Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Это исследование было частично поддержано Исследовательской программой Фонда Американского торакального общества, Фондом здравоохранения Нью-Джерси и Национальным научным фондом (CAREER Award 2143620). и Национальные институты здравоохранения (P41 EB027062) - G.V.N.

Приведенный ниже протокол по тканям животных был одобрен руководством по благополучию животных и правилами Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Технологическом институте Стивенса и соответствует руководящим принципам Национального института здравоохранения (NIH) по испо...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+the+epithelium+in+chronic+upper+airways+diseases.">Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).</li><li>Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+function+of+airway+tract+epithelium.">Barrier function of airway tract epithelium.</a> Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).</li><li>De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium+dysfunction+in+cystic+fibrosis+and+COPD.">Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD.</a> Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).</li><li>Horani, A., Ferkol, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+genetics+of+primary+ciliary+dyskinesia:+Clinical+implications.">Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications.</a> Chest. 154 (3), 645-652 (2018).</li><li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis.">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).</li><li>Shrestha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-on-a-chip:+the+future+of+respiratory+disease+models+and+pharmacological+studies.">Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).</li><li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro.">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li><li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pulmonary+cystic+fibrosis+in+a+human+lung+airway-on-a-chip.">Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip.</a> Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).</li><li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Gilpin, S. E., Wagner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+lung+scaffolds+to+model+lung+disease+and+tissue+regeneration.">Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration.</a> European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+lungs+for+transplantation.">Bioengineering lungs for transplantation.</a> Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).</li><li>Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+regeneration:+steps+toward+clinical+implementation+and+use.">Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).</li><li>Planchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).</li><li>Coward, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).</li><li>Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+decellularization+using+a+combination+of+chemical,+physical+and+bioreactor+methods.">Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods.</a> The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).</li><li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds.">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

В этой работе мы создали биореактор с визуальным контролем, который может позволить (i) мониторинг просвета трахеи in situ после удаления клеток и доставки экзогенных клеток и (ii) долгосрочную культуру in vitro ткани трахеи, засеянной клетками. Используя этот специально разработанны?...

Просветная поверхность дыхательных путей выстлана слоем эпителия, который в основном состоит из мультиреснитильных, клубных, бокаловидных и базальных стволовых клеток 1,2. Эпителиальный слой служит основным защитным механизмом легкого, действуя как биофизический барьер, который защищает подлежащую ткань дыхательных путей от вдыхаемых патогенов, частиц или химических газов. Он защищает ткань дыхательных путей с помощью нескольких механизмов, включая образование межклеточных плотных соединений, мукоцилиарный клиренс и антимикробную и антиоксидантную секрецию 3,4. Дефектный эпителий дыхательных путей связан с разрушительными респираторными заболеваниями, такими как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ)5, первичная цилиарная дискинезия (PCD)6 и муковисцидоз (CF)7.
Достижения в технологии «легкие на чипе» (LOC) представляют собой возможность изучать развитие легких человека, моделировать различные заболевания легких и разрабатывать новые терапевтические материалы в жестко регулируемых средах in vitro . Например, эпителий дыхательных путей и эндотелий могут быть культивированы на противоположных сторонах тонкой пористой мембраны, чтобы имитировать газообменную легочную ткань, что позволяет точно моделировать заболевание и тестировать лекарства8. Аналогичным образом, модели заболеваний in vitro были созданы для моделирования заболеваний дыхательных путей in vitro, таких как ХОБЛ9 и муковисцидоз10. Однако основной проблемой устройств LOC является повторение сложной трехмерной (3D) архитектуры легочной ткани и динамических матричных взаимодействий между клетками и тканями in vitro11.
В последнее время были разработаны инновационные методологии тканевой инженерии, которые позволяют манипулировать тканями легких ex vivo 12. Используя эти методологии, оголенные аллогенные или ксеногенные тканевые трансплантаты могут быть получены путем удаления эндогенных клеток из легочной ткани с помощью химической, физической и механическойобработки 13. Кроме того, сохраненный нативный тканевый внеклеточный матрикс (ECM) в децеллюляризованных каркасах легких обеспечивает физио-миметические структурные, биохимические и биомеханические сигналы для имплантированных клеток для прикрепления, пролиферации и дифференцировки14,15.
Здесь сообщается о системе биореакторов с визуальным контролем, созданной путем объединения технологий LOC и тканевой инженерии, чтобы позволить манипулировать тканями in vitro и культивировать эксплантированные ткани трахеи крыс. Используя этот биореактор тканей дыхательных путей, протокол демонстрирует селективное удаление эндогенных эпителиальных клеток без нарушения нижележащих субэпителиальных клеточных и биохимических компонентов ткани дыхательных путей. Далее мы показываем однородное распределение и мгновенное осаждение вновь посеянных экзогенных клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (МСК), на оголенный просвет дыхательных путей путем закапывания клеточного раствора коллагена I. Кроме того, с помощью микрооптического устройства визуализации, интегрированного в биореактор, также выполняется визуализация просвета трахеи при удалении эпителия и доставке эндогенных клеток. Далее показано, что трахею и вновь имплантированные клетки можно культивировать в биореакторе без заметной гибели клеток и деградации тканей в течение 4 дней. Мы предполагаем, что платформа биореактора с поддержкой визуализации, метод деэпителизации на основе тонкой пленки и метод доставки клеток, используемый в этом исследовании, могут быть полезны для создания тканей дыхательных путей для моделирования заболеваний in vitro и скрининга лекарств.
Биореактор включает в себя прямоугольную камеру, соединенную с программируемым шприцевым насосом, перфузионный насос и вентилятор для культивирования изолированной трахеи крысы. Биореактор имеет входы и выходы, соединенные с трахеей или камерой культуры тканей, для отдельной подачи реагентов (например, питательных сред) во внутреннее и внешнее пространства трахеи (рисунок 1). Специально разработанная система визуализации может быть использована для визуализации внутренней части трахеи крысиной культуры in vitro на клеточном уровне (рисунок 2). Эндогенный эпителий трахеи удаляется путем закапывания раствора для децеллюляризации на основе моющего средства с последующим вибрационным промыванием дыхательных путей (рисунок 3). Раствор гидрогеля, такой как коллаген I типа, используется в качестве средства доставки для равномерного и мгновенного посева экзогенных клеток через оголенный просвет трахеи (рисунок 4). Все материалы, используемые для построения биореактора и проведения экспериментов, приведены в Таблице материалов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

Повторное повреждение тканей дыхательных путей может ухудшить функцию легких и вызвать хроническое заболевание легких, такое как хроническая обструктивная болезнь легких. Достижения в области регенеративной медицины и технологий биореакторов предлагают возможности для производства выращенных в лаборатории функциональных тканей и структур органов, которые могут быть использованы для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и инженерных замен тканей. Здесь описан миниатюрный биореактор в сочетании с модальностью визуализации, которая позволяет in situ визуализировать внутренний просвет эксплантированной трахеи крысы во время манипуляций с тканями in vitro и культивирования. Используя этот биореактор, протокол демонстрирует селективное удаление эндогенных клеточных компонентов с помощью визуализации при сохранении внутренних биохимических особенностей и ультраструктуры тканевого матрикса дыхательных путей. Кроме того, показаны доставка, равномерное распределение и последующая длительная культивирование экзогенных клеток на децеллюляризированном просвете дыхательных путей с оптическим мониторингом in situ . Результаты подчеркивают, что биореактор под визуальным контролем потенциально может быть использован для облегчения генерации функциональных тканей дыхательных путей in vitro .

Метод визуализации in situ на основе линзЫ GRIN может позволить визуализацию внутреннего просвета трахеи in situ (рисунок 5A). С помощью этого метода визуализации можно получить как ярко-полевые, так и флуоресцентные изображения нативной и деэпителизированной трахеи (<...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Протокол описывает биореактор с поддержкой визуализации, который позволяет селективно удалять эндогенный эпителий из трахеи крыс и гомогенное распределение экзогенных клеток на поверхности просвета с последующим долгосрочным посевом in vitro клеточно-тканевой конструкции.

Биореактор с визуальным контролем для создания биоинженерной ткани дыхательных путей

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Этот протокол позволяет культивировать in vitro и прямую микроскопическую визуализацию изолированных тканей дыхательных путей во время различных процедур тканевых манипуляций, таких как деэпителизация и регенерация тканей дыхательных путей. Визуализация in situ, предложенная в этом исследовании, позволяет осуществлять быстрый и неразрушающий мониторинг просвета трахеи во время контролируемого удаления эндогенного эпителия под визуальным контролем и доставки экзогенных клеток. Биореактивная платформа с визуальным контролем и протоколы манипуляций с тканями могут быть использованы для создания биоинженерной ткани дыхательных путей для моделирования заболеваний и скрининга лекарств.Конструкция и использование биореактора тканей дыхательных путей с поддержкой визуализации будут продемонстрированы двумя аспирантами из нашей исследовательской группы, Мохаммадом Миром и Цзявеном Ченом. Чтобы начать создание устройства визуализации in situ, вставьте трубчатую линзу в штабелируемую линзовую трубку и закрепите ее с помощью стопорного кольца. Затем установите стол объектива в сборе на научную КМОП-камеру с помощью адаптера C-mount.Используйте программное обеспечение Micromanager для управления камерой и получения фотографий и видео. При прицеливании к объекту, расположенному в 10 метрах от камеры, регулируйте расстояние между ламповым объективом и датчиком изображения камеры до тех пор, пока на экране компьютера не будет сформировано сфокусированное изображение объекта. Затем используйте компоненты системы оптического сепаратора, такие как сборочный стержень, резьбовая пластина клетки и куб клетки, для установки фильтрующей линзы на двухгранную, дихроичное зеркало сверхвысокого разрешения и лазер к устройству.Подключите объектив 20X к устройству. Затем установите зеленый объектив диаметром 500 микрометров на дистальном конце трубки объектива через транслятор X-Y. Отрегулируйте расстояние между зелеными линзами и объективами, чтобы сформировать сфокусированные микроскопические изображения.Чтобы визуализировать изолированный просвет трахеи крыс в ярком поле или флуоресцентном, поместите биореактор на стадию визуализации. Затем вводят 500 микролитров свежеприготовленного карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира, или раствора CFSE, со скоростью потока пять миллилитров в минуту через трахею через шприцевой насос, соединенный с трубкой канюли трахеи. Как только раствор CFSE заполнит трахею, остановите насос.Через 10 минут промыть просвет трахеи, влив 10 миллилитров PBS с помощью шприцевого насоса для удаления остаточных невключенных реагентов CFSE. После промывки вставьте дистальный конец зеленой линзы в трахею через разъем luer, прикрепленный к одному концу трахеи. Затем осторожно переместите зеленую линзу внутрь трахеи до тех пор, пока поверхность трахеи не будет сфокусирована.Чтобы захватить изображения яркого поля в программном обеспечении микроменеджера, осветите просвет трахеи белым светом через куб клетки. Затем нажмите на значок Live, чтобы показать просветную поверхность трахеи в режиме реального времени. Вкладки Параметры изображения и Экспозиция используются для изменения времени экспозиции до требуемого значения.Чтобы настроить контрастность и яркость изображений, используйте окно гистограммы и масштабирования интенсивности для перемещения черно-белых стрелок в конечную точку интерактивного отображения гистограммы. Нажмите Stop Live, чтобы активировать значок Snap, затем нажмите на значок Snap, чтобы заморозить изображение. Затем используйте настройку Экспорт, затем Изображения как перемещенные вкладки, чтобы сохранить изображения в нужном формате.Чтобы получить фотографии и видео в флуоресцентном режиме, освещайте просвет трахеи лазерным светом CFSE через куб клетки и получайте изображения в режиме реального времени, перемещая зонд визуализации вперед и назад. Как только фотографии и видео будут получены, аккуратно снимите зеленую линзу с трахеи. Для деэпителизации трахеи закапывают 50 микролитров свежеприготовленного 2%-го додецилсульфата натрия через канюлю трахеи с образованием тонкой пленки раствора моющего средства на просвете трахеи.После закапывания закройте соединения трубк биореактора с помощью мужских или женских пробок и перенесите биореактор в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы SDS обитал в трахее. Повторите закапывание один раз. После второй закапывания удаляют лизированный эпителий и SDS путем орошения просвета трахеи трижды 500 микролитрами PBS через шприцевой насос со скоростью потока 10 миллилитров в минуту.Затем поместите биореактор на шейкер для механической вибрации с частотой 20 Гц и амплитудой смещения 0,3 миллиметра, чтобы физически способствовать отслоению эпителиальных клеток, обработанных SDS, от просвета трахеи. Пока трахея механически вибрирует, закапывайте 500 микролитров PBS дважды через просвет трахеи, чтобы удалить остаточный SDS и клеточный мусор. После удаления эпителия оцените клиренс эпителиального слоя, измерив интенсивность CFSE с помощью устройства визуализации зеленой линзы.После приготовления деэпителизированной трахеи крысы разморозьте замороженные мезенхимальные стволовые клетки, или МСК, в течение 30 секунд на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия. Затем подсчитывают клетки гемоцитометром с последующим приготовлением клеточного раствора с концентрацией от пяти раз 10 до шести клеток на миллилитр. Затем метьте клетки флуоресцентно, инкубируя их двумя миллилитрами 100-микромолярного раствора CFSE при комнатной температуре.Через 15 минут промыть клетки пятью миллилитрами PBS три раза, прежде чем повторно использовать их в свежей культуральной среде DMEM в конечной концентрации от трех раз 10 до семи клеток на миллилитр. Сразу после приготовления коллагена I гидрогеля, как описано в рукописи, добавляют клетки в раствор гидрогеля с нужной концентрацией. Затем смешайте клетки и раствор геля с микропипеткой для получения однородной клеточно-гидрогелевой смеси.Затем присоедините один конец трахеи внутри биореактора к программируемому шприцевому насосу через соединитель luer и доставьте пять миллилитров свежей питательной среды в камеру биореактора при 37 градусах Цельсия, чтобы покрыть внешнюю поверхность трахеи. Затем вводят 10 микролитров болюса клеточно-гидрогелевой смеси в деэпителизированную трахею внутри биореактора для создания клеточно-гидрогелевого слоя на просвете трахеи. После инъекции клетки поместите биореактор в инкубатор стерильной клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа для геллации в течение 30 минут, чтобы обеспечить гелляцию.Чтобы визуализировать распределение имплантированных клеток, стерилизуйте зеленую линзу 70% изопропиловым спиртом или этанолом и поместите биореактор на стадию визуализации для получения фотографий и видео как в ярко-полевом, так и в флуоресцентном режимах. После 30 минут посева клеток вводят один миллилитр питательной среды в просвет трахеи со скоростью потока один миллилитр в минуту. Наконец, культивируйте клеточную трахею внутри биореактора в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение желаемого времени.Во время клеточной культуры держите среду внутри просвета статичной, в то время как среда вне трахеи непрерывно перфузируется однонаправленным потоком. На ярко-полевых и флуоресцентных изображениях деэпителизированной трахеи до маркировки CFSE флуоресцентный сигнал не наблюдался. При CFSE во всем эпителии наблюдался равномерный флуоресцентный сигнал.После деэпителизации интенсивность флуоресцентности значительно снизилась, что свидетельствует об абляции эпителия. Окрашивание гематоксилином и эозином деэпителизированной трахеи проиллюстрировало удаление псевдостратифицированного эпителия из просвета трахеи и сохранение клеток и внеклеточного матрикса, или микроструктур ECM, в нижележащих слоях ткани. Кроме того, окрашивание пентахромом и трихромом подтвердило сохранение архитектуры ткани трахеи и компонентов ECM, таких как коллаген и протеогликаны.Иммунофлуоресценция эпителиальных клеток и коллагена I выявила полное удаление эпителия и сохранение коллагена I в субэпителиальной ткани. Сканирующие электронные микроснимки показали, что нативная трахея была заселена мультициллированными и бокалевыми клетками. В деэпителиализованной трахее обнажали базальную мембрану, о чем свидетельствует сетка из волокон внеклеточного матрикса и отсутствие эпителиальных клеток.Флуоресцентные изображения деэпителизированной трахеи при посеве PBS и коллагеном показаны здесь. По сравнению с клетками, посеянными через культуральную среду, флуоресцентно меченые клетки, доставленные через гидрогель, оставались более равномерно приклеенными по всему просвету. Исследование жизнеспособности клеток показало, что процедура доставки клеток не влияет на жизнеспособность, и более 90% клеток остаются жизнеспособными.Создание тонкой пленки моющего средства в процессе деэпителизации и использование гидрогеля в качестве средства доставки для клеток являются важными шагами для успеха этого протокола. Нашей следующей целью исследования является имплантация выращенных в лаборатории первичных или стволовых клеток дыхательных путей в деэпителиализованную ткань дыхательных путей, чтобы выяснить, можно ли подготовить функциональную ткань дыхательных путей.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Дизайн двухосных механических биореактор загрузка для тканевой инженерии

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Эксплуатация настольной биореактора

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

В пробирке клеточных культур модели для токсичных ингаляционной химической тестирования

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Адаптация процесса электропрядения чтобы обеспечить три уникальных условиях для Tri-слоистые<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель дыхательных путях стены

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Генерация ESC происхождения мыши эпителиальных клеток дыхательных путей с использованием легких Decellularized Строительные леса

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Aggregation и биореактор Созревание для регенерации хряща

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Рекомбинатные коллаген я пептидные Microcarriers для расширения клеток и их потенциального использования в качестве системы доставки клеток в биореакторе модель

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Сердечные сфероиды как в пробирке Биоинженерные ткани сердца для изучения патофизиологии сердца человека

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Многопоточный перфузионный биореактор, интегрированный с фракционированием на выходе для динамической клеточной культуры

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...