Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Esta investigación ha sido apoyada en parte por el Programa de Investigación de la Fundación de la Sociedad Torácica Americana, la Fundación de Salud de Nueva Jersey y la Fundación Nacional de Ciencias (Premio CAREER 2143620) a J.K.; y los Institutos Nacionales de Salud (P41 EB027062) a G.V.N.

El protocolo de tejido animal a continuación ha sido aprobado por la guía de bienestar animal y las regulaciones del Comité del Instituto para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto de Tecnología Stevens, y cumple con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el uso de animales de experimentación.
1. Diseño y construcción de biorreactor de tráquea de rata guiado por imágenes
<ol><li>Diseño y fabricación de biorreactor de tráquea de...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

En este trabajo, creamos un biorreactor guiado por imágenes que puede permitir (i) el monitoreo de la luz de la tráquea in situ después de la eliminación celular y la entrega de células exógenas y (ii) el cultivo in vitro a largo plazo del tejido de la tráquea con semilla celular. Utilizando este biorreactor personalizado, demostramos (i) la eliminación selectiva de las células epiteliales endógenas de la luz de la tráquea utilizando detergente y lavado de las vías respiratorias asistido por...

La superficie luminal del tracto respiratorio está revestida por una capa de epitelio que consiste principalmente en células madre multiciliadas, garrote, copa ybasales 1,2. La capa epitelial sirve como un mecanismo de defensa primario del pulmón, actuando como una barrera biofísica que protege el tejido subyacente de las vías respiratorias contra patógenos inhalados, partículas o gases químicos. Protege el tejido de las vías respiratorias a través de múltiples mecanismos, incluida la formación de uniones estrechas intercelulares, el aclaramiento mucociliar y la secreción antimicrobiana y antioxidante 3,4. El epitelio defectuoso de las vías respiratorias se asocia con enfermedades respiratorias devastadoras, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)5, la discinesia ciliar primaria (PCD)6 y la fibrosis quística (FQ)7.
Los avances en la tecnología lung-on-chip (LOC) representan una oportunidad para estudiar el desarrollo pulmonar humano, modelar diversas enfermedades pulmonares y desarrollar nuevos materiales terapéuticos en entornos in vitro estrechamente regulados. Por ejemplo, el epitelio y el endotelio de las vías respiratorias se pueden cultivar en lados opuestos de una membrana delgada y porosa para imitar el tejido pulmonar que intercambia gases, lo que permite un modelado fiel de la enfermedad y pruebas de drogas8. Del mismo modo, se han creado modelos de enfermedades in vitro para modelar enfermedades de las vías respiratorias in vitro, como la EPOC9 y la fibrosis quística10. Sin embargo, un desafío importante de los dispositivos LOC es recapitular la compleja arquitectura tridimensional (3D) del tejido pulmonar y las interacciones dinámicas de la matriz célula-tejido in vitro11.
Recientemente, se han desarrollado metodologías innovadoras de ingeniería de tejidos que permiten la manipulación de tejidos pulmonares ex vivo 12. Utilizando estas metodologías, se pueden preparar injertos de tejido alogénico o xenogénico desnudo mediante la eliminación de las células endógenas del tejido pulmonar a través de tratamientos químicos, físicos y mecánicos13. Además, la matriz extracelular (ECM) de tejido nativo preservado en los andamios pulmonares descelularizados proporciona las señales estructurales, bioquímicas y biomecánicas fisio-miméticas para que las células implantadas se adhieran, proliferen y diferencien14,15.
Aquí, se informa de un sistema de biorreactor guiado por imágenes creado mediante la combinación de LOC y tecnologías de ingeniería de tejidos para permitir la manipulación y el cultivo de tejidos traqueales de ratas explantados. Utilizando este biorreactor de tejido de las vías respiratorias, el protocolo demuestra la eliminación selectiva de las células epiteliales endógenas sin interrumpir los componentes celulares y bioquímicos subepiteliales subyacentes del tejido de las vías respiratorias. A continuación, mostramos la distribución homogénea y la deposición instantánea de las células exógenas recién sembradas, como las células madre mesenquimales (MSC), en la luz de las vías respiratorias desnudas mediante la inculcación de la solución pre-gel de colágeno I cargada de células. Además, mediante el uso del dispositivo de imagen microóptica integrado en el biorreactor, también se realiza la visualización de la luz de la tráquea durante la eliminación del epitelio y la administración endógena de células. Además, se demuestra que la tráquea y las células recién implantadas se pueden cultivar en el biorreactor sin muerte celular notable y degradación tisular durante 4 días. Prevemos que la plataforma de biorreactores habilitada para imágenes, la técnica de deseptelización basada en película delgada y el método de administración celular utilizado en este estudio pueden ser útiles para generar tejidos de las vías respiratorias para el modelado de enfermedades in vitro y la detección de fármacos.
El biorreactor incluye una cámara rectangular conectada a una bomba de jeringa programable, una bomba de perfusión y un ventilador para el cultivo de tráquea de rata aislada. El biorreactor cuenta con entradas y salidas conectadas a la tráquea o a la cámara de cultivo de tejidos para suministrar por separado reactivos (por ejemplo, medios de cultivo) a los espacios internos y externos de la tráquea (Figura 1). Se puede utilizar un sistema de imágenes personalizado para visualizar el interior de la tráquea de rata cultivada in vitro a nivel celular (Figura 2). El epitelio endógeno de la tráquea se elimina mediante la instilación de una solución de descelularización a base de detergente seguida de un lavado de las vías respiratorias asistido por vibración (Figura 3). La solución de hidrogel, como el colágeno tipo I, se utiliza como vehículo de entrega para sembrar células exógenas de manera uniforme e instantánea a través de la luz de la tráquea desnuda (Figura 4). Todos los materiales utilizados para construir el biorreactor y realizar los experimentos se proporcionan en la Tabla de Materiales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

La lesión repetida del tejido de las vías respiratorias puede afectar la función pulmonar y causar enfermedad pulmonar crónica, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Los avances en medicina regenerativa y tecnologías de biorreactores ofrecen oportunidades para producir tejidos funcionales cultivados en laboratorio y construcciones de órganos que se pueden usar para detectar medicamentos, modelar enfermedades y diseñar reemplazos de tejidos. Aquí, se describe un biorreactor miniaturizado junto con una modalidad de imagen que permite la visualización in situ de la luz interna de la tráquea de rata explantada durante la manipulación y el cultivo de tejidos in vitro . Utilizando este biorreactor, el protocolo demuestra la eliminación selectiva guiada por imágenes de componentes celulares endógenos al tiempo que preserva las características bioquímicas intrínsecas y la ultraestructura de la matriz de tejido de las vías respiratorias. Además, se muestra la entrega, distribución uniforme y posterior cultivo prolongado de células exógenas en la luz de la vía aérea descelularizada con monitorización óptica in situ . Los resultados destacan que el biorreactor guiado por imágenes se puede utilizar potencialmente para facilitar la generación de tejidos funcionales in vitro de las vías respiratorias.

La modalidad de imagen in situ basada en lente GRIN puede permitir la visualización de la luz interna traqueal in situ (Figura 5A). Utilizando este método de imagen, se pueden obtener imágenes de campo brillante y fluorescentes de las tráqueas nativas y desepitelizadas (Figura 5B, C). No se observó ninguna señal fluorescente de la tráquea nativa antes del etiquetado CFSE (Figura 5Bii). Sin e...

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Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

El protocolo describe un biorreactor habilitado para imágenes que permite la eliminación selectiva del epitelio endógeno de la tráquea de la rata y la distribución homogénea de las células exógenas en la superficie de la luz, seguido de un cultivo in vitro a largo plazo de la construcción célula-tejido.

Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Este protocolo permite el cultivo in vitro y la visualización microscópica directa de los tejidos aislados de las vías respiratorias durante diferentes procedimientos de manipulación tisular, como la desepitelización y la regeneración del tejido de las vías respiratorias. La imagen in situ propuesta en este estudio permite un monitoreo rápido y no destructivo de la luz traqueal durante la eliminación controlada guiada por imágenes del epitelio endógeno y la entrega de las células exógenas. La plataforma biorreactiva guiada por imágenes y los protocolos de manipulación de tejidos se pueden utilizar para generar tejido de las vías respiratorias de bioingeniería para el modelado de enfermedades y la detección de fármacos.La construcción y el uso del biorreactor de tejido de las vías respiratorias habilitado para imágenes serán demostrados por dos estudiantes de doctorado de nuestro grupo de investigación, Mohammad Mir y Jiawen Chen. Para comenzar a crear un dispositivo de imágenes in situ, inserte una lente de tubo en un tubo de lente apilable y asegúrela con un anillo de retención. A continuación, monte el conjunto de la mesa de lentes en una cámara CMOS científica a través de un adaptador de montura C.Utilice el software Micromanager para operar la cámara y adquirir fotos y videos. Mientras apunta a un objeto ubicado a 10 metros de la cámara, ajuste la distancia entre la lente del tubo y el sensor de imagen de la cámara hasta que se forme una imagen enfocada del objeto en la pantalla de la computadora. A continuación, use componentes del sistema de jaula óptica, como la varilla de ensamblaje, la placa de jaula roscada y el cubo de jaula para montar una lente de filtro en un espejo dicroico de doble borde, superresolución y un láser para el dispositivo.Conecte una lente de objetivo 20X al dispositivo. Luego, monte una lente verde con un diámetro de 500 micrómetros en el extremo distal del tubo de la lente a través del traductor X-Y. Ajuste la distancia entre las lentes verdes y las del objetivo para formar las imágenes microscópicas enfocadas.Para visualizar la luz aislada de la tráquea de la rata en campo brillante o fluorescente, coloque el biorreactor en la etapa de imagen. A continuación, infunda 500 microlitros del éster de succinimidil carboxifluoresceína recién preparado, o solución CFSE, a un caudal de cinco mililitros por minuto a través de la tráquea a través de la bomba de jeringa conectada al tubo de la cánula de la tráquea. Una vez que la solución CFSE llene la tráquea, detenga la bomba.Después de 10 minutos, lave la luz de la tráquea infundiendo 10 mililitros de PBS usando la bomba de jeringa para eliminar los reactivos CFSE residuales no incorporados. Después del lavado, inserte el extremo de imagen distal de la lente verde en la tráquea a través del conector luer conectado a un extremo de la tráquea. Luego, mueva suavemente la lente verde dentro de la tráquea hasta que la superficie de la tráquea esté enfocada.Para capturar las imágenes de campo brillante en el software micromanager, ilumine la luz de la tráquea con luz blanca a través del cubo de la jaula. Luego, haga clic en el icono Live para mostrar la superficie lumenal de la tráquea en tiempo real. Utilice la configuración de imágenes y las fichas Exposición para cambiar el tiempo de exposición al valor deseado.Para ajustar el contraste y el brillo de las imágenes, utilice la ventana de escalado de histograma e intensidad para mover las flechas en blanco y negro en el punto final de la pantalla interactiva del histograma. Haga clic en Detener activación para activar el icono Snap y, a continuación, haga clic en el icono Snap para congelar la imagen. A continuación, use la configuración Exportar y luego las pestañas Imágenes como desplazadas para guardar las imágenes en el formato deseado.Para obtener fotos y videos en modo fluorescente, ilumine la luz de la tráquea con luz láser específica de CFSE a través del cubo de la jaula y adquiera las imágenes en tiempo real moviendo la sonda de imágenes hacia adelante y hacia atrás. Una vez que se obtengan las fotos y los videos, retire suavemente la lente verde de la tráquea. Para la desepitelización de la tráquea, instile 50 microlitros del dodecil sulfato de sodio recién preparado al 2% a través de la cánula de la tráquea para generar una película delgada de la solución detergente en la luz de la tráquea.Después de la instilación, cierre las conexiones de los tubos del biorreactor con tapones luer machos o hembras y transfiera el biorreactor a una incubadora de 37 grados Celsius durante 10 minutos para permitir que el SDS habite dentro de la tráquea. Repita la instilación una vez. Después de la segunda instilación, retire el epitelio lisado y la SDS regando la luz de la tráquea tres veces con 500 microlitros de PBS a través de una bomba de jeringa a una velocidad de flujo de 10 mililitros por minuto.Luego, coloque el biorreactor en un agitador para vibrar mecánicamente a una frecuencia de 20 Hertz y una amplitud de desplazamiento de 0,3 milímetros para promover físicamente el desprendimiento de las células epiteliales tratadas con SDS de la luz de la tráquea. Mientras la tráquea vibra mecánicamente, instila 500 microlitros de PBS dos veces a través de la luz de la tráquea para eliminar el SDS residual y los desechos celulares. Después de la eliminación del epitelio, evalúe el aclaramiento de la capa epitelial midiendo la intensidad del CFSE utilizando el dispositivo de imágenes de lente verde.Después de preparar una tráquea de rata deseptelizada, descongele las células madre mesenquimales congeladas, o MSC, durante 30 segundos en un baño de agua de 37 grados centígrados. Luego, cuente las células con un hemocitómetro, seguido de preparar una solución celular con una concentración de cinco veces 10 a las seis células por mililitro. Luego, etiquete las células fluorescentemente incubándolas con dos mililitros de solución CFSE de 100 micromolares a temperatura ambiente.Después de 15 minutos, enjuague las células con cinco mililitros de PBS tres veces antes de volver a depositarlas en un medio de cultivo DMEM fresco a una concentración final de tres veces 10 a las siete células por mililitro. Inmediatamente después de la preparación del hidrogel de colágeno I, como se describe en el manuscrito, agregue las células a la solución de hidrogel con la concentración deseada. Luego, mezcle las células y la solución de gel con una micropipeta para obtener una mezcla uniforme de célula e hidrogel.A continuación, conecte un extremo de la tráquea dentro del biorreactor a una bomba de jeringa programable a través de un conector luer y entregue cinco mililitros de medio de cultivo fresco en la cámara del biorreactor a 37 grados Celsius para cubrir la superficie exterior de la tráquea. Luego, administre 10 bolos de microlitros de la mezcla de célula e hidrogel en la tráquea desepitelizada dentro del biorreactor para generar una capa de célula e hidrogel en la luz de la tráquea. Después de la inyección celular, coloque el biorreactor en una incubadora de cultivo celular estéril a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para la gotellación durante 30 minutos para permitir la gotellación.Para visualizar la distribución de las células implantadas, esterilize la lente verde con alcohol isopropílico o etanol al 70% y coloque el biorreactor en el escenario de imágenes para obtener las fotos y videos en los modos de campo brillante y fluorescente. Después de 30 minutos de siembra celular, infundir un mililitro de medio de cultivo en la luz de la tráquea a una velocidad de flujo de un mililitro por minuto. Finalmente, cultive la tráquea con semilla celular dentro del biorreactor en una incubadora a 37 grados centígrados durante el tiempo deseado.Durante el cultivo celular, mantenga los medios dentro de la luz estáticos, mientras que los medios fuera de la tráquea se perfunden continuamente a través de un flujo unidireccional. En las imágenes fluorescentes y de campo brillante de la tráquea desepitelizada, no se observó ninguna señal fluorescente antes del etiquetado CFSE. Con el CFSE, se observó una señal fluorescente uniforme en todo el epitelio.Después de la desepitelización, la intensidad fluorescente disminuyó significativamente, lo que indica la ablación del epitelio. La tinción de hematoxilina y eosina de la tráquea desepitelizada ilustró la eliminación del epitelio pseudoestratificado de la luz de la tráquea, y la preservación de las células y la matriz extracelular, o microestructuras ECM, en las capas de tejido subyacentes. Además, la tinción de pentacromo y tricromo confirmó el mantenimiento de la arquitectura del tejido de la tráquea y los componentes de ECM, como el colágeno y los proteoglicanos.La inmunofluorescencia de las células epiteliales y el colágeno I reveló la eliminación completa del epitelio y la preservación del colágeno I dentro del tejido subepitelial. Las micrografías electrónicas de barrido indicaron que la tráquea nativa estaba poblada de células multiciliadas y caliciformes. En la tráquea desepitelizada, la membrana basal quedó expuesta, como lo indica una red de malla de fibras de matriz extracelular y la ausencia de células epiteliales.Las imágenes de fluorescencia de la tráquea desepitelizada, al sembrar con PBS y colágeno, se muestran aquí. En comparación con las células sembradas a través de un medio de cultivo, las células marcadas fluorescentemente administradas a través de hidrogel permanecieron adheridas de manera más uniforme a través de la luz. El estudio de viabilidad celular demostró que la viabilidad no se vio afectada por el procedimiento de administración celular, y más del 90% de las células permanecieron viables.La creación de una película delgada de detergente en el proceso de desepitelización y el uso de hidrogel como vehículo de entrega para las células son pasos esenciales para el éxito de este protocolo. Nuestro próximo objetivo de investigación es implantar células primarias o madre de las vías respiratorias cultivadas en laboratorio en el tejido de las vías respiratorias desepitelizado para investigar si se puede preparar tejido funcional de las vías respiratorias.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Diseño de un Carga mecánica Biaxial biorreactor para Ingeniería de Tejidos

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Investigación

Bioingeniería

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

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In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

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In vitro modelo de cultivo celular para Toxic inhalado Prueba química

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

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Adaptación del Proceso Electrohilado para proporcionar tres ambientes únicos para un Tri-capa<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la pared de la vía aérea

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Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

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3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

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Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Esferoides cardíacos como tejidos cardíacos bioingeniería in vitro para estudiar la fisiopatología cardíaca humana

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