Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

이 연구는 미국 흉부 학회 재단 연구 프로그램, 뉴저지 건강 재단 및 국립 과학 재단 (CAREER Award 2143620)이 J.K.에 부분적으로 지원했습니다. 그리고 국립 보건원 (P41 EB027062)에서 G.V.N.

아래의 동물 조직 프로토콜은 스티븐스 공과 대학 (Stevens Institute of Technology)의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 동물 복지 지침 및 규정에 의해 승인되었으며 실험 동물 사용에 대한 NIH (National Institutes of Health) 지침을 준수합니다.
1. 영상 유도 쥐 기관지 생물반응기의 설계 및 시공
<ol><li>쥐 기관 생물반응기의 설계 및 제작<ol>
<li>CAD 생성기 소프트웨어를 사용하?...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+the+epithelium+in+chronic+upper+airways+diseases.">Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).</li><li>Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+function+of+airway+tract+epithelium.">Barrier function of airway tract epithelium.</a> Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).</li><li>De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium+dysfunction+in+cystic+fibrosis+and+COPD.">Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD.</a> Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).</li><li>Horani, A., Ferkol, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+genetics+of+primary+ciliary+dyskinesia:+Clinical+implications.">Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications.</a> Chest. 154 (3), 645-652 (2018).</li><li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis.">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).</li><li>Shrestha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-on-a-chip:+the+future+of+respiratory+disease+models+and+pharmacological+studies.">Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).</li><li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro.">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li><li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pulmonary+cystic+fibrosis+in+a+human+lung+airway-on-a-chip.">Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip.</a> Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).</li><li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Gilpin, S. E., Wagner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+lung+scaffolds+to+model+lung+disease+and+tissue+regeneration.">Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration.</a> European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+lungs+for+transplantation.">Bioengineering lungs for transplantation.</a> Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).</li><li>Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+regeneration:+steps+toward+clinical+implementation+and+use.">Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).</li><li>Planchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).</li><li>Coward, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).</li><li>Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+decellularization+using+a+combination+of+chemical,+physical+and+bioreactor+methods.">Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods.</a> The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).</li><li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds.">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

이 작업에서, 우리는 (i) 세포 제거 및 외인성 세포 전달 후 계내에서 기관 내강의 모니터링과 (ii) 세포 시딩된 기관 조직의 장기 시험관내 배양을 허용할 수 있는 이미징 유도 생물반응기를 만들었습니다. 이 맞춤형 생물반응기를 사용하여, 우리는 (i) 세제 및 진동 보조 기도 세척을 사용하여 기관 내강으로부터 내인성 상피 세포를 선택적으로 제거하고 (ii) 세포가 로딩된 콜라겐 I 프...

호흡기의 발광 표면은 주로 다중 섬모, 클럽, 잔 및 기저 줄기 세포 1,2로 구성된 상피 층으로 줄 지어 있습니다. 상피층은 폐의 주요 방어 메커니즘 역할을하며, 흡입 된 병원균, 미립자 또는 화학 가스로부터 기저기도 조직을 보호하는 생물 물리학 적 장벽 역할을합니다. 그것은 세포 간 단단한 접합 형성, 점액 균 클리어런스, 항균 및 항산화 분비 3,4를 포함한 여러 메커니즘을 통해기도 조직을 보호합니다. 결함이있는기도 상피는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)5, 원발성 섬모 운동 장애 (PCD)6 및 낭포성 섬유증 (CF)7과 같은 치명적인 호흡기 질환과 관련이 있습니다.
폐 온 칩 (LOC) 기술의 발전은 인간의 폐 발달을 연구하고, 다양한 폐 질환을 모델링하고, 엄격하게 조절되는 체외 환경에서 새로운 치료 물질을 개발할 수있는 기회를 나타냅니다. 예를 들어, 기도 상피 및 내피는 폐 조직을 교환하는 가스를 모방하기 위해 얇고 다공성 멤브레인의 반대편에서 배양될 수 있어, 충실한 질병 모델링 및 약물 테스트(8)를 가능하게 한다. 유사하게, 시험관내 질환 모델은 COPD9 및 낭포성 섬유증10과 같은 시험관내 기도 질환을 모델링하기 위해 생성되었다. 그러나, LOC 디바이스의 주요 과제는 시험관내(11)에서 폐 조직 및 동적 세포-조직 매트릭스 상호작용의 복잡한 3차원(3D) 아키텍처를 재반복하는 것이다.
최근에, 생체외 폐 조직(12)의 조작을 허용하는 혁신적인 조직 공학 방법론이 개발되었다. 이들 방법론을 사용하여, 탈착된 동종성 또는 이종 조직 이식편은 화학적, 물리적, 기계적 치료(13)를 통해 폐 조직으로부터 내인성 세포를 제거함으로써 제조될 수 있다. 또한, 탈세포화된 폐 스캐폴드 내의 보존된 천연 조직 세포외 매트릭스(ECM)는 이식된 세포가 부착, 증식 및 분화하기 위한 물리-모방 구조적, 생화학적, 및 생체역학적 단서를 제공한다(14,15).
여기서, 시험 관내 조직 조작 및 삼출된 쥐 기관 조직의 배양을 허용하기 위해 LOC와 조직 공학 기술을 결합하여 만들어진 영상-유도 생물반응기 시스템이 보고된다. 이 기도 조직 생물반응기를 사용하여, 프로토콜은 기도 조직의 근본적인 상피하 세포 및 생화학적 성분을 파괴하지 않으면서 내인성 상피 세포의 선택적 제거를 입증한다. 다음으로 우리는 새로 시딩된 외인성 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포 (MSCs)의 균질한 분포 및 순간적인 침착을 보여주고, 세포가 로딩된 콜라겐 I 프리겔 용액을 주입함으로써 뾰족한 기도 루멘 상에 나타낸다. 또한, 생물반응기에 집적된 미세광학 이미징 장치를 이용함으로써, 상피 제거 및 내인성 세포 전달 동안 기관 내강의 시각화도 행해진다. 또한, 기관 및 새로 이식된 세포는 눈에 띄는 세포 사멸 및 조직 분해 없이 4일 동안 생물반응기에서 배양될 수 있음을 보여준다. 우리는 영상 지원 생물반응기 플랫폼, 박막 기반 탈상피화 기술, 및 본 연구에 사용된 세포 전달 방법이 시험관내 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 기도 조직 생성에 유용할 수 있다고 구상한다.
생물반응기는 프로그램가능한 시린지 펌프, 관류 펌프, 및 분리된 래트 기관을 배양하기 위한 인공호흡기에 연결된 직사각형 챔버를 포함한다. 생물반응기는 기관 또는 조직 배양 챔버에 연결된 입구 및 출구를 특징으로 하여 기관지의 내부 및 외부 공간에 시약(예를 들어, 배양 배지)을 별도로 공급합니다(그림 1). 맞춤형 이미징 시스템을 사용하여 시험 관 내에서 배양된 쥐의 내부를 세포 수준에서 시각화할 수 있습니다(그림 2). 기관지의 내인성 상피는 세제 기반 탈세포화 용액의 점적과 진동 보조 기도 세척을 통해 제거됩니다 (그림 3). 타입 I 콜라겐과 같은 하이드로겔 용액은 외인성 세포를 뾰족한 기관 루멘을 가로질러 균일하고 순간적으로 시딩하기 위한 전달 비히클로서 사용된다(도 4). 생물반응기를 구성하고 실험을 수행하는 데 사용되는 모든 물질은 물질 표에 제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

기도 조직에 대한 반복적 인 손상은 폐 기능을 손상시키고 만성 폐쇄성 폐 질환과 같은 만성 폐 질환을 일으킬 수 있습니다. 재생 의학 및 생물 반응기 기술의 발전은 약물을 스크리닝하고, 질병을 모델링하고, 조직 교체를 엔지니어링하는 데 사용할 수있는 실험실 성장 기능 조직 및 장기 구조물을 생산할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에서, 시험관내 조직 조작 및 배양 동안 외식화된 래트 기관지의 내강을 계내에서 시각화할 수 있게 하는 이미징 양식과 결합된 소형화된 생물반응기가 설명된다. 이 생물반응기를 사용하여, 프로토콜은 기도 조직 매트릭스의 본질적인 생화학적 특징과 울트라구조를 보존하면서 내인성 세포 성분의 영상화 유도 선택적 제거를 입증한다. 더욱이, 계내에서 광학 모니터링을 갖는 탈세포화된 기도 루멘 상의 외인성 세포의 전달, 균일한 분포, 및 후속적인 연장된 배양이 도시된다. 이 결과는 영상-유도된 생물반응기가 잠재적으로 기능적인 시험관내 기도 조직의 생성을 용이하게 하는데 사용될 수 있다는 것을 강조한다.

GRIN 렌즈 기반의 현장 이미징 양식은 현장에서 기관 내부 루멘의 시각화를 허용 할 수 있습니다 (그림 5A). 이 이미징 방법을 사용하면 천연 및 탈상피화 기관의 밝은 필드 및 형광 이미지를 모두 얻을 수 있습니다 (그림 5B, C). CFSE 표지 이전에 천연 기관지로부터 형광 신호가 관찰되지 않았다(도 5Bii). 그러...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

이 프로토콜은 탈상피화 및 기도 조직 재생과 같은 상이한 조직 조작 절차 동안 단리된 기도 조직의 시험관내 배양 및 직접적인 현미경적 시각화를 허용한다. 본 연구에서 제안된 계내 영상화는 내인성 상피의 영상화 유도 조절된 제거 및 외인성 세포의 전달 동안 기관 내강의 신속하고 비파괴적인 모니터링을 가능하게 한다. 영상화-유도된 생체반응성 플랫폼 및 조직 조작 프로토콜은 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 생체공학적 기도 조직을 생성하는데 사용될 수 있다.이미징이 가능한기도 조직 생물 반응기의 건설 및 사용은 우리의 연구 그룹 인 Mohammad Mir와 Jiawen Chen의 두 박사 과정 학생에 의해 입증 될 것입니다. 현장 이미징 장치 제작을 시작하려면 튜브 렌즈를 적층 가능한 렌즈 튜브에 삽입하고 고정 링을 사용하여 고정하십시오. 그런 다음 렌즈 테이블 어셈블리를 C-마운트 어댑터를 통해 과학적인 CMOS 카메라에 장착합니다.Micromanager 소프트웨어를 사용하여 카메라를 작동하고 사진 및 비디오를 획득하십시오. 카메라에서 10m 떨어진 곳에 있는 물체를 조준하는 동안 컴퓨터 화면에 물체의 초점이 맞춰진 이미지가 형성될 때까지 튜브 렌즈와 카메라의 이미징 센서 사이의 거리를 조정하십시오. 그런 다음 조립 로드, 나사식 케이지 플레이트 및 케이지 큐브와 같은 광학 케이지 시스템 구성 요소를 사용하여 이중 에지, 초해상도, 이색성 미러 및 레이저에 필터 렌즈를 장치에 장착합니다.20X 대물 렌즈를 장치에 연결합니다. 그런 다음 X-Y 변환기를 통해 렌즈 튜브의 원위 끝에 직경 500 마이크로 미터의 녹색 렌즈를 장착하십시오. 녹색과 대물 렌즈 사이의 거리를 조정하여 초점을 맞춘 현미경 이미지를 형성합니다.분리된 래트 기관 루멘을 밝은 필드 또는 형광으로 시각화하려면 생물반응기를 이미징 단계에 놓습니다. 다음으로, 갓 제조된 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 또는 CFSE 용액 500 마이크로리터를 기관지 캐뉼라의 튜빙에 연결된 시린지 펌프를 통해 기관지를 통해 분당 5밀리리터의 유속으로 주입한다. CFSE 용액이 기관을 채우면 펌프를 멈추십시오.10분 후, 시린지 펌프를 사용하여 PBS 10 밀리리터를 주입하여 기관 루멘을 세척하여 잔류 비혼입 CFSE 시약을 제거하였다. 세척 후, 녹색 렌즈의 원위 이미징 끝을 기관의 한쪽 끝에 부착 된 루어 커넥터를 통해 기관에 삽입하십시오. 그런 다음 기관 표면이 초점을 맞출 때까지 기관 내부의 녹색 렌즈를 부드럽게 움직입니다.마이크로매니저 소프트웨어에서 밝은 필드 이미지를 캡처하려면 케이지 큐브를 통해 기관강 루멘을 백색광으로 비추십시오. 그런 다음 라이브 아이콘을 클릭하여 기관의 내강 표면을 실시간으로 표시합니다. 이미징 설정 및 노출 탭을 사용하여 노출 시간을 원하는 값으로 변경합니다.이미지의 대비와 밝기를 조정하려면 히스토그램 및 강도 배율 창을 사용하여 대화형 히스토그램 디스플레이의 끝점에서 흑백 화살표를 이동합니다. 라이브 중지를 클릭하여 스냅 아이콘을 활성화한 다음 스냅 아이콘을 클릭하여 이미지를 고정합니다. 그런 다음 이미지를 변위된 탭으로 내보내기 설정을 사용하여 이미지를 원하는 형식으로 저장합니다.형광 모드에서 사진 및 비디오를 얻으려면 케이지 큐브를 통해 CFSE 전용 레이저 광으로 기관 내강을 비추고 이미징 프로브를 앞뒤로 움직여 실시간으로 이미지를 획득하십시오. 사진과 비디오를 얻은 후에는 기관에서 녹색 렌즈를 부드럽게 제거하십시오. 기관지의 탈상피화를 위해, 갓 제조된 2%소듐 도데실 설페이트의 50 마이크로리터를 기관 캐뉼라를 통해 주입하여 기관 내강 상에 세제 용액의 박막을 생성한다.점안 후, 남성 또는 여성 루어 플러그를 사용하여 생물반응기의 튜빙 연결을 닫고 생물반응기를 섭씨 37도 인큐베이터로 10분 동안 옮겨 SDS가 기관 내에 거주할 수 있도록 합니다. 점안을 한 번 반복하십시오. 두 번째 점안 후, 시린지 펌프를 통해 기관 루멘트리스를 분당 10 밀리리터의 유속으로 500 마이크로리터의 PBS로 관개함으로써 용해된 상피 및 SDS를 제거하였다.이어서, 생물반응기를 진탕기 상에 놓아 20 헤르츠의 주파수와 0.3 밀리미터의 변위 진폭으로 기계적으로 진동시켜 기관 내강으로부터 SDS 처리된 상피 세포의 분리를 물리적으로 촉진시킨다. 기관지가 기계적으로 진동하는 동안, 기관 루멘을 통해 500 마이크로리터의 PBS를 두 번 주입하여 잔류 SDS 및 세포 파편을 제거하였다. 상피 제거 후, 그린 렌즈 이미징 장치를 이용하여 CFSE의 강도를 측정하여 상피층의 클리어런스를 평가한다.탈상피화된 래트 기관을 준비한 후, 냉동된 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포를 섭씨 37도 수조에서 30초 동안 해동시켰다. 이어서, 혈구분석기로 세포를 계수하고, 밀리리터 당 여섯 개의 세포에 대해 10배의 농도로 다섯 배의 세포 용액을 제조하였다. 이어서, 세포를 실온에서 두 밀리리터의 100-마이크로몰 CFSE 용액으로 인큐베이션하여 형광으로 표지한다.15분 후, 세포를 5밀리리터의 PBS로 세 번 헹구고, 이를 밀리리터당 7개의 세포에 10회 3회 최종 농도로 신선한 DMEM 배지에 재현탁시킨다. 콜라겐 I 하이드로젤의 제조 직후에, 원고에 기재된 바와 같이, 세포를 원하는 농도로 하이드로겔 용액에 첨가한다. 그 후, 세포와 겔 용액을 마이크로피펫으로 혼합하여 균일한 세포-하이드로겔 혼합물을 얻었다.다음으로, 생물반응기 내의 기관지의 한쪽 끝을 루어 커넥터를 통해 프로그램가능한 시린지 펌프에 부착하고, 5밀리리터의 신선한 배양액을 섭씨 37도의 생물반응기 챔버로 전달하여 기관의 외부 표면을 덮는다. 이어서, 10 마이크로리터의 볼루스 세포-하이드로겔 혼합물을 생물반응기 내 탈상피화된 기관 내로 투여하여 기관 내강 상에 세포-하이드로겔 층을 생성한다. 세포 주입 후, 생물반응기를 섭씨 37도의 멸균 세포 배양 배양기에 넣고 30분 동안 겔화하기 위해 5% 이산화탄소를 넣어 겔화시킨다.이식 된 세포의 분포를 시각화하려면 녹색 렌즈를 70 % 이소프로필 알코올 또는 에탄올로 살균하고 이미징 단계에 생물 반응기를 배치하여 밝은 필드 및 형광 모드에서 사진과 비디오를 얻습니다. 세포 시딩의 30분 후에, 분당 한 밀리리터의 유속으로 기관 루멘에 한 밀리리터의 배양 배지를 주입한다. 마지막으로, 생물반응기 내의 세포-시딩된 기관을 섭씨 37도의 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 배양한다.세포 배양 동안, 배지를 루멘 정적으로 유지하고, 기관 외부의 배지는 단방향 흐름을 통해 지속적으로 관류된다. 탈상피화된 기관의 밝은 필드 및 형광 이미지에서, CFSE 표지 이전에 형광 신호가 관찰되지 않았다. CFSE를 이용하여, 상피 전체에 걸쳐 균일한 형광 신호가 관찰되었다.탈상피화 후, 형광 강도는 유의하게 감소하였고, 이는 상피의 절제를 나타낸다. 탈상피화된 기관지의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 기관 내강으로부터 의사층화된 상피의 제거, 및 기저 조직층에서 세포 및 세포외 기질, 또는 ECM 미세구조의 보존을 예시하였다. 또한, 펜타크롬 및 트리크롬 염색을 통해 콜라겐 및 프로테오글리칸과 같은 기관 조직 구조 및 ECM 성분의 유지를 확인하였다.상피 세포 및 콜라겐 I의 면역형광은 상피의 완전한 제거 및 상피 하부 조직 내의 콜라겐 I의 보존을 밝혀냈다. 주사 전자 현미경 사진은 천연 기관이 다중화 및 잔 세포로 채워져 있음을 나타냈다. 탈상피화된 기관에서, 기저막은 세포외 매트릭스 섬유의 메쉬 네트워크 및 상피 세포의 부재에 의해 지시된 바와 같이 노출되었다.PBS 및 콜라겐으로 시딩시 탈상피화된 기관의 형광 이미지가 여기에 도시되어 있다. 배양 배지를 통해 시딩된 세포와 비교하여, 하이드로겔을 통해 전달된 형광 표지된 세포는 루멘을 가로질러 더 균일하게 부착된 채로 남아있었다. 세포 생존력 연구는 생존력이 세포 전달 절차에 의해 영향을받지 않았으며 90 % 이상의 세포가 생존 가능한 상태로 남아 있음을 보여주었습니다.탈상피화 과정에서 세제의 박막을 만들고 하이드로겔을 세포의 전달 비히클로 사용하는 것은 이 프로토콜의 성공을 위한 필수적인 단계이다. 우리의 다음 연구 목표는 기능성 기도 조직이 준비 될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 실험실에서 재배 한 기도 일차 또는 줄기 세포를 탈상피화 된 기도 조직에 이식하는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

연구

생체공학

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

벤치 탑 생물 반응기의 운전

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

독성 흡입 화학 시험에 대한 시험 관내 세포 배양 모델에서

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해<em&gt; 체외</em&gt;기도 벽의 모델

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

재조합 콜라겐 나 세포 확장과 생물에 셀 납품 시스템으로 그들의 잠재적인 사용에 대 한 펩 티 드 Microcarriers 모델

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

인간 심장 병리학을 연구하기 위하여 체외 생체 공학심장 조직에서와 같이 심장 스페로이드

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

동적 세포 배양을 위한 출구 분별과 통합된 다중 스트림 관류 생물반응기

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...