved vanding af luftrørets lumen tre gange med 500 mikroliter PBS via sprøjtepumpe med en strømningshastighed på 10 ml pr. Minut.Anbring derefter bioreaktoren på en ryster for mekanisk at vibrere med en frekvens på 20 Hertz og en forskydningsamplitude på 0,3 millimeter for fysisk at fremme løsrivelse af SDS-behandlede epitelceller fra luftrørets lumen. Mens luftrøret vibreteres mekanisk, skal du indgyde 500 mikroliter PBS to gange gennem luftrørets lumen for at fjerne det resterende SDS og celleaffald. Efter epitelfjernelsen skal du evaluere epitellagets clearance ved at måle intensiteten af CFSE ved hjælp af den grønne linsebilleddannelsesenhed.Efter tilberedning af en de-epithelialiseret rotte luftrør, optø frosne mesenkymale stamceller eller MSC'er i 30 sekunder i et 37 grader Celsius vandbad. Tæl derefter cellerne med et hæmocytometer efterfulgt af fremstilling af en celleopløsning med en koncentration på fem gange 10 til de seks celler pr. Milliliter. Mærk derefter cellerne fluorescerende ved at inkubere dem med to milliliter 100 mikromolær CFSE-opløsning ved stuetemperatur.Efter 15 minutter skylles cellerne med fem milliliter PBS tre gange, før de genoplives i et frisk DMEM-dyrkningsmedium i en endelig koncentration på tre gange 10 til de syv celler pr. Milliliter. Umiddelbart efter fremstillingen af kollagen I hydrogel, som beskrevet i manuskriptet, tilsættes cellerne til hydrogelopløsningen med den ønskede koncentration. Bland derefter cellerne og gelopløsningen med en mikropipette for at opnå en ensartet celle-hydrogelblanding.Fastgør derefter den ene ende af luftrøret i bioreaktoren til en programmerbar sprøjtepumpe gennem et luerstik og levér fem milliliter friskkulturmedium ind i bioreaktorkammeret ved 37 grader Celsius for at dække luftrørets udvendige overflade. Derefter administreres 10 mikroliter bolus af celle-hydrogelblandingen i det de-epithelialiserede luftrør i bioreaktoren for at generere et cellehydrogellag på luftrørets lumen. Efter celleinjektion anbringes bioreaktoren i en steril cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid til gelering i 30 minutter for at tillade gelering.For at visualisere fordelingen af implanterede celler skal du sterilisere den grønne linse med 70% isopropylalkohol eller ethanol og placere bioreaktoren på billeddannelsestrinnet for at få fotos og videoer i både lysfelt og fluorescerende tilstande. Efter 30 minutters cellesåning tilføres en milliliter dyrkningsmedium i luftrøret lumen med en strømningshastighed på en milliliter pr. Minut. Endelig dyrkes det cellefrøede luftrør i bioreaktoren i en inkubator ved 37 grader Celsius i den ønskede tid.Under cellekulturen skal du holde medierne inde i lumen statiske, mens medier uden for luftrøret kontinuerligt perfunderes via en ensrettet strømning. I lysfelt- og fluorescerende billeder af det de-epithelialiserede luftrør blev der ikke observeret noget fluorescerende signal før CFSE-mærkningen. Med CFSE blev der observeret et ensartet fluorescerende signal i hele epitelet.Efter de-epithelialisering blev fluorescerende intensitet reduceret signifikant, hvilket indikerer ablation af epitelet. Hæmatoxylin- og eosinfarvningen af det de-epithelialiserede luftrør illustrerede fjernelsen af det pseudostratificerede epitel fra luftrørets lumen og bevarelsen af celler og ekstracellulær matrix eller ECM-mikrostrukturer i underliggende vævslag. Desuden bekræftede pentakrom og trikromfarvning vedligeholdelsen af luftrørsvævsarkitektur og ECM-komponenter, såsom kollagen og proteoglycaner.Immunofluorescensen af epitelceller og kollagen I afslørede fuldstændig fjernelse af epitelet og konservering af kollagen I i underepitelvævet. Scanningselektronmikrograferne viste, at det oprindelige luftrør var befolket med multicillierede og bægerceller. I det de-epithelialiserede luftrør blev kældermembranen udsat, som angivet af et maskenetværk af ekstracellulære matrixfibre og fraværet af epitelceller.Fluorescensbillederne af det de-epithelialiserede luftrør, ved såning med PBS og kollagen, er vist her. Sammenlignet med de celler, der blev podet via dyrkningsmedium, forblev de fluorescerende mærkede celler, der blev leveret via hydrogel, klæbet mere ensartet over lumen. Cellelevedygtighedsundersøgelsen viste, at levedygtigheden ikke blev påvirket af celleleveringsproceduren, og over 90% af cellerne forblev levedygtige.Oprettelse af en tynd film af vaskemiddel i de-epiteliseringsprocessen og brug af hydrogel som et leveringsmiddel til celler er vigtige trin for succesen med denne protokol. Vores næste forskningsmål er at implantere laboratoriedyrkede luftveje primær eller stamcelle på det de-epithelialiserede luftvejsvæv for at undersøge, om funktionelt luftvejsvæv kan fremstilles.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Design af en Biaksial Mekanisk Loading bioreaktor for Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Drift af Benchtops bioreaktor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro-cellekultur Model for Toxic Inhaleret Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tilpasning af Electrospinning proces med at give tre unikke miljøer for en Tri-lags<em&gt; In vitro</em&gt; Model af Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generation af ESC-afledt Mouse Airway epitelceller Brug decellulariserede Lung Stilladser

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetisk Stem Cell Aggregering og bioreaktor Modning til Brusk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Rekombinant kollagen I peptid Microcarriers for celle ekspansion og deres potentielle anvendelse som celle levering System i en bioreaktor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Cardiac Sfæroider som in vitro Bioengineered hjertevæv at studere Human Heart Patofysiologi

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integreret med Udløbsfraktionering til dynamisk cellekultur

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...