Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Dit onderzoek is gedeeltelijk ondersteund door het American Thoracic Society Foundation Research Program, de New Jersey Health Foundation en de National Science Foundation (CAREER Award 2143620) aan J.K.; en de National Institutes of Health (P41 EB027062) aan G.V.N.

Het onderstaande dierweefselprotocol is goedgekeurd door de dierenwelzijnsrichtlijn en -voorschriften van het Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Stevens Institute of Technology en voldoet aan de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH) voor het gebruik van proefdieren.
1. Ontwerp en bouw van beeldvormingsgeleide rattenluchtpijpbioreactor
<ol><li>Ontwerpen en fabriceren van ratten luchtpijp bioreactor<ol>
<li>Maak een CAD-model (computer...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+the+epithelium+in+chronic+upper+airways+diseases.">Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).</li><li>Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+function+of+airway+tract+epithelium.">Barrier function of airway tract epithelium.</a> Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).</li><li>De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium+dysfunction+in+cystic+fibrosis+and+COPD.">Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD.</a> Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).</li><li>Horani, A., Ferkol, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+genetics+of+primary+ciliary+dyskinesia:+Clinical+implications.">Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications.</a> Chest. 154 (3), 645-652 (2018).</li><li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis.">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).</li><li>Shrestha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-on-a-chip:+the+future+of+respiratory+disease+models+and+pharmacological+studies.">Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).</li><li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro.">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li><li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pulmonary+cystic+fibrosis+in+a+human+lung+airway-on-a-chip.">Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip.</a> Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).</li><li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Gilpin, S. E., Wagner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+lung+scaffolds+to+model+lung+disease+and+tissue+regeneration.">Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration.</a> European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+lungs+for+transplantation.">Bioengineering lungs for transplantation.</a> Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).</li><li>Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+regeneration:+steps+toward+clinical+implementation+and+use.">Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).</li><li>Planchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).</li><li>Coward, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).</li><li>Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+decellularization+using+a+combination+of+chemical,+physical+and+bioreactor+methods.">Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods.</a> The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).</li><li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds.">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

In dit werk creëerden we een beeldvormingsgeleide bioreactor die (i) monitoring van het luchtpijplumen in situ mogelijk maakt na de celverwijdering en exogene celafgifte en (ii) langdurige in vitro kweek van het celgezaaide luchtpijpweefsel. Met behulp van deze op maat gemaakte bioreactor demonstreerden we (i) selectieve verwijdering van de endogene epitheelcellen uit het luchtpijplumen met behulp van detergent en trillingsondersteunde luchtwegwas en (ii) uniforme verdeling van exogene cellen op het lu...

Het luminale oppervlak van de luchtwegen wordt bekleed door een laag epitheel dat voornamelijk bestaat uit multiciliated, club, goblet en basale stamcellen 1,2. De epitheellaag dient als een primair afweermechanisme van de long en fungeert als een biofysische barrière die het onderliggende luchtwegweefsel beschermt tegen ingeademde pathogenen, deeltjes of chemische gassen. Het beschermt het luchtwegweefsel via meerdere mechanismen, waaronder intercellulaire tight junction-vorming, mucociliaire klaring en antimicrobiële en antioxiderende secretie 3,4. Het defecte luchtwegepitheel wordt geassocieerd met verwoestende aandoeningen van de luchtwegen, zoals chronische obstructieve longziekte (COPD)5, primaire ciliaire dyskinesie (PCD)6 en cystische fibrose (CF)7.
Vooruitgang in lung-on-chip (LOC) -technologie biedt een kans om de ontwikkeling van menselijke longen te bestuderen, verschillende longziekten te modelleren en nieuwe therapeutische materialen te ontwikkelen in strak gereguleerde in vitro omgevingen. Luchtwegepitheel en endotheel kunnen bijvoorbeeld aan weerszijden van een dun, poreus membraan worden gekweekt om het gas na te bootsen dat longweefsel uitwisselt, waardoor getrouwe ziektemodellering en drugstestsmogelijk zijn 8. Evenzo zijn in vitro ziektemodellen gemaakt om luchtwegaandoeningen in vitro te modelleren, zoals COPD9 en cystic fibrosis10. Een grote uitdaging van LOC-apparaten is echter het samenvatten van de complexe driedimensionale (3D) architectuur van het longweefsel en dynamische cel-weefselmatrixinteracties in vitro11.
Onlangs zijn innovatieve tissue engineering-methodologieën ontwikkeld die manipulatie van ex vivo longweefselsmogelijk maken 12. Met behulp van deze methoden kunnen gedenudeerde allogene of xenogene weefseltransplantaten worden bereid door de endogene cellen uit het longweefsel te verwijderen via chemische, fysische en mechanische behandelingen13. Bovendien biedt de bewaarde inheemse weefsel extracellulaire matrix (ECM) in de gedecellulariseerde longsteigers de fysio-mimetische structurele, biochemische en biomechanische signalen voor geïmplanteerde cellen om zich te hechten, te prolifereren en te differentiëren14,15.
Hier wordt een beeldvormingsgestuurd bioreactorsysteem gerapporteerd dat is gemaakt door LOC- en tissue engineering-technologieën te combineren om in vitro weefselmanipulatie en kweek van geëxplanteerde tracheale weefsels van ratten mogelijk te maken. Met behulp van deze luchtwegweefselbioreactor toont het protocol selectieve verwijdering van de endogene epitheelcellen zonder de onderliggende subepitheliale cellulaire en biochemische componenten van het luchtwegweefsel te verstoren. Vervolgens tonen we de homogene verdeling en onmiddellijke afzetting van de nieuw gezaaide exogene cellen, zoals mesenchymale stamcellen (MSC's), op het ontslankte luchtweglumen door de celbelaste collageen I pre-gel-oplossing in te brengen. Bovendien wordt door gebruik te maken van het micro-optische beeldvormingsapparaat dat in de bioreactor is geïntegreerd, ook de visualisatie van het luchtpijplumen tijdens epitheelverwijdering en endogene celafgifte gedaan. Verder wordt aangetoond dat de luchtpijp en nieuw geïmplanteerde cellen gedurende 4 dagen in de bioreactor kunnen worden gekweekt zonder merkbare celdood en weefselafbraak. We stellen ons voor dat het op beeldvorming gebaseerde bioreactorplatform, de op dunne film gebaseerde de-epithelisatietechniek en de celafgiftemethode die in deze studie wordt gebruikt, nuttig kunnen zijn voor het genereren van luchtwegweefsels voor in vitro ziektemodellering en screening van geneesmiddelen.
De bioreactor bevat een rechthoekige kamer die is aangesloten op een programmeerbare spuitpomp, perfusiepomp en ventilator voor het kweken van geïsoleerde rattenluchtpijp. De bioreactor beschikt over in- en uitgangen die zijn aangesloten op de luchtpijp of de weefselkweekkamer om reagentia (bijv. kweekmedia) afzonderlijk te leveren aan de interne en externe ruimtes van de luchtpijp (figuur 1). Een op maat gemaakt beeldvormingssysteem kan worden gebruikt om het inwendige van de in vitro gekweekte rattentrui op cellulair niveau te visualiseren (figuur 2). Het endogene epitheel van de luchtpijp wordt verwijderd via de instillatie van een op detergenten gebaseerde decellularisatieoplossing gevolgd door trillingsondersteund luchtwegwassen (figuur 3). Hydrogel-oplossing, zoals type I collageen, wordt gebruikt als een leveringsvoertuig voor het zaaien van exogene cellen uniform en onmiddellijk over het ontnuchterde luchtpijplumen (figuur 4). Alle materialen die zijn gebruikt om de bioreactor te bouwen en de experimenten uit te voeren, zijn opgenomen in de tabel met materialen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

Herhaaldelijk letsel aan luchtwegweefsel kan de longfunctie aantasten en chronische longziekte veroorzaken, zoals chronische obstructieve longziekte. Vooruitgang in regeneratieve geneeskunde en bioreactortechnologieën bieden mogelijkheden om in het laboratorium gekweekte functionele weefsel- en orgaanconstructies te produceren die kunnen worden gebruikt om geneesmiddelen te screenen, ziekten te modelleren en weefselvervangingen te manipuleren. Hier wordt een geminiaturiseerde bioreactor in combinatie met een beeldvormingsmodaliteit beschreven die in situ visualisatie van het binnenste lumen van geëxplanteerde rattenluchtpijp mogelijk maakt tijdens in vitro weefselmanipulatie en -kweek. Met behulp van deze bioreactor demonstreert het protocol beeldgeleide selectieve verwijdering van endogene cellulaire componenten met behoud van de intrinsieke biochemische kenmerken en ultrastructuur van de luchtwegweefselmatrix. Verder worden de levering, uniforme verdeling en daaropvolgende langdurige kweek van exogene cellen op het gedecellulariseerde luchtweglumen met optische monitoring in situ getoond. De resultaten benadrukken dat de beeldvormingsgeleide bioreactor mogelijk kan worden gebruikt om de generatie van functionele in vitro luchtwegweefsels te vergemakkelijken.

De op de GRIN-lens gebaseerde in-situ beeldvormingsmodaliteit kan visualisatie van het tracheale binnenlumen in situ mogelijk maken (figuur 5A). Met behulp van deze beeldvormingsmethode kunnen zowel heldere veld- als fluorescerende beelden van de inheemse en gede-epithelialiseerde trachea's worden verkregen (figuur 5B, C). Er werd geen fluorescerend signaal waargenomen van de inheemse luchtpijp voorafgaand aan CFSE-etikettering...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Het protocol beschrijft een beeldvormingsgerichte bioreactor die de selectieve verwijdering van het endogene epitheel uit de rattenluchtpijp en homogene verdeling van exogene cellen op het lumenoppervlak mogelijk maakt, gevolgd door langdurige in vitro kweek van het celweefselconstruct.

Imaging-guided bioreactor voor het genereren van bio-technisch luchtwegweefsel

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Dit protocol maakt in vitro kweek en directe microscopische visualisatie van de geïsoleerde luchtwegweefsels mogelijk tijdens verschillende weefselmanipulatieprocedures, zoals de-epithelisatie en regeneratie van luchtwegweefsel. De in situ beeldvorming voorgesteld in deze studie maakt snelle en niet-destructieve monitoring van het tracheale lumen mogelijk tijdens beeldvormingsgeleide gecontroleerde verwijdering van het endogene epitheel en levering van de exogene cellen. Het beeldvormingsgestuurde bioreactieve platform en de weefselmanipulatieprotocollen kunnen worden gebruikt om bio-ingenieur luchtwegweefsel te genereren voor ziektemodellering en geneesmiddelenscreening.De constructie en het gebruik van de beeldvormingsgerichte luchtwegweefselbioreactor zal worden gedemonstreerd door twee promovendi van onze onderzoeksgroep, Mohammad Mir en Jiawen Chen. Om te beginnen met het maken van een in-situ beeldvormingsapparaat, plaatst u een buislens in een stapelbare lensbuis en bevestigt u deze met een bevestigingsring. Monteer vervolgens de lenstafelassemblage op een wetenschappelijke CMOS-camera via een C-mount adapter.Gebruik Micromanager-software om de camera te bedienen en foto's en video's te verkrijgen. Terwijl u mikt op een object op 10 meter van de camera, past u de afstand tussen de buislens en de beeldsensor van de camera aan totdat een scherp beeld van het object op het computerscherm wordt gevormd. Gebruik vervolgens optische kooisysteemcomponenten, zoals montagestang, kooiplaat met schroefdraad en kooikubus om een filterlens op een dubbele rand, superresolutie, dichroïsche spiegel en een laser op het apparaat te monteren.Sluit een objectieflens van 20x aan op het apparaat. Monteer vervolgens een groene lens met een diameter van 500 micrometer aan het distale uiteinde van de lensbuis via de X-Y-vertaler. Pas de afstand tussen de groene en de objectieve lenzen aan om de scherpgestelde microscopische beelden te vormen.Om het lumen van de geïsoleerde rattenpijp in helder veld of fluorescerend te visualiseren, plaatst u de bioreactor op het beeldvormingsstadium. Injecteer vervolgens 500 microliter van de vers bereide carboxyfluoresceïne succinimidylester, of CFSE-oplossing, met een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut door de luchtpijp via de spuitpomp die is aangesloten op de slang van de luchtpijpcanule. Zodra de CFSE-oplossing de luchtpijp vult, stopt u de pomp.Was na 10 minuten het luchtpijplumen door 10 milliliter PBS toe te dienen met behulp van de spuitpomp om de resterende niet-geïncorporeerde CFSE-reagentia te verwijderen. Breng na de wasbeurt het distale beelduiteinde van de groene lens in de luchtpijp via de luerconnector die aan het ene uiteinde van de luchtpijp is bevestigd. Beweeg vervolgens voorzichtig de groene lens in de luchtpijp totdat het luchtpijpoppervlak is scherpgesteld.Om de heldere veldbeelden in de micromanager-software vast te leggen, verlicht u het luchtpijplumen met wit licht door de kooikubus. Klik vervolgens op het live-pictogram om het lumenoppervlak van de luchtpijp in realtime weer te geven. Gebruik de tabbladen Imaging-instelling en Belichting om de belichtingstijd te wijzigen in de gewenste waarde.Als u het contrast en de helderheid van afbeeldingen wilt aanpassen, gebruikt u het diagram- en intensiteitsschaalvenster om zwart-witpijlen op het eindpunt van de interactieve histogramweergave te verplaatsen. Klik op Live stoppen om het Snap-pictogram te activeren en klik vervolgens op het Snap-pictogram om de afbeelding te bevriezen. Gebruik vervolgens de instelling Exporteren en vervolgens Afbeeldingen als verplaatste tabbladen om de afbeeldingen in het gewenste formaat op te slaan.Om foto's en video's in een fluorescerende modus te verkrijgen, verlicht u het luchtpijplumen met CFSE-specifiek laserlicht door de kooikubus en verkrijgt u de beelden in realtime door de beeldvormingsonde heen en weer te bewegen. Zodra de foto's en video's zijn verkregen, verwijdert u voorzichtig de groene lens uit de luchtpijp. Voor de de-epithelisatie van de luchtpijp, instilleer 50 microliter van het vers bereide 2% natriumdodecylsulfaat door de trachea canule om een dunne film van de wasmiddeloplossing op het luchtpijplumen te genereren.Sluit na de instillatie de buisverbindingen van de bioreactor met behulp van mannelijke of vrouwelijke luerpluggen en breng de bioreactor gedurende 10 minuten over naar een incubator van 37 graden Celsius om het SDS in de luchtpijp te laten wonen. Herhaal de instillatie één keer. Verwijder na de tweede instillatie het gelyseerde epitheel en SDS door het luchtpijplumen driemaal te irrigeren met 500 microliter PBS via een spuitpomp met een debiet van 10 milliliter per minuut.Plaats vervolgens de bioreactor op een shaker om mechanisch te trillen met een frequentie van 20 Hertz en een verplaatsingsamplitude van 0,3 millimeter om fysiek loslating van met SDS behandelde epitheelcellen uit het luchtpijplumen te bevorderen. Terwijl de luchtpijp mechanisch wordt getrild, indruppel 500 microliter PBS tweemaal door het luchtpijplumen om de resterende SDS en celresten te verwijderen. Evalueer na de verwijdering van het epitheel de klaring van de epitheellaag door de intensiteit van de CVSE te meten met behulp van het beeldvormingsapparaat met groene lens.Na het bereiden van een gede-epithelialiseerde rattenluchtpijp, ontdooi bevroren mesenchymale stamcellen, of MSC's, gedurende 30 seconden in een waterbad van 37 graden Celsius. Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer, gevolgd door het bereiden van een celoplossing met een concentratie van vijf keer 10 tot de zes cellen per milliliter. Label vervolgens de cellen fluorescerend door ze te incuberen met twee milliliter 100-micromolaire CFSE-oplossing bij kamertemperatuur.Spoel de cellen na 15 minuten driemaal met vijf milliliter PBS voordat u ze opnieuw opschordt in een vers DMEM-kweekmedium in een eindconcentratie van driemaal 10 tot de zeven cellen per milliliter. Onmiddellijk na de bereiding van collageen I hydrogel, zoals beschreven in het manuscript, voeg de cellen toe aan de hydrogel-oplossing met de gewenste concentratie. Meng vervolgens de cellen en geloplossing met een micropipette om een uniform cel-hydrogelmengsel te verkrijgen.Bevestig vervolgens het ene uiteinde van de luchtpijp in de bioreactor aan een programmeerbare spuitpomp via een luerconnector en lever vijf milliliter vers kweekmedium in de bioreactorkamer bij 37 graden Celsius om het buitenoppervlak van de luchtpijp te bedekken. Dien vervolgens 10 microliter bolus van het cel-hydrogelmengsel toe aan de gede-epitheelvormige luchtpijp in de bioreactor om een cel-hydrogellaag op het luchtpijplumen te genereren. Plaats de bioreactor na celinjectie in een steriele celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor gellation gedurende 30 minuten om gelatie mogelijk te maken.Om de verdeling van geïmplanteerde cellen te visualiseren, steriliseert u de groene lens met 70% isopropylalcohol of ethanol en plaatst u de bioreactor op het beeldvormingsstadium om de foto's en video's in zowel heldere veld- als fluorescerende modi te verkrijgen. Na 30 minuten celzaaien, infundeer een milliliter kweekmedium in het luchtpijplumen met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Kweek ten slotte de celgezaaide luchtpijp in de bioreactor in een incubator op 37 graden Celsius gedurende de gewenste tijd.Houd tijdens de celkweek de media in het lumen statisch, terwijl media buiten de luchtpijp continu worden doordrenkt via een unidirectionele stroom. In de heldere veld- en fluorescerende beelden van de gede-epitheliseerde luchtpijp werd geen fluorescerend signaal waargenomen voorafgaand aan de CFSE-etikettering. Bij de CVSE werd een uniform fluorescerend signaal waargenomen in het hele epitheel.Na de-epithelisatie was de fluorescerende intensiteit aanzienlijk afgenomen, wat wijst op ablatie van het epitheel. De hematoxyline- en eosinekleuring van de gede-epithelialiseerde luchtpijp illustreerde de verwijdering van het pseudo-gestratificeerde epitheel uit het luchtpijplumen en het behoud van cellen en extracellulaire matrix, of ECM-microstructuren, in onderliggende weefsellagen. Bovendien bevestigden de pentachrome en trichrome kleuring het behoud van luchtpijpweefselarchitectuur en ECM-componenten, zoals collageen en proteoglycanen.De immunofluorescentie van epitheelcellen en collageen I onthulde volledige verwijdering van het epitheel en behoud van collageen I in het subepitheelweefsel. De scanning elektronenmicrofoto's gaven aan dat de inheemse luchtpijp bevolkt was met multicilliated en goblet cellen. In de gede-epitheliseerde luchtpijp werd het keldermembraan blootgesteld, zoals aangegeven door een mesh-netwerk van extracellulaire matrixvezels en de afwezigheid van epitheelcellen.De fluorescentiebeelden van de gede-epithelialiseerde luchtpijp, bij het zaaien met PBS en collageen, worden hier getoond. Vergeleken met de cellen die via kweekmedium werden gezaaid, bleven de fluorescerend gelabelde cellen die via hydrogel werden afgeleverd gelijkmatiger over het lumen kleven. De cel levensvatbaarheidsstudie toonde aan dat de levensvatbaarheid niet werd beïnvloed door de celafgifteprocedure en dat meer dan 90% van de cellen levensvatbaar bleef.Het creëren van een dunne film van wasmiddel in het de-epithelisatieproces en het gebruik van hydrogel als een leveringsvoertuig voor cellen zijn essentiële stappen voor het succes van dit protocol. Ons volgende onderzoeksdoel is om in het laboratorium gekweekte luchtweg primaire of stamcel te implanteren op het gede-epithelialiseerde luchtwegweefsel om te onderzoeken of functioneel luchtwegweefsel kan worden voorbereid.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Ontwerp van een tweeassige Mechanische belasting Bioreactor voor Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Exploitatie van een tafelmodel Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro celcultuurmodel voor Toxic Geïnhaleerd chemische testen

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Aanpassing van de elektrospinproces te bieden drie unieke omgevingen voor een Tri-layered<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de Airway Muur

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Cardiale Sferoïden als in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Multi-Stream Perfusion Bioreactor geïntegreerd met Outlet Fractionation voor dynamische celcultuur

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...