Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue en partie par l’American Thoracic Society Foundation Research Program, la New Jersey Health Foundation et la National Science Foundation (CAREER Award 2143620) à J.K.; et les National Institutes of Health (P41 EB027062) à G.V.N.

Le protocole sur les tissus animaux ci-dessous a été approuvé par les lignes directrices et les règlements sur le bien-être animal de l’Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) du Stevens Institute of Technology, et il est conforme aux directives des National Institutes of Health (NIH) pour l’utilisation d’animaux de laboratoire.
1. Conception et construction d’un bioréacteur de trachée de rat guidé par imagerie
<ol><li>Conception et fabrication d?...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

Dans ce travail, nous avons créé un bioréacteur guidé par imagerie qui peut permettre (i) la surveillance de la lumière de la trachée in situ après l’élimination cellulaire et l’administration cellulaire exogène et (ii) la culture in vitro à long terme du tissu trachéal ensemencé cellulaire. À l’aide de ce bioréacteur sur mesure, nous avons démontré (i) l’élimination sélective des cellules épithéliales endogènes de la lumière de la trachée à l’aide d’un détergent et ...

La surface luminale des voies respiratoires est tapissée d’une couche d’épithélium qui se compose principalement de cellules souches multiciliées, en massue, en gobelet et basales 1,2. La couche épithéliale sert de mécanisme de défense primaire du poumon, agissant comme une barrière biophysique qui protège le tissu sous-jacent des voies respiratoires contre les agents pathogènes inhalés, les particules ou les gaz chimiques. Il protège le tissu des voies respiratoires par de multiples mécanismes, y compris la formation de jonctions étroites intercellulaires, la clairance mucociliaire et la sécrétion d’antimicrobiens et d’antioxydants 3,4. L’épithélium défectueux des voies respiratoires est associé à des maladies respiratoires dévastatrices, telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)5, la dyskinésie ciliaire primaire (PCD)6 et la fibrose kystique (FK)7.
Les progrès de la technologie des poumons sur puce (LOC) représentent une occasion d’étudier le développement pulmonaire humain, de modéliser diverses maladies pulmonaires et de développer de nouveaux matériaux thérapeutiques dans des environnements in vitro étroitement réglementés. Par exemple, l’épithélium et l’endothélium des voies respiratoires peuvent être cultivés sur les côtés opposés d’une membrane mince et poreuse pour imiter le tissu pulmonaire échangeant du gaz, ce qui permet une modélisation fidèle de la maladie et des tests demédicaments 8. De même, des modèles de maladies in vitro ont été créés pour modéliser les maladies des voies respiratoires in vitro, telles que la MPOC9 et la fibrose kystique10. Cependant, un défi majeur des dispositifs LOC est de récapituler l’architecture tridimensionnelle complexe (3D) du tissu pulmonaire et les interactions dynamiques de la matrice cellulaire-tissulaire in vitro11.
Récemment, des méthodologies innovantes d’ingénierie tissulaire ont été développées qui permettent la manipulation des tissus pulmonaires ex vivo 12. À l’aide de ces méthodologies, des greffes de tissus allogéniques ou xénogéniques dénudés peuvent être préparées en éliminant les cellules endogènes du tissu pulmonaire par des traitements chimiques, physiques et mécaniques13. En outre, la matrice extracellulaire (ECM) tissulaire native préservée dans les échafaudages pulmonaires décellularisés fournit les indices structurels, biochimiques et biomécaniques physio-mimétiques permettant aux cellules implantées de se fixer, de proliférer et de se différencier14,15.
Ici, un système de bioréacteur guidé par imagerie créé en combinant les technologies LOC et d’ingénierie tissulaire pour permettre la manipulation tissulaire in vitro et la culture de tissus trachéaux de rat explantés est rapporté. À l’aide de ce bioréacteur tissulaire des voies respiratoires, le protocole démontre l’élimination sélective des cellules épithéliales endogènes sans perturber les composants cellulaires et biochimiques sous-épithéliaux sous-jacents du tissu des voies respiratoires. Nous montrons ensuite la distribution homogène et le dépôt instantané des cellules exogènes nouvellement ensemencées, telles que les cellules souches mésenchymateuses (CSM), sur la lumière des voies respiratoires dénudées en instillant la solution de pré-gel de collagène I chargée de cellules. De plus, en utilisant le dispositif d’imagerie micro-optique intégré dans le bioréacteur, la visualisation de la lumière de la trachée lors de l’élimination de l’épithélium et de la livraison de cellules endogènes est également effectuée. En outre, il est démontré que la trachée et les cellules nouvellement implantées peuvent être cultivées dans le bioréacteur sans mort cellulaire notable et dégradation des tissus pendant 4 jours. Nous envisageons que la plate-forme de bioréacteur basée sur l’imagerie, la technique de désépithélialisation à base de couches minces et la méthode d’administration cellulaire utilisée dans cette étude peuvent être utiles pour générer des tissus des voies respiratoires pour la modélisation in vitro de la maladie et le dépistage des médicaments.
Le bioréacteur comprend une chambre rectangulaire reliée à une pompe à seringue programmable, une pompe de perfusion et un ventilateur pour la culture de la trachée isolée du rat. Le bioréacteur comporte des entrées et des sorties reliées à la trachée ou à la chambre de culture tissulaire pour fournir séparément des réactifs (p. ex. milieux de culture) aux espaces internes et externes de la trachée (figure 1). Un système d’imagerie sur mesure peut être utilisé pour visualiser l’intérieur de la trachée de rat cultivée in vitro au niveau cellulaire (Figure 2). L’épithélium endogène de la trachée est éliminé par instillation d’une solution de décellularisation à base de détergent suivie d’un lavage des voies respiratoires assisté par vibration (Figure 3). La solution d’hydrogel, telle que le collagène de type I, est utilisée comme vecteur pour l’ensemencement uniforme et instantané des cellules exogènes à travers la lumière de la trachée dénudée (Figure 4). Tous les matériaux utilisés pour construire le bioréacteur et mener les expériences sont fournis dans la table des matériaux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

Les lésions répétées des tissus des voies respiratoires peuvent altérer la fonction pulmonaire et causer des maladies pulmonaires chroniques, comme la maladie pulmonaire obstructive chronique. Les progrès de la médecine régénérative et des technologies de bioréacteur offrent des possibilités de produire des tissus fonctionnels et des organes cultivés en laboratoire qui peuvent être utilisés pour dépister des médicaments, modéliser des maladies et concevoir des remplacements tissulaires. Ici, un bioréacteur miniaturisé couplé à une modalité d’imagerie qui permet la visualisation in situ de la lumière interne de la trachée de rat explantée lors de la manipulation et de la culture de tissus in vitro est décrit. À l’aide de ce bioréacteur, le protocole démontre l’élimination sélective guidée par imagerie des composants cellulaires endogènes tout en préservant les caractéristiques biochimiques intrinsèques et l’ultrastructure de la matrice tissulaire des voies respiratoires. En outre, la livraison, la distribution uniforme et la culture prolongée ultérieure de cellules exogènes sur la lumière décellularisée des voies respiratoires avec surveillance optique in situ sont montrées. Les résultats soulignent que le bioréacteur guidé par imagerie peut potentiellement être utilisé pour faciliter la génération de tissus fonctionnels des voies respiratoires in vitro .

La modalité d’imagerie in situ basée sur la lentille GRIN peut permettre la visualisation de la lumière interne trachéale in situ (Figure 5A). Grâce à cette méthode d’imagerie, il est possible d’obtenir des images en champ lumineux et fluorescentes des trachées natives et désépithélialisées (Figure 5B,C). Aucun signal fluorescent n’a été observé à partir de la trachée native avant le marquage CFSE (<str...

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Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Le protocole décrit un bioréacteur basé sur l’imagerie qui permet l’élimination sélective de l’épithélium endogène de la trachée du rat et la distribution homogène des cellules exogènes à la surface de la lumière, suivie d’une culture in vitro à long terme de la construction du tissu cellulaire.

Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Ce protocole permet la culture in vitro et la visualisation microscopique directe des tissus isolés des voies respiratoires lors de différentes procédures de manipulation tissulaire, telles que la désépithélisation et la régénération des tissus des voies respiratoires. L’imagerie in situ proposée dans cette étude permet une surveillance rapide et non destructive de la lumière trachéale lors de l’ablation contrôlée guidée par imagerie de l’épithélium endogène et de l’administration des cellules exogènes. La plate-forme de bioréactivité guidée par imagerie et les protocoles de manipulation tissulaire peuvent être utilisés pour générer des tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie pour la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments.La construction et l’utilisation du bioréacteur tissulaire des voies respiratoires par imagerie seront démontrées par deux doctorants de notre groupe de recherche, Mohammad Mir, et Jiawen Chen. Pour commencer à créer un dispositif d’imagerie in situ, insérez une lentille tubulaire dans un tube de lentille empilable et fixez-la à l’aide d’un anneau de retenue. Ensuite, montez l’ensemble de la table d’objectif sur une caméra CMOS scientifique via un adaptateur à monture C.Utilisez le logiciel Micromanager pour faire fonctionner l’appareil photo et acquérir des photos et des vidéos. Lorsque vous visez un objet situé à 10 mètres de la caméra, ajustez la distance entre l’objectif tubulaire et le capteur d’imagerie de la caméra jusqu’à ce qu’une image focalisée de l’objet se forme sur l’écran de l’ordinateur. Ensuite, utilisez des composants de système de cage optique, tels que la tige d’assemblage, la plaque de cage filetée et le cube de cage pour monter une lentille filtrante sur un miroir dichroïque à double bord, super-résolution et un laser sur l’appareil.Connectez un objectif 20X à l’appareil. Ensuite, montez une lentille verte d’un diamètre de 500 micromètres à l’extrémité distale du tube de l’objectif via le traducteur X-Y. Ajustez la distance entre les lentilles vertes et les lentilles de l’objectif pour former les images microscopiques focalisées.Pour visualiser la lumière isolée de la trachée de rat en champ lumineux ou fluorescent, placez le bioréacteur sur la scène d’imagerie. Ensuite, infuser 500 microlitres de l’ester de carboxyfluorescéine succinimidyle fraîchement préparé, ou solution CFSE, à un débit de cinq millilitres par minute à travers la trachée via la pompe à seringue reliée au tube de la canule de trachée. Une fois que la solution CFSE remplit la trachée, arrêtez la pompe.Après 10 minutes, lavez la lumière de la trachée en injectant 10 millilitres de PBS à l’aide de la pompe à seringue pour éliminer les réactifs CFSE résiduels non incorporés. Après le lavage, insérez l’extrémité d’imagerie distale de la lentille verte dans la trachée via le connecteur luer fixé à une extrémité de la trachée. Ensuite, déplacez doucement la lentille verte à l’intérieur de la trachée jusqu’à ce que la surface de la trachée soit focalisée.Pour capturer les images en champ lumineux dans le logiciel micromanager, illuminez la lumière de la trachée avec de la lumière blanche à travers le cube de la cage. Ensuite, cliquez sur l’icône Live pour afficher la surface lumineuse de la trachée en temps réel. Utilisez les onglets Imagerie et Exposition pour modifier le temps d’exposition à la valeur souhaitée.Pour régler le contraste et la luminosité des images, utilisez la fenêtre de mise à l’échelle de l’histogramme et de l’intensité pour déplacer les flèches noir et blanc au point final de l’affichage de l’histogramme interactif. Cliquez sur Arrêter en direct pour activer l’icône Snap, puis cliquez sur l’icône Snap pour figer l’image. Ensuite, utilisez le paramètre Exporter puis Images en tant qu’onglets déplacés pour enregistrer les images dans le format souhaité.Pour obtenir des photos et des vidéos en mode fluorescent, illuminez la lumière de la trachée avec une lumière laser spécifique à CFSE à travers le cube de la cage et acquérez les images en temps réel en déplaçant la sonde d’imagerie d’avant en arrière. Une fois les photos et les vidéos obtenues, retirez doucement la lentille verte de la trachée. Pour la désépithélialisation de la trachée, instiller 50 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 2% fraîchement préparé à travers la canule de la trachée pour générer un film mince de la solution détergente sur la lumière de la trachée.Après l’instillation, fermez les connexions de tuyauterie du bioréacteur à l’aide de bouchons mâles ou femelles et transférez le bioréacteur dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour permettre à la FDS de rester dans la trachée. Répétez l’instillation une fois. Après la deuxième instillation, retirez l’épithélium lysé et le SDS en irriguant la lumière de la trachée trois fois avec 500 microlitres de PBS via une pompe à seringue à un débit de 10 millilitres par minute.Ensuite, placez le bioréacteur sur un agitateur pour vibrer mécaniquement à une fréquence de 20 Hertz et une amplitude de déplacement de 0,3 millimètre pour favoriser physiquement le détachement des cellules épithéliales traitées par SDS de la lumière de la trachée. Pendant que la trachée est vibrée mécaniquement, instillez 500 microlitres de PBS deux fois à travers la lumière de la trachée pour éliminer les FDS résiduelles et les débris cellulaires. Après l’ablation de l’épithélium, évaluez la clairance de la couche épithéliale en mesurant l’intensité du CFSE à l’aide du dispositif d’imagerie à lentille verte.Après avoir préparé une trachée de rat désépithélialisée, décongeler les cellules souches mésenchymateuses congelées, ou CSM, pendant 30 secondes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ensuite, comptez les cellules avec un hémocytomètre, puis préparez une solution cellulaire avec une concentration de cinq fois 10 à six cellules par millilitre. Ensuite, marquez les cellules de manière fluorescente en les incubant avec deux millilitres de solution cfSE de 100 micromolaires à température ambiante.Après 15 minutes, rincer les cellules avec cinq millilitres de PBS trois fois avant de les réutiliser dans un milieu de culture DMEM frais à une concentration finale de trois fois 10 à sept cellules par millilitre. Immédiatement après la préparation de l’hydrogel de collagène I, comme décrit dans le manuscrit, ajoutez les cellules à la solution d’hydrogel avec la concentration souhaitée. Ensuite, mélangez les cellules et la solution de gel avec une micropipette pour obtenir un mélange cellulaire-hydrogel uniforme.Ensuite, fixez une extrémité de la trachée dans le bioréacteur à une pompe à seringue programmable à travers un connecteur luer et délivrez cinq millilitres de milieu de culture frais dans la chambre du bioréacteur à 37 degrés Celsius pour couvrir la surface extérieure de la trachée. Ensuite, administrer 10 bolus de microlitres du mélange cellule-hydrogel dans la trachée désépithélialisée dans le bioréacteur pour générer une couche d’hydrogel cellulaire sur la lumière de la trachée. Après l’injection cellulaire, placez le bioréacteur dans un incubateur de culture cellulaire stérile à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour la gélification pendant 30 minutes pour permettre la gélification.Pour visualiser la distribution des cellules implantées, stérilisez la lentille verte avec de l’alcool isopropylique ou de l’éthanol à 70% et placez le bioréacteur sur la scène d’imagerie pour obtenir les photos et les vidéos en mode champ lumineux et fluorescent. Après 30 minutes d’ensemencement cellulaire, infuser un millilitre de milieu de culture dans la lumière de la trachée à un débit d’un millilitre par minute. Enfin, cultivez la trachée ensemencée dans le bioréacteur dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant le temps souhaité.Pendant la culture cellulaire, gardez le milieu à l’intérieur de la lumière statique, tandis que le milieu à l’extérieur de la trachée est continuellement perfusé via un flux unidirectionnel. Dans les images en champ lumineux et fluorescentes de la trachée désépithélialisée, aucun signal fluorescent n’a été observé avant le marquage CFSE. Avec le CFSE, un signal fluorescent uniforme a été observé dans tout l’épithélium.Après la désépithélialisation, l’intensité fluorescente a été considérablement réduite, ce qui indique une ablation de l’épithélium. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de la trachée désépithélialisée a illustré l’élimination de l’épithélium pseudo-stratifié de la lumière de la trachée et la préservation des cellules et de la matrice extracellulaire, ou microstructures ECM, dans les couches tissulaires sous-jacentes. De plus, la coloration pentachrome et trichrome a confirmé le maintien de l’architecture tissulaire de la trachée et des composants ECM, tels que le collagène et les protéoglycanes.L’immunofluorescence des cellules épithéliales et du collagène I a révélé l’élimination complète de l’épithélium et la préservation du collagène I dans le tissu sous-épithélial. Les micrographies électroniques à balayage indiquaient que la trachée native était peuplée de cellules multicindées et gobelets. Dans la trachée désépithélialisée, la membrane basale a été exposée, comme l’indiquent un réseau maillé de fibres de matrice extracellulaire et l’absence de cellules épithéliales.Les images de fluorescence de la trachée désépithélialisée, lors de l’ensemencement avec du PBS et du collagène, sont montrées ici. Par rapport aux cellules ensemencées via un milieu de culture, les cellules marquées par fluorescence délivrées par hydrogel sont restées adhérées plus uniformément à travers la lumière. L’étude de viabilité cellulaire a démontré que la viabilité n’était pas affectée par la procédure d’administration cellulaire et que plus de 90% des cellules restaient viables.La création d’une fine pellicule de détergent dans le processus de désépithélisation et l’utilisation de l’hydrogel comme vecteur pour les cellules sont des étapes essentielles au succès de ce protocole. Notre prochain objectif de recherche est d’implanter des cellules primaires ou souches des voies respiratoires cultivées en laboratoire sur le tissu des voies respiratoires désépithélialisé afin d’étudier si le tissu fonctionnel des voies respiratoires peut être préparé.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Conception d&#39;un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l&#39;ingénierie tissulaire

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Recherche

Bio-ingénierie

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l&#39;opération

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

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Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

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