Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Denne forskningen har delvis blitt støttet av American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation og National Science Foundation (CAREER Award 2143620) til J.K.; og National Institutes of Health (P41 EB027062) til G.V.N.

Dyrevevsprotokollen nedenfor er godkjent av dyrevelferdsretningslinjen og forskriftene til Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Stevens Institute of Technology, og den overholder National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for bruk av eksperimentelle dyr.
1. Design og konstruksjon av bildestyrt rotte luftrør bioreaktor
<ol><li>Betegnelse og fabrikasjon av rotte luftrør bioreaktor<ol>
<li>Lag en CAD-modell (computer-aided design) av bioreaktorkamme...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+the+epithelium+in+chronic+upper+airways+diseases.">Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).</li><li>Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+function+of+airway+tract+epithelium.">Barrier function of airway tract epithelium.</a> Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).</li><li>De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium+dysfunction+in+cystic+fibrosis+and+COPD.">Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD.</a> Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).</li><li>Horani, A., Ferkol, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+genetics+of+primary+ciliary+dyskinesia:+Clinical+implications.">Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications.</a> Chest. 154 (3), 645-652 (2018).</li><li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis.">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).</li><li>Shrestha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-on-a-chip:+the+future+of+respiratory+disease+models+and+pharmacological+studies.">Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).</li><li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro.">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li><li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pulmonary+cystic+fibrosis+in+a+human+lung+airway-on-a-chip.">Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip.</a> Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).</li><li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Gilpin, S. E., Wagner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+lung+scaffolds+to+model+lung+disease+and+tissue+regeneration.">Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration.</a> European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+lungs+for+transplantation.">Bioengineering lungs for transplantation.</a> Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).</li><li>Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+regeneration:+steps+toward+clinical+implementation+and+use.">Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).</li><li>Planchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).</li><li>Coward, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).</li><li>Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+decellularization+using+a+combination+of+chemical,+physical+and+bioreactor+methods.">Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods.</a> The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).</li><li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds.">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

I dette arbeidet opprettet vi en bildestyrt bioreaktor som kan tillate (i) overvåking av luftrøret lumen in situ etter cellefjerning og eksogen cellelevering og (ii) langsiktig in vitrokultur av cellefrø luftrøret vev. Ved hjelp av denne spesialbygde bioreaktoren demonstrerte vi (i) selektiv fjerning av de endogene epitelcellene fra luftrørets lumen ved hjelp av vaskemiddel og vibrasjonsassistert luftveisvask og (ii) jevn fordeling av eksogene celler på lysflaten til den denuderte luftrøret ved h...

Luftveienes lysende overflate er foret av et lag epitel som hovedsakelig består av multi-ciliated, klubb, beger og basale stamceller 1,2. Epitellaget fungerer som en primærforsvarsmekanisme i lungen, og fungerer som en biofysisk barriere som beskytter det underliggende luftveisvevet mot inhalerte patogener, partikler eller kjemiske gasser. Det beskytter luftveisvevet via flere mekanismer, inkludert intercellulær tett koblingsdannelse, mucociliary clearance og antimikrobiell og antioksidant sekresjon 3,4. Det defekte luftveisepitelet er forbundet med ødeleggende luftveissykdommer, som kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS)5, primær ciliary dyskinesi (PCD)6 og cystisk fibrose (CF)7.
Fremskritt innen lunge-på-chip (LOC)-teknologi representerer en mulighet til å studere menneskelig lungeutvikling, modellere ulike lungesykdommer og utvikle nye terapeutiske materialer i tett regulerte in vitro-miljøer . For eksempel kan airway epitel og endotel dyrkes på motsatte sider av en tynn, porøs membran for å etterligne gassen som utveksler lungevev, slik at trofast sykdomsmodellering og legemiddeltesting8. På samme måte er in vitro sykdomsmodeller opprettet for å modellere luftveissykdommer in vitro, som KOLS9 og cystisk fibrose10. Imidlertid er en stor utfordring med LOC-enheter å rekapitulere den komplekse tredimensjonale (3D) arkitekturen til lungevevet og dynamiske cellevevsmatriseinteraksjoner in vitro11.
Nylig har innovative vevsteknikk metoder blitt utviklet som tillater manipulering av ex vivo lungevev12. Ved hjelp av disse metodene kan denuderte allogene eller xenogene vevstransplantasjoner fremstilles ved å fjerne endogene celler fra lungevevet via kjemiske, fysiske og mekaniske behandlinger13. I tillegg gir den bevarte innfødte vevs-ekstracellulære matrisen (ECM) i decellulæriserte lungestillasene de fysio-mimetiske strukturelle, biokjemiske og biomekaniske signalene for implanterte celler for å feste, spre seg og skille14,15.
Her rapporteres et bildestyrt bioreaktorsystem opprettet ved å kombinere LOC- og vevsteknologier for å tillate in vitro vevsmanipulering og kultur av utplantet rottetrakealvev. Ved hjelp av denne luftveisvevbioreaktoren demonstrerer protokollen selektiv fjerning av endogene epitelceller uten å forstyrre de underliggende subepitheliale cellulære og biokjemiske komponentene i luftveisvevet. Vi viser deretter den homogene fordelingen og øyeblikkelig avsetning av de nylig frø eksogene cellene, for eksempel mesenchymale stamceller (MSCs), på denuded airway lumen ved å innpode det cellebelastede kollagenet jeg pre-gel løsning. I tillegg, ved å bruke den mikrooptiske bildeenheten integrert i bioreaktoren, gjøres også visualiseringen av luftrørets lumen under epitelfjerning og endogen cellelevering. Videre er det vist at luftrøret og nylig implanterte celler kan dyrkes i bioreaktoren uten merkbar celledød og vevsforringelse i 4 dager. Vi ser for oss at den bildeaktiverte bioreaktorplattformen, den tynne filmbaserte de-epitelialiseringsteknikken og celleleveringsmetoden som brukes i denne studien, kan være nyttig for å generere luftveisvev for in vitro sykdomsmodellering og legemiddelscreening.
Bioreaktoren inkluderer et rektangulært kammer koblet til en programmerbar sprøytepumpe, perfusjonspumpe og ventilator for dyrking av isolert rottetreksett. Bioreaktoren har innløp og uttak koblet til luftrøret eller vevskulturkammeret for å levere reagenser separat (f.eks. kulturmedier) til de indre og ytre områdene i luftrøret (figur 1). Et spesialbygd bildebehandlingssystem kan brukes til å visualisere det indre av den in vitrokulturerte rotterøret på cellenivå (figur 2). Det endogene epitelet i luftrøret fjernes ved innånding av en vaskemiddelbasert decellulariseringsløsning etterfulgt av vibrasjonsassistert luftveisvask (figur 3). Hydrogelløsning, for eksempel type I kollagen, brukes som leveringskjøretøy for såing av eksogene celler jevnt og øyeblikkelig over den denuded trachea lumen (figur 4). Alle materialene som brukes til å konstruere bioreaktoren og utføre forsøkene er gitt i materialtabellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

Gjentatt skade på luftveisvev kan svekke lungefunksjonen og forårsake kronisk lungesykdom, for eksempel kronisk obstruktiv lungesykdom. Fremskritt innen regenerativ medisin og bioreaktorteknologier gir muligheter til å produsere lab-dyrkede funksjonelle vevs- og organkonstruksjoner som kan brukes til å screene legemidler, modellsykdom og ingeniørvevserstatninger. Her beskrives en miniatyrisert bioreaktor kombinert med en avbildningsmodalitet som tillater in situ visualisering av de indre lumen av utplantet rottetrachea under in vitro vev manipulasjon og kultur. Ved hjelp av denne bioreaktoren demonstrerer protokollen avbildningsstyrt selektiv fjerning av endogene cellulære komponenter samtidig som den bevarer de iboende biokjemiske egenskapene og ultrastrukturen til luftveisvevsmatrisen. Videre vises leveransen, ensartet distribusjon og påfølgende langvarig kultur av eksogene celler på decellulariserte luftveislumenene med optisk overvåking in situ . Resultatene fremhever at den bildestyrte bioreaktoren potensielt kan brukes til å lette genereringen av funksjonelle in vitro luftveisvev.

Grin linsebasert in situ-avbildningsmodalitet kan tillate visualisering av den trakeale indre lumen in situ (figur 5A). Ved hjelp av denne avbildningsmetoden kan både lyse felt og fluorescerende bilder av de innfødte og de-epitelialiserte trakeaene oppnås (figur 5B, C). Det ble ikke observert fluorescerende signal fra den opprinnelige luftrøret før CFSE-merking (figur 5Bii). Men da trakealepit...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Protokollen beskriver en bildeaktivert bioreaktor som tillater selektiv fjerning av det endogene epitelet fra rotterøret og homogen fordeling av eksogene celler på lumenoverflaten, etterfulgt av langsiktig in vitrokultur av cellevevskonstruksjonen.

Bildestyrt bioreaktor for generering av bioingeniør luftveisvev

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Denne protokollen tillater in vitro dyrking og direkte mikroskopisk visualisering av isolert luftveisvev under ulike vevsmanipulasjonsprosedyrer, for eksempel de-epitelisering og luftveisvevregenerering. In situ-avbildningen foreslått i denne studien tillater rask og ikke-destruktiv overvåking av trakeal lumen under avbildningsstyrt kontrollert fjerning av endogene epitel og levering av de eksogene cellene. Den bildestyrte bioreaktive plattformen og vevsmanipuleringsprotokollene kan brukes til å generere bioengineered luftveisvev for sykdomsmodellering og legemiddelscreening.Byggingen og bruken av den bildeaktiverte luftveisvevsbioreaktoren vil bli demonstrert av to ph.d.-studenter fra vår forskningsgruppe, Mohammad Mir og Jiawen Chen. For å begynne å lage in situ bildebehandlingsenhet, sett inn et rørlinse i et linserør som kan stables og fest det ved hjelp av en holdering. Monter deretter linsebordenheten på et vitenskapelig CMOS-kamera via en C-montert adapter.Bruk Micromanager-programvaren til å betjene kameraet og skaffe bilder og videoer. Mens du sikter mot et objekt som er plassert 10 meter fra kameraet, justerer du avstanden mellom rørlinsen og bildesensoren til kameraets fokusbilde dannes på dataskjermen. Deretter bruker du optiske bursystemkomponenter, for eksempel monteringsstang, gjenget burplate og burkube for å montere et filterobjektiv på et dobbeltkantet, superoppløsnings-, dikroisk speil og en laser til enheten.Koble et objektiv på 20X til enheten. Monter deretter en grønn linse med en diameter på 500 mikrometer i den distale enden av linserøret via X-Y-oversetteren. Juster avstanden mellom de grønne og objektive linsene for å danne de fokuserte mikroskopiske bildene.For å visualisere den isolerte rotte luftrøret lumen i lyse felt eller fluorescerende, plasser bioreaktoren på bildestadiet. Fyll deretter 500 mikroliter av den nylagde karboksyfluorescein succinimidylstere, eller CFSE-løsningen, med en strømningshastighet på fem milliliter per minutt gjennom luftrøret via sprøytepumpen koblet til rørene til luftrørkanylen. Når CFSE-løsningen fyller luftrøret, stopp pumpen.Etter 10 minutter, vask luftrørets lumen ved å tilfør 10 milliliter PBS ved hjelp av sprøytepumpen for å fjerne de gjenværende ikke-korporerte CFSE-reagensene. Etter vasken setter du den distale bildeenden av den grønne linsen inn i luftrøret via luerkontakten som er festet til den ene enden av luftrøret. Beveg deretter den grønne linsen forsiktig inne i luftrøret til luftrøret er fokusert.For å fange de lyse feltbildene i mikromanagerprogramvaren, belys luftrøret lumen med hvitt lys gjennom burkuben. Klikk deretter på Live-ikonet for å vise den lumenale overflaten av luftrøret i sanntid. Bruk Imaging-innstillingen og kategoriene Eksponering til å endre eksponeringstiden til ønsket verdi.Hvis du vil justere kontrasten og lysstyrken i bilder, bruker du histogram- og intensitetsskaleringsvinduet til å flytte svarte og hvite piler på sluttpunktet for den interaktive histogramvisningen. Klikk Stopp live for å aktivere Snap-ikonet, og klikk deretter på Snap-ikonet for å fryse bildet. Deretter bruker du innstillingen Eksporter og deretter Bilder som fordrevne faner for å lagre bildene i ønsket format.For å få bilder og videoer i fluorescerende modus, belys luftrørets lumen med CFSE-spesifikt laserlys gjennom burkuben og skaff bildene i sanntid ved å flytte bildesonden frem og tilbake. Når bildene og videoene er hentet, fjerner du forsiktig den grønne linsen fra luftrøret. For av-epitelialisering av luftrøret, innpod 50 mikroliter av de nylagdede 2% natriumdodecylsulfat gjennom luftrørets kanyle for å generere en tynn film av vaskemiddeloppløsningen på luftrørets lumen.Etter innåndingen, lukk bioreaktorens rørforbindelser ved hjelp av mannlige eller kvinnelige luerplugger og overfør bioreaktoren til en 37-graders Celsius inkubator i 10 minutter for å la SDS bo i luftrøret. Gjenta innåndingen én gang. Etter den andre innåndingen, fjern det lysede epitelet og SDS ved å vanne luftrøret lumen tre ganger med 500 mikroliter PBS via sprøytepumpe med en strømningshastighet på 10 milliliter per minutt.Plasser deretter bioreaktoren på en shaker for å mekanisk vibrere med en frekvens på 20 Hertz og en forskyvningsamplitude på 0,3 millimeter for å fysisk fremme løsrivelse av SDS-behandlede epitelceller fra luftrøret lumen. Mens luftrøret er mekanisk vibrert, innpod 500 mikroliter PBS to ganger gjennom luftrøret lumen for å fjerne gjenværende SDS og celle rusk. Etter epitelfjerningen evaluerer du klaringen av epitellaget ved å måle intensiteten til CFSE ved hjelp av den grønne objektivavbildningsenheten.Etter å ha forberedt en de-epitelialisert rotte luftrør, tine frosne mesenchymale stamceller, eller MSCs, i 30 sekunder i et 37-graders Celsius vannbad. Tell deretter cellene med et hemocytometer, etterfulgt av å forberede en celleløsning med en konsentrasjon på fem ganger 10 til de seks cellene per milliliter. Merk deretter cellene fluorescerende ved å inkubere dem med to milliliter 100-mikromolar CFSE-løsning ved romtemperatur.Etter 15 minutter, skyll cellene med fem milliliter PBS tre ganger før du bruker dem på nytt i et friskt DMEM-kulturmedium ved en endelig konsentrasjon på tre ganger 10 til de syv cellene per milliliter. Umiddelbart etter tilberedning av kollagen I hydrogel, som beskrevet i manuskriptet, legg cellene til hydrogeloppløsningen med ønsket konsentrasjon. Bland deretter cellene og geloppløsningen med en mikropipette for å oppnå en jevn celle-hydrogelblanding.Deretter fester du den ene enden av luftrøret i bioreaktoren til en programmerbar sprøytepumpe gjennom en luerkontakt og leverer fem milliliter fersk kulturmedium inn i bioreaktorkammeret ved 37 grader Celsius for å dekke den ytre overflaten av luftrøret. Deretter administrerer du 10 mikroliter bolus av celle-hydrogelblandingen i de-epitelialisert luftrør i bioreaktoren for å generere et cellehydrgellag på luftrøret. Etter celleinjeksjon, plasser bioreaktoren i en steril cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid for gellasjon i 30 minutter for å tillate gellasjon.For å visualisere fordelingen av implanterte celler, steriliser den grønne linsen med 70% isopropylalkohol eller etanol og plasser bioreaktoren på bildestadiet for å få bildene og videoene i både lysfelt og fluorescerende modus. Etter 30 minutter med cellesåing, fyll en milliliter kulturmedium inn i luftrøret lumen med en strømningshastighet på en milliliter per minutt. Til slutt, kultur den cellefrø luftrøret i bioreaktoren i en inkubator ved 37 grader Celsius for ønsket tid.Under cellekulturen holder du mediene inne i lumen statisk, mens medier utenfor luftrøret kontinuerlig perfunderes via en enveisstrøm. I de lyse og fluorescerende bildene av av-epitelialisert luftrør ble det ikke observert noe fluorescerende signal før CFSE-merkingen. Med CFSE ble det observert et jevnt fluorescerende signal gjennom hele epitelet.Etter de-epitelialisering ble fluorescerende intensitet redusert betydelig, noe som indikerer ablasjon av epitelet. Hematoksylin og eosinfarging av de-epitelialisert luftrør illustrerte fjerning av pseudo-stratifisert epitel fra luftrøret lumen, og bevaring av celler og ekstracellulær matrise, eller ECM mikrostrukturer, i underliggende vevslag. Videre bekreftet pentachrome og trichrome farging vedlikehold av luftrør vevsarkitektur og ECM-komponenter, som kollagen og proteoglykaner.Immunfluorescensen av epitelceller og kollagen jeg avslørte fullstendig fjerning av epitelet og bevaring av kollagen I i sub-epitelvevet. Skanningselektronmikrografene indikerte at den innfødte luftrøret var befolket med multicilliated og begerceller. I de-epitelialiserte luftrøret ble kjellermembranen utsatt, som indikert av et mesh-nettverk av ekstracellulære matrisefibre og fravær av epitelceller.Fluorescensbildene av de-epitelialiserte luftrøret, ved såing med PBS og kollagen, vises her. Sammenlignet med cellene som ble sådd via kulturmedium, forble de fluorescerende merkede cellene som ble levert via hydrogel, mer jevnt over lumen. Celle levedyktighetsstudien viste at levedyktighet ikke ble påvirket av celleleveringsprosedyren, og over 90% av cellene forble levedyktige.Å lage en tynn film av vaskemiddel i av-epiteliseringsprosessen og bruke hydrogel som leveringskjøretøy for celler er viktige trinn for suksessen til denne protokollen. Vårt neste forskningsmål er å implantere lab-dyrket luftveis primær eller stamcelle på av-epitelialisert luftveisvev for å undersøke om funksjonell luftveisvev kan tilberedes.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Design av en Biaxial Mekanisk belastning bioreaktor for Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidic pikoliter bioreaktor for Microbial Encellede Analyse: Fabrikasjon, System Setup, og drift

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Drift av en Benkeplate bioreaktor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhalert Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tilpasning av electro prosess for å gi tre unike miljøer for en Tri-lag<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generering av MGP-avledet Mouse Airway Epitelceller Bruke Decellularized Lung Stillas

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetisk Stem Cell Aggregation og bioreaktor Modning for Brusk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Rekombinant kollagen I peptid Microcarriers for celleutvidelse og deres mulige bruk som cellen levering System i en Bioreactor modellen

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Hjertesfæroider som in vitro bioingeniør hjertevev for å studere humant hjerte patofysiologi

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Multi-Stream perfusjonsbioreaktor integrert med utløpsfraksjonering for dynamisk cellekultur

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...