Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר של קרן האגודה האמריקאית לרפואת החזה, קרן הבריאות של ניו ג'רזי, והקרן הלאומית למדע (פרס CAREER 2143620) לג'יי קיי; והמכונים הלאומיים לבריאות (P41 EB027062) ל- G.V.N.

פרוטוקול רקמות בעלי החיים שלהלן אושר על ידי ההנחיות ותקנות רווחת בעלי החיים של המכון לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכון סטיבנס לטכנולוגיה, והוא תואם את הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים.
1. תכנון ובנייה של ביוריאקטור של קנה הנשימה של חולדה ?...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+the+epithelium+in+chronic+upper+airways+diseases.">Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).</li><li>Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+function+of+airway+tract+epithelium.">Barrier function of airway tract epithelium.</a> Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).</li><li>De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium+dysfunction+in+cystic+fibrosis+and+COPD.">Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD.</a> Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).</li><li>Horani, A., Ferkol, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+genetics+of+primary+ciliary+dyskinesia:+Clinical+implications.">Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications.</a> Chest. 154 (3), 645-652 (2018).</li><li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis.">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).</li><li>Shrestha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-on-a-chip:+the+future+of+respiratory+disease+models+and+pharmacological+studies.">Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).</li><li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro.">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li><li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pulmonary+cystic+fibrosis+in+a+human+lung+airway-on-a-chip.">Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip.</a> Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).</li><li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Gilpin, S. E., Wagner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+lung+scaffolds+to+model+lung+disease+and+tissue+regeneration.">Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration.</a> European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+lungs+for+transplantation.">Bioengineering lungs for transplantation.</a> Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).</li><li>Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+regeneration:+steps+toward+clinical+implementation+and+use.">Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).</li><li>Planchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).</li><li>Coward, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).</li><li>Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+decellularization+using+a+combination+of+chemical,+physical+and+bioreactor+methods.">Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods.</a> The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).</li><li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds.">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

בעבודה זו יצרנו ביוריאקטור מונחה הדמיה שיכול לאפשר (1) ניטור של לומן קנה הנשימה באתרו לאחר הסרת התאים והעברת התאים האקסוגנית ו-(ii) תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של רקמת קנה הנשימה הזורע בתאים. באמצעות ביוריאקטור זה שנבנה בהתאמה אישית, הדגמנו (1) הסרה סלקטיבית של תאי האפיתל האנדוגניים מ...

המשטח הלומינלי של דרכי הנשימה מרופד בשכבה של אפיתל המורכבת בעיקר מתאי גזע רב-ציליתיים, קלאב, גביעובזלתיים 1,2. שכבת האפיתל משמשת כמנגנון הגנה עיקרי של הריאה, ופועלת כמחסום ביופיזי המגן על רקמת דרכי הנשימה הבסיסית מפני פתוגנים, חלקיקים או גזים כימיים בשאיפה. הוא מגן על רקמת דרכי הנשימה באמצעות מנגנונים מרובים, כולל היווצרות צמתים הדוקים בין-תאיים, פינוי רירית, והפרשת מיקרוביאלית ונוגדת חמצון 3,4. אפיתל דרכי הנשימה הפגום קשור למחלות נשימה הרסניות, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD)5, דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD)6, וסיסטיק פיברוזיס (CF)7.
ההתקדמות בטכנולוגיית ריאה על שבב (LOC) מייצגת הזדמנות לחקור את התפתחות הריאות האנושיות, למדל מחלות ריאה שונות ולפתח חומרים טיפוליים חדשים בסביבות במבחנה המווסתות היטב. לדוגמה, אפיתל דרכי הנשימה והאנדותל יכולים להיות תרבית בצדדים מנוגדים של קרום דק ונקבובי כדי לחקות את הגז המחליף רקמת ריאה, מה שמאפשר מודלים נאמנים של מחלות ובדיקות סמים8. באופן דומה, מודלים של מחלות חוץ גופיות נוצרו כדי למדל מחלות בדרכי הנשימה במבחנה, כגון COPD9 וסיסטיק פיברוזיס10. עם זאת, אתגר גדול של התקני LOC הוא שחזור הארכיטקטורה התלת-ממדית (התלת-ממדית) המורכבת של רקמת הריאה והאינטראקציות הדינמיות בין מטריצת תאים לרקמות במבחנה11.
לאחרונה פותחו מתודולוגיות חדשניות להנדסת רקמות המאפשרות מניפולציה של רקמות ריאה ex vivo 12. באמצעות מתודולוגיות אלה, ניתן להכין שתלי רקמות אלוגניות או קסנוגניות על ידי הסרת התאים האנדוגניים מרקמת הריאה באמצעות טיפולים כימיים, פיזיקליים ומכניים13. בנוסף, המטריצה החוץ-תאית של הרקמה המקומית שהשתמרה (ECM) בפיגומי הריאה שעברו דה-תאיזציה מספקת את הרמזים המבניים הפיזיו-מימטיים, הביוכימיים והביו-מכניים עבור תאים מושתלים כדי לחבר, להתרבות ולהבדיל14,15.
כאן מדווחת מערכת ביוריאקטור מונחית הדמיה שנוצרה על ידי שילוב של טכנולוגיות LOC והנדסת רקמות כדי לאפשר מניפולציה של רקמת חוץ גופית ותרבית של רקמות קנה הנשימה של חולדות מוסברות. באמצעות ביוריאקטור זה של רקמת דרכי הנשימה, הפרוטוקול מדגים הסרה סלקטיבית של תאי האפיתל האנדוגניים מבלי לשבש את המרכיבים התת-תאיים והביוכימיים התת-אפיתליאליים הבסיסיים של רקמת דרכי הנשימה. לאחר מכן אנו מראים את ההתפלגות ההומוגנית ואת התצהיר המיידי של התאים האקסוגניים החדשים שנזרעו, כגון תאי גזע מזנכימליים (MSCs), על לומן דרכי הנשימה הפגוע על ידי החדרת תמיסת הקולגן I הקדם-ג'לית הטעונה בתאים. בנוסף, על ידי שימוש בהתקן ההדמיה המיקרו-אופטי המשולב בביוריאקטור, נעשה גם הדמיה של לומן קנה הנשימה במהלך הסרת אפיתל והעברת תאים אנדוגניים. יתר על כן, הוא הראה כי קנה הנשימה והתאים המושתלים החדשים יכולים להיות תרבית בביוריאקטור ללא מוות תאי מורגש והתפרקות רקמות במשך 4 ימים. אנו צופים כי פלטפורמת הביוריאקטורים התומכת בהדמיה, טכניקת הדה-אפיתליזציה המבוססת על סרט דק ושיטת העברת התאים המשמשת במחקר זה יכולות להיות שימושיות ליצירת רקמות דרכי הנשימה עבור מידול מחלות במבחנה ובדיקת תרופות.
הביוריאקטור כולל תא מלבני המחובר למשאבת מזרקים הניתנת לתכנות, משאבת פרפוזיה ומכונת הנשמה לצורך קיבוץ קנה הנשימה של חולדות מבודדות. הביוריאקטור כולל פתחים ושקעים המחוברים לקנה הנשימה או לתא תרביות הרקמה כדי לספק בנפרד ריאגנטים (למשל, מדיית תרבית) למרחבים הפנימיים והחיצוניים של קנה הנשימה (איור 1). ניתן להשתמש במערכת הדמיה שנבנתה בהתאמה אישית כדי לדמיין את פנים קנה הנשימה של חולדה בתרבית חוץ גופית ברמה התאית (איור 2). האפיתל האנדוגני של קנה הנשימה מוסר באמצעות החדרת תמיסת דה-תאיזציה מבוססת דטרגנטים ולאחריה שטיפת דרכי הנשימה בסיוע רטט (איור 3). תמיסת הידרוג'ל, כגון קולגן מסוג I, משמשת ככלי אספקה לזריעה של תאים אקסוגניים באופן אחיד ומיידי על פני לומן קנה הנשימה המנוקד (איור 4). כל החומרים המשמשים לבניית הביוריאקטור ולביצוע הניסויים מסופקים בטבלת החומרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

פגיעה חוזרת ונשנית ברקמת דרכי הנשימה עלולה לפגוע בתפקוד הריאות ולגרום למחלות ריאה כרוניות, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית. ההתקדמות ברפואה רגנרטיבית ובטכנולוגיות ביוריאקטורים מציעה הזדמנויות לייצר מבני רקמות ואיברים פונקציונליים שגודלו במעבדה, שניתן להשתמש בהם כדי לסנן תרופות, למדל מחלות ולהנדס תחליפי רקמות. כאן מתוארת ביוריאקטור ממוזער בשילוב עם שיטת הדמיה המאפשרת הדמיה באתרה של הלומן הפנימי של קנה הנשימה של חולדה מוסברת במהלך מניפולציה של רקמת מבחנה ותרבית. באמצעות ביוריאקטור זה, הפרוטוקול מדגים הסרה סלקטיבית מונחית הדמיה של רכיבים תאיים אנדוגניים תוך שמירה על התכונות הביוכימיות הפנימיות ומבנה האולטרה-מבנה של מטריצת רקמת דרכי הנשימה. יתר על כן, ההעברה, ההתפלגות האחידה והתרבית הממושכת שלאחר מכן של תאים אקסוגניים על לומן דרכי הנשימה נטולי התאים עם ניטור אופטי באתרו מוצגים. התוצאות מדגישות כי ניתן להשתמש בביוריאקטור מונחה ההדמיה כדי להקל על יצירת רקמות אוויריות פונקציונליות במבחנה .

שיטת ההדמיה in situ המבוססת על עדשת GRIN יכולה לאפשר הדמיה של הלומן הפנימי של קנה הנשימה באתרו (איור 5A). באמצעות שיטת הדמיה זו, ניתן לקבל גם תמונות בשדה בהיר וגם תמונות פלואורסצנטיות של קנה הנשימה הטבעי ושל קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל (איור 5B,C). לא נ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

הפרוטוקול מתאר ביוריאקטור התומך בהדמיה המאפשר הסרה סלקטיבית של האפיתל האנדוגני מקנה הנשימה של החולדה והתפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על פני השטח של לומן, ולאחר מכן תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של מבנה רקמת התא.

ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

פרוטוקול זה מאפשר גידול במבחנה והדמיה מיקרוסקופית ישירה של רקמות דרכי הנשימה המבודדות במהלך הליכי מניפולציה שונים של רקמות, כגון דה-אפיתליזציה והתחדשות רקמות דרכי הנשימה. הדמיית in situ שהוצעה במחקר זה מאפשרת ניטור מהיר ולא הרסני של לומן קנה הנשימה במהלך הסרה מבוקרת מונחית הדמיה של האפיתל האנדוגני והעברת התאים האקסוגניים. ניתן להשתמש בפלטפורמה הביו-ריאאקטיבית מונחית ההדמיה ובפרוטוקולי מניפולציה של רקמות רקמות בדרכי הנשימה כדי ליצור רקמת דרכי אוויר מהונדסת ביולוגית לצורך מידול מחלות ובדיקת תרופות.הבנייה והשימוש בביוריאקטור של רקמות דרכי הנשימה התומך בהדמיה יודגמו על ידי שני דוקטורנטים מקבוצת המחקר שלנו, מוחמד מיר, וג'יאוון צ'ן. כדי להתחיל ליצור מכשיר הדמיה באתרו, הכנס עדשת צינור לתוך צינור עדשה הניתן לערימה ואבטח אותה באמצעות טבעת תמך. לאחר מכן, הרכיבו את מכלול שולחן העדשה על מצלמת CMOS מדעית באמצעות מתאם C-mount.השתמש בתוכנת Micromanager כדי להפעיל את המצלמה ולרכוש תמונות וסרטונים. בעת הכוונה לאובייקט הממוקם במרחק של 10 מטרים מהמצלמה, התאם את המרחק בין עדשת הצינור לבין חיישן ההדמיה של המצלמה עד שתיווצר תמונה ממוקדת של האובייקט על מסך המחשב. לאחר מכן, השתמש ברכיבי מערכת כלובים אופטיים, כגון מוט הרכבה, לוחית כלוב מושחלת וקוביית כלוב כדי להרכיב עדשת סינון על מראה דו-צדדית, סופר-רזולוציה, דיכרואית ולייזר למכשיר.חברו להתקן עדשת 20X אובייקטיבית. לאחר מכן, הרכיבו עדשה ירוקה בקוטר של 500 מיקרומטר בקצה הדיסטלי של צינור העדשה באמצעות מתרגם X-Y. התאם את המרחק בין העדשה הירוקה לעדשות האובייקטיביות כדי ליצור את התמונות המיקרוסקופיות הממוקדות.כדי לדמיין את לומן קנה הנשימה של החולדה המבודדת בשדה בהיר או פלואורסצנטי, הניחו את הביוריאקטור על שלב ההדמיה. לאחר מכן, להחדיר 500 מיקרוליטרים של אסטר קרבוקסיפלואורסצ'ין סוצ'ינימידיל שהוכן זה עתה, או תמיסת CFSE, בקצב זרימה של חמישה מיליליטרים לדקה דרך קנה הנשימה באמצעות משאבת המזרק המחוברת לצינוריות של צינורית קנה הנשימה. ברגע שפתרון ה- CFSE ממלא את קנה הנשימה, עצור את המשאבה.לאחר 10 דקות, לשטוף את לומן קנה הנשימה על ידי החדרת 10 מיליליטרים של PBS באמצעות משאבת המזרק כדי להסיר את שאריות ריאגנטים CFSE לא מקורבים. לאחר הכביסה, הכנס את קצה ההדמיה הדיסטלי של העדשה הירוקה לקנה הנשימה באמצעות מחבר הלואר המחובר לקצה אחד של קנה הנשימה. לאחר מכן, הזיזו בעדינות את העדשה הירוקה בתוך קנה הנשימה עד שמשטח קנה הנשימה יתמקד.כדי לצלם את תמונות השדה הבהיר בתוכנת המיקרו-מנג'ר, האירו את לומן קנה הנשימה באור לבן דרך קוביית הכלוב. לאחר מכן, לחץ על הסמל Live כדי להציג את המשטח הלומנלי של קנה הנשימה בזמן אמת. השתמש בכרטיסיות 'הדמיה' וב'חשיפה' כדי לשנות את זמן החשיפה לערך הרצוי.כדי להתאים את הניגודיות והבהירות של תמונות, השתמש בחלון ההיסטוגרמה ושינוי הגודל של העוצמה כדי להזיז חצים בשחור-לבן בנקודת הקצה של תצוגת ההיסטוגרמה האינטראקטיבית. לחץ על עצור בשידור חי כדי להפעיל את סמל ההצמדה ולאחר מכן לחץ על סמל ההצמדה כדי להקפיא את התמונה. לאחר מכן, השתמש בהגדרה ייצוא ולאחר מכן תמונות ככרטיסיות עקורות כדי לשמור את התמונות בתבנית הרצויה.כדי להשיג תמונות וסרטונים במצב פלואורסצנטי, האירו את לומן קנה הנשימה באור לייזר ספציפי ל-CFSE דרך קוביית הכלוב ורכשו את התמונות בזמן אמת על ידי הזזת גשושית ההדמיה קדימה ואחורה. לאחר קבלת התמונות והסרטונים, הסר בעדינות את העדשה הירוקה מקנה הנשימה. עבור דה-אפיתליזציה של קנה הנשימה, להחדיר 50 מיקרוליטרים של 2% נתרן דודציל סולפט מוכן טרי דרך צינורית קנה הנשימה כדי ליצור סרט דק של תמיסת דטרגנט על לומן קנה הנשימה.לאחר ההחדרה, סגרו את חיבורי הצינורות של הביוריאקטור באמצעות תקעי לואר זכריים או נקביים והעברו את הביוריאקטור לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר ל-SDS לשכון בתוך קנה הנשימה. חזור על ההחדרה פעם אחת. לאחר ההחדרה השנייה, הסר את האפיתל וה- SDS על ידי השקיית לומן קנה הנשימה שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטרים של PBS באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימה של 10 מיליליטר לדקה.לאחר מכן, הניחו את הביוריאקטור על שייקר כדי לרטוט מכני בתדר של 20 הרץ ומשרעת תזוזה של 0.3 מילימטרים כדי לקדם פיזית ניתוק של תאי אפיתל שטופלו ב-SDS מלומן קנה הנשימה. בזמן שקנה הנשימה רוטט מכנית, החדירו 500 מיקרוליטרים של PBS פעמיים דרך לומן קנה הנשימה כדי להסיר את שאריות ה-SDS ואת פסולת התאים. לאחר הסרת האפיתל, העריכו את פינוי שכבת האפיתל על ידי מדידת עוצמת ה-CFSE באמצעות מכשיר הדמיית העדשה הירוקה.לאחר הכנת קנה הנשימה של חולדה שעברה דה-אפיתל, הפשרת תאי גזע מזנכימליים קפואים, או MSCs, למשך 30 שניות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ספרו את התאים עם המוציטומטר, ולאחר מכן הכנת תמיסת תאים בריכוז של חמישה פעמים 10 עד ששת התאים למיליליטר. לאחר מכן, סמן את התאים באופן פלואורסצנטי על ידי דגירה שלהם עם שני מיליליטרים של תמיסת CFSE 100 מיקרומולרית בטמפרטורת החדר.לאחר 15 דקות, יש לשטוף את התאים בחמישה מיליליטרים של PBS שלוש פעמים לפני שתחזירו אותם לתרבית DMEM טרייה בריכוז סופי של שלוש פעמים 10 עד שבעת התאים למיליליטר. מיד לאחר הכנת קולגן I הידרוג'ל, כפי שמתואר בכתב היד, מוסיפים את התאים לתמיסת ההידרוג'ל בריכוז הרצוי. לאחר מכן, ערבבו את התאים ואת תמיסת הג'ל עם מיקרופיפט כדי לקבל תערובת תאים-הידרוג'ל אחידה.לאחר מכן, חבר קצה אחד של קנה הנשימה בתוך הביוריאקטור למשאבת מזרק ניתנת לתכנות באמצעות מחבר luer והספק חמישה מיליליטרים של מדיום תרבית טרי לתוך תא הביוריאקטור ב-37 מעלות צלזיוס כדי לכסות את פני השטח החיצוניים של קנה הנשימה. לאחר מכן, תן 10 מיקרוליטרים בולוס של תערובת התא-הידרוג'ל לתוך קנה הנשימה דה-אפיתליאלי בתוך הביוריאקטור כדי ליצור שכבת תא-הידרוג'ל על לומן קנה הנשימה. לאחר הזרקת התאים, מניחים את הביוריאקטור בחממת תרביות תאים סטרילית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני לגלציה למשך 30 דקות כדי לאפשר גלציה.כדי לדמיין את התפלגות התאים המושתלים, עקרו את העדשה הירוקה עם 70% אלכוהול איזופרופיל או אתנול והניחו את הביוריאקטור על שלב ההדמיה כדי לקבל את התמונות והסרטונים הן במצב שדה בהיר והן במצב פלואורסצנטי. לאחר 30 דקות של זריעת תאים, מחדירים מיליליטר אחד של מדיום תרבית לתוך לומן קנה הנשימה בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לבסוף, תרבית את קנה הנשימה הזורע בתאים בתוך הביוריאקטור באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס לזמן הרצוי.במהלך תרבית התאים, שמור את המדיה בתוך הלומן סטטי, בעוד המדיה מחוץ לקנה הנשימה מתכלה באופן רציף באמצעות זרימה חד כיוונית. בתמונות השדה הבהיר והפלורסנטי של קנה הנשימה נטול האפיתל, לא נצפה אות פלואורסצנטי לפני תיוג ה-CFSE. עם ה-CFSE נצפה אות פלואורסצנטי אחיד לאורך כל האפיתל.לאחר דה-אפיתליאליזציה, עוצמת הפלואורסצנטיות ירדה באופן משמעותי, מה שמעיד על אבלציה של האפיתל. צביעת ההמטוקסילין והאאוזין של קנה הנשימה דה-אפיתל המחישה את הסרת האפיתל המדומה-מרובד מלומן קנה הנשימה, ואת שימור התאים והמטריצה החוץ-תאית, או מיקרו-מבנים של ECM, בשכבות הרקמה הבסיסיות. יתר על כן, צביעת הפנטכרום והטריכרום אישרה את תחזוקת ארכיטקטורת רקמות קנה הנשימה ורכיבי ECM, כגון קולגן ופרוטאוגליקן.אימונופלואורסצנציה של תאי אפיתל וקולגן חשפתי הסרה מלאה של האפיתל ושימור של קולגן I בתוך רקמת תת-האפיתל. מיקרוגרפי האלקטרונים הסורקים הצביעו על כך שקנה הנשימה הטבעי היה מאוכלס בתאים רב-ציליליים וגביעיים. בקנה הנשימה הדה-אפיתליאלי נחשף קרום המרתף, כפי שמעידה רשת רשת של סיבי מטריצה חוץ-תאיים והיעדר תאי אפיתל.התמונות הפלואורסצנטיות של קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל, עם זריעה עם PBS וקולגן, מוצגות כאן. בהשוואה לתאים שנזרעו באמצעות מדיום תרבית, התאים המסומנים בפלואורסצנטיות המועברים באמצעות הידרוג'ל נשארו דבוקים באופן אחיד יותר על פני הלומן. מחקר הכדאיות של התאים הראה כי הכדאיות לא הושפעה מהליך העברת התאים, ויותר מ-90% מהתאים נותרו בני קיימא.יצירת סרט דק של חומר ניקוי בתהליך הדה-אפיתליזציה ושימוש בהידרוג'ל ככלי אספקה לתאים הם שלבים חיוניים להצלחת פרוטוקול זה. מטרת המחקר הבאה שלנו היא להשתיל תאי אוויר ראשוניים או תאי גזע שגודלו במעבדה על רקמת דרכי הנשימה שעברה דה-אפיתל כדי לחקור אם ניתן להכין רקמת דרכי אוויר תפקודית.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

מבצע של Bioreactor Benchtop

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

בדגם תרבית תאים במבחנה לרעילה בשאיפת בדיקות כימיות

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

קולגן רקומביננטי אני Microcarriers פפטיד עבור הרחבת התא והשתמש פוטנציאלי שלהם כמערכת מסירה תאים במגיב ביולוגי מדגמן

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

ספרואידים לב כמו במבחנה ביו מהונדסת רקמות לב לחקור פתופיזיולוגיה לב אנושי

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

ביוריאקטור פרפוזיה מרובה זרמים משולב עם פיצול מוצא לתרבית תאים דינמית

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...