Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dall'American Thoracic Society Foundation Research Program, dalla New Jersey Health Foundation e dalla National Science Foundation (CAREER Award 2143620) a J.K.; e il National Institutes of Health (P41 EB027062) al G.V.N.

Il protocollo sui tessuti animali di seguito è stato approvato dalle linee guida e dai regolamenti sul benessere degli animali dell'Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) presso lo Stevens Institute of Technology ed è conforme alle linee guida del National Institutes of Health (NIH) per l'uso di animali da esperimento.
1. Progettazione e costruzione di bioreattori per trachee di ratto guidati da imaging
<ol><li>Progettazione e fabbricazione di bioreattori di t...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

In questo lavoro, abbiamo creato un bioreattore guidato dall'imaging che può consentire (i) il monitoraggio del lume della trachea in situ dopo la rimozione cellulare e la consegna esogena delle cellule e (ii) la coltura in vitro a lungo termine del tessuto tracheale seminato dalle cellule. Utilizzando questo bioreattore personalizzato, abbiamo dimostrato (i) la rimozione selettiva delle cellule epiteliali endogene dal lume della trachea utilizzando detergenti e lavaggio delle vie aeree assistito da vi...

La superficie luminale delle vie respiratorie è rivestita da uno strato di epitelio costituito principalmente da cellule staminali multi-ciliate, club, calici e basali 1,2. Lo strato epiteliale funge da meccanismo di difesa primario del polmone, agendo come una barriera biofisica che protegge il tessuto delle vie aeree sottostante da agenti patogeni inalati, particolato o gas chimici. Protegge il tessuto delle vie aeree attraverso molteplici meccanismi, tra cui la formazione di giunzioni strette intercellulari, la clearance mucociliare e la secrezione antimicrobica e antiossidante 3,4. L'epitelio difettoso delle vie aeree è associato a malattie respiratorie devastanti, come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO)5, la discinesia ciliare primaria (PCD)6 e la fibrosi cistica (CF)7.
I progressi nella tecnologia lung-on-chip (LOC) rappresentano un'opportunità per studiare lo sviluppo del polmone umano, modellare varie malattie polmonari e sviluppare nuovi materiali terapeutici in ambienti in vitro strettamente regolamentati. Ad esempio, l'epitelio e l'endotelio delle vie aeree possono essere coltivati su lati opposti di una membrana sottile e porosa per imitare il tessuto polmonare che scambia gas, consentendo una fedele modellazione della malattia e test antidroga8. Allo stesso modo, sono stati creati modelli di malattia in vitro per modellare le malattie delle vie aeree in vitro, come la BPCO9 e la fibrosi cistica10. Tuttavia, una delle principali sfide dei dispositivi LOC è ricapitolare la complessa architettura tridimensionale (3D) del tessuto polmonare e le interazioni dinamiche della matrice cellula-tessuto in vitro11.
Recentemente sono state sviluppate metodologie innovative di ingegneria tissutale che consentono la manipolazione di tessuti polmonari ex vivo 12. Utilizzando queste metodologie, gli innesti di tessuto allogenico o xenogenico denudato possono essere preparati rimuovendo le cellule endogene dal tessuto polmonare tramite trattamenti chimici, fisici e meccanici13. Inoltre, la matrice extracellulare del tessuto nativo conservato (ECM) negli scaffold polmonari decellularizzati fornisce i segnali strutturali, biochimici e biomeccanici fisio-mimetici per le cellule impiantate per attaccare, proliferare e differenziare14,15.
Qui, viene riportato un sistema di bioreattore guidato da imaging creato combinando tecnologie LOC e di ingegneria tissutale per consentire la manipolazione tissutale in vitro e la coltura di tessuti tracheali di ratto espiantati. Utilizzando questo bioreattore del tessuto delle vie aeree, il protocollo dimostra la rimozione selettiva delle cellule epiteliali endogene senza interrompere i componenti cellulari e biochimici subepiteliali sottostanti del tessuto delle vie aeree. Successivamente mostriamo la distribuzione omogenea e la deposizione istantanea delle cellule esogene appena seminate, come le cellule staminali mesenchimali (MSC), sul lume delle vie aeree denudato instillando la soluzione pre-gel di collagene I caricata con cellule. Inoltre, utilizzando il dispositivo di imaging micro-ottico integrato nel bioreattore, viene eseguita anche la visualizzazione del lume della trachea durante la rimozione dell'epitelio e la consegna delle cellule endogene. Inoltre, è dimostrato che la trachea e le cellule appena impiantate possono essere coltivate nel bioreattore senza morte cellulare evidente e degradazione tissutale per 4 giorni. Immaginiamo che la piattaforma di bioreattori abilitata per l'imaging, la tecnica di deepitelializzazione basata su film sottile e il metodo di consegna cellulare utilizzato in questo studio possano essere utili per generare tessuti delle vie aeree per la modellazione in vitro della malattia e lo screening farmacologico.
Il bioreattore comprende una camera rettangolare collegata a una pompa a siringa programmabile, una pompa di perfusione e un ventilatore per la coltivazione di trachee di ratto isolate. Il bioreattore presenta ingressi e uscite collegati alla trachea o alla camera di coltura tissutale per fornire separatamente reagenti (ad esempio, terreni di coltura) agli spazi interni ed esterni della trachea (Figura 1). Un sistema di imaging personalizzato può essere utilizzato per visualizzare l'interno della trachea di ratto coltivata in vitro a livello cellulare (Figura 2). L'epitelio endogeno della trachea viene rimosso attraverso l'instillazione di una soluzione di decellularizzazione a base di detergente seguita da lavaggio delle vie aeree assistito da vibrazioni (Figura 3). La soluzione di idrogel, come il collagene di tipo I, viene utilizzata come veicolo di consegna per la semina di cellule esogene in modo uniforme e istantaneo attraverso il lume della trachea denudato (Figura 4). Tutti i materiali utilizzati per costruire il bioreattore e condurre gli esperimenti sono forniti nella Tabella dei materiali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

Lesioni ripetute al tessuto delle vie aeree possono compromettere la funzione polmonare e causare malattie polmonari croniche, come la broncopneumopatia cronica ostruttiva. I progressi nella medicina rigenerativa e nelle tecnologie dei bioreattori offrono l'opportunità di produrre tessuti funzionali cresciuti in laboratorio e costrutti di organi che possono essere utilizzati per lo screening di farmaci, modelli di malattie e sostituzioni di tessuti ingegnerizzate. Qui viene descritto un bioreattore miniaturizzato accoppiato con una modalità di imaging che consente la visualizzazione in situ del lume interno della trachea di ratto espiantata durante la manipolazione e la coltura dei tessuti in vitro . Utilizzando questo bioreattore, il protocollo dimostra la rimozione selettiva guidata dall'imaging di componenti cellulari endogeni preservando le caratteristiche biochimiche intrinseche e l'ultrastruttura della matrice tissutale delle vie aeree. Inoltre, vengono mostrati il rilascio, la distribuzione uniforme e la successiva coltura prolungata di cellule esogene sul lume delle vie aeree decellularizzato con monitoraggio ottico in situ . I risultati evidenziano che il bioreattore guidato dall'imaging può potenzialmente essere utilizzato per facilitare la generazione di tessuti funzionali in vitro delle vie aeree.

La modalità di imaging in situ basata su lenti GRIN può consentire la visualizzazione del lume interno tracheale in situ (Figura 5A). Utilizzando questo metodo di imaging, è possibile ottenere sia immagini a campo luminoso che fluorescenti delle trachee native e deepilelializzate (Figura 5B,C). Nessun segnale fluorescente è stato osservato dalla trachea nativa prima dell'etichettatura CFSE (Figura 5Bii<...

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Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Il protocollo descrive un bioreattore abilitato all'imaging che consente la rimozione selettiva dell'epitelio endogeno dalla trachea di ratto e la distribuzione omogenea di cellule esogene sulla superficie del lume, seguita da una coltura in vitro a lungo termine del costrutto cellula-tessuto.

Bioreattore guidato da imaging per la generazione di tessuto delle vie aeree bioingegnerizzato

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Questo protocollo consente la coltivazione in vitro e la visualizzazione microscopica diretta dei tessuti delle vie aeree isolati durante diverse procedure di manipolazione dei tessuti, come la de-epitelizzazione e la rigenerazione del tessuto delle vie aeree. L'imaging in situ proposto in questo studio consente un monitoraggio rapido e non distruttivo del lume tracheale durante la rimozione controllata guidata dall'imaging dell'epitelio endogeno e la consegna delle cellule esogene. La piattaforma bioreattiva guidata dall'imaging e i protocolli di manipolazione dei tessuti possono essere utilizzati per generare tessuto delle vie aeree bioingegnerizzato per la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci.La costruzione e l'utilizzo del bioreattore del tessuto delle vie aeree abilitato all'imaging saranno dimostrati da due dottorandi del nostro gruppo di ricerca, Mohammad Mir e Jiawen Chen. Per iniziare a creare un dispositivo di imaging in situ, inserire una lente tubolare in un tubo obiettivo impilabile e fissarla utilizzando un anello di fissaggio. Quindi, montare il gruppo tavolo obiettivo su una telecamera CMOS scientifica tramite un adattatore C-mount.Utilizzare il software Micromanager per utilizzare la fotocamera e acquisire foto e video. Mentre si mira a un oggetto situato a 10 metri dalla fotocamera, regolare la distanza tra l'obiettivo valvolare e il sensore di imaging della fotocamera fino a quando non si forma un'immagine focalizzata dell'oggetto sullo schermo del computer. Successivamente, utilizzare i componenti del sistema di gabbia ottica, come l'asta di assemblaggio, la piastra filettata della gabbia e il cubo della gabbia per montare una lente filtrante su uno specchio dicroico a doppio bordo, super-risoluzione, e un laser sul dispositivo.Collegare un obiettivo 20X al dispositivo. Quindi, montare un obiettivo verde con un diametro di 500 micrometri all'estremità distale del tubo dell'obiettivo tramite il traduttore X-Y. Regola la distanza tra le lenti verdi e quelle dell'obiettivo per formare le immagini microscopiche focalizzate.Per visualizzare il lume della trachea di ratto isolato in campo luminoso o fluorescente, posizionare il bioreattore nella fase di imaging. Successivamente, infondere 500 microlitri dell'estere carbossifluoresceina succinimidyl appena preparato, o soluzione CFSE, ad una portata di cinque millilitri al minuto attraverso la trachea tramite la pompa della siringa collegata al tubo della cannula tracheale. Una volta che la soluzione CFSE riempie la trachea, arrestare la pompa.Dopo 10 minuti, lavare il lume della trachea infondendo 10 millilitri di PBS utilizzando la pompa della siringa per rimuovere i reagenti CFSE residui non incorporati. Dopo il lavaggio, inserire l'estremità distale della lente verde nella trachea tramite il connettore luer collegato a un'estremità della trachea. Quindi, spostare delicatamente la lente verde all'interno della trachea fino a quando la superficie della trachea non è focalizzata.Per acquisire le immagini in campo luminoso nel software micromanager, illuminare il lume della trachea con luce bianca attraverso il cubo della gabbia. Quindi, fai clic sull'icona Live per mostrare la superficie lumenale della trachea in tempo reale. Utilizzare l'impostazione Imaging e le schede Esposizione per modificare il tempo di esposizione al valore desiderato.Per regolare il contrasto e la luminosità delle immagini, utilizzare l'istogramma e la finestra di ridimensionamento dell'intensità per spostare le frecce in bianco e nero nel punto finale della visualizzazione interattiva dell'istogramma. Fai clic su Stop Live per attivare l'icona Snap, quindi fai clic sull'icona Snap per bloccare l'immagine. Quindi, utilizzare l'impostazione Esporta quindi Immagini come schede spostate per salvare le immagini nel formato desiderato.Per ottenere foto e video in modalità fluorescente, illuminare il lume della trachea con luce laser specifica CFSE attraverso il cubo della gabbia e acquisire le immagini in tempo reale spostando la sonda di imaging avanti e indietro. Una volta ottenute le foto e i video, rimuovere delicatamente l'obiettivo verde dalla trachea. Per la deepitelializzazione della trachea, infondere 50 microlitri del 2% di dodecil solfato di sodio appena preparato attraverso la cannula della trachea per generare un film sottile della soluzione detergente sul lume della trachea.Dopo l'instillazione, chiudere le connessioni dei tubi del bioreattore utilizzando tappi luer maschio o femmina e trasferire il bioreattore in un incubatore a 37 gradi Celsius per 10 minuti per consentire alla SDS di dimorare all'interno della trachea. Ripeti l'instillazione una volta. Dopo la seconda instillazione, rimuovere l'epitelio lisato e la SDS irrigando tre volte il lume della trachea con 500 microlitri di PBS tramite pompa a siringa ad una portata di 10 millilitri al minuto.Quindi, posizionare il bioreattore su uno shaker per vibrare meccanicamente a una frequenza di 20 Hertz e un'ampiezza di spostamento di 0,3 millimetri per promuovere fisicamente il distacco delle cellule epiteliali trattate con SDS dal lume della trachea. Mentre la trachea viene vibrata meccanicamente, instillare 500 microlitri di PBS due volte attraverso il lume della trachea per rimuovere la SDS residua e i detriti cellulari. Dopo la rimozione dell'epitelio, valutare la clearance dello strato epiteliale misurando l'intensità del CFSE utilizzando il dispositivo di imaging a lente verde.Dopo aver preparato una trachea di ratto deepilelializzata, scongelare le cellule staminali mesenchimali congelate, o MSC, per 30 secondi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi, contare le cellule con un emocitometro, seguito dalla preparazione di una soluzione cellulare con una concentrazione di cinque volte 10 alle sei cellule per millilitro. Quindi, etichettare le cellule in modo fluorescente incubandole con due millilitri di soluzione CFSE 100 micromolare a temperatura ambiente.Dopo 15 minuti, sciacquare le cellule con cinque millilitri di PBS tre volte prima di risospenderle in un terreno di coltura DMEM fresco ad una concentrazione finale di tre volte 10 alle sette cellule per millilitro. Immediatamente dopo la preparazione del collagene I idrogel, come descritto nel manoscritto, aggiungere le cellule alla soluzione di idrogel con la concentrazione desiderata. Quindi, mescolare le cellule e la soluzione di gel con una micropipetta per ottenere una miscela uniforme di cellule-idrogel.Quindi, collegare un'estremità della trachea all'interno del bioreattore a una pompa a siringa programmabile attraverso un connettore luer e fornire cinque millilitri di terreno di coltura fresco nella camera del bioreattore a 37 gradi Celsius per coprire la superficie esterna della trachea. Quindi, somministrare 10 microlitri bolo della miscela cellula-idrogel nella trachea deepitelializzata all'interno del bioreattore per generare uno strato di idrogel cellulare sul lume della trachea. Dopo l'iniezione cellulare, posizionare il bioreattore in un incubatore di colture cellulari sterili a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per la gellazione per 30 minuti per consentire la gellazione.Per visualizzare la distribuzione delle cellule impiantate, sterilizzare la lente verde con alcool isopropilico al 70% o etanolo e posizionare il bioreattore sul palco di imaging per ottenere foto e video sia in modalità campo luminoso che fluorescente. Dopo 30 minuti di semina cellulare, infondere un millilitro di terreno di coltura nel lume della trachea ad una portata di un millilitro al minuto. Infine, coltiva la trachea con semi cellulari all'interno del bioreattore in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato.Durante la coltura cellulare, mantenere statico il fluido all'interno del lume, mentre il fluido all'esterno della trachea viene continuamente perfuso attraverso un flusso unidirezionale. Nelle immagini a campo luminoso e fluorescenti della trachea deepitelializzata, nessun segnale fluorescente è stato osservato prima dell'etichettatura CFSE. Con il CFSE, è stato osservato un segnale fluorescente uniforme in tutto l'epitelio.Dopo la deepitelializzazione, l'intensità fluorescente è diminuita in modo significativo, indicando l'ablazione dell'epitelio. La colorazione ematossilina ed eosina della trachea deepitelializzata ha illustrato la rimozione dell'epitelio pseudostratificato dal lume della trachea e la conservazione delle cellule e della matrice extracellulare, o microstrutture ECM, negli strati tissutali sottostanti. Inoltre, la colorazione pentacroma e tricroma ha confermato il mantenimento dell'architettura tissutale tracheale e dei componenti ECM, come collagene e proteoglicani.L'immunofluorescenza delle cellule epiteliali e del collagene I ha rivelato la completa rimozione dell'epitelio e la conservazione del collagene I all'interno del tessuto subepiteliale. Le micrografie elettroniche a scansione indicavano che la trachea nativa era popolata da cellule multicilliate e calici. Nella trachea deepitelializzata, la membrana basale è stata esposta, come indicato da una rete a rete di fibre della matrice extracellulare e dall'assenza di cellule epiteliali.Le immagini di fluorescenza della trachea deepilelializzata, dopo la semina con PBS e collagene, sono mostrate qui. Rispetto alle cellule seminate attraverso il terreno di coltura, le cellule marcate fluorescenti erogate tramite idrogel sono rimaste aderenti in modo più uniforme attraverso il lume. Lo studio di vitalità cellulare ha dimostrato che la vitalità non è stata influenzata dalla procedura di consegna cellulare e oltre il 90% delle cellule è rimasto vitale.La creazione di un sottile film di detergente nel processo di de-epitelizzazione e l'utilizzo dell'idrogel come veicolo di consegna per le cellule sono passaggi essenziali per il successo di questo protocollo. Il nostro prossimo obiettivo di ricerca è quello di impiantare cellule primarie o staminali delle vie aeree coltivate in laboratorio sul tessuto delle vie aeree deepitelializzato per indagare se il tessuto funzionale delle vie aeree può essere preparato.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l&#39;ingegneria tissutale

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Ricerca

Bioingegneria

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

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