Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Denna forskning har delvis fått stöd av American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation och National Science Foundation (CAREER Award 2143620) till JK; och National Institutes of Health (P41 EB027062) till G.V.N.

Djurvävnadsprotokollet nedan har godkänts av riktlinjerna för djurskydd och föreskrifter från Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Stevens Institute of Technology, och det överensstämmer med National Institutes of Health (NIH) riktlinjer för användning av försöksdjur.
1. Design och konstruktion av bildstyrd råtttrakebioreaktor
<ol><li>Design och tillverkning av bioreaktorer för råtttrakea<ol>
<li>Skapa en CAD-modell (Computer Aided Design) av...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+the+epithelium+in+chronic+upper+airways+diseases.">Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).</li><li>Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+function+of+airway+tract+epithelium.">Barrier function of airway tract epithelium.</a> Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).</li><li>De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium+dysfunction+in+cystic+fibrosis+and+COPD.">Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD.</a> Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).</li><li>Horani, A., Ferkol, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+genetics+of+primary+ciliary+dyskinesia:+Clinical+implications.">Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications.</a> Chest. 154 (3), 645-652 (2018).</li><li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis.">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).</li><li>Shrestha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-on-a-chip:+the+future+of+respiratory+disease+models+and+pharmacological+studies.">Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).</li><li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro.">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li><li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pulmonary+cystic+fibrosis+in+a+human+lung+airway-on-a-chip.">Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip.</a> Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).</li><li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Gilpin, S. E., Wagner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+lung+scaffolds+to+model+lung+disease+and+tissue+regeneration.">Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration.</a> European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+lungs+for+transplantation.">Bioengineering lungs for transplantation.</a> Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).</li><li>Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+regeneration:+steps+toward+clinical+implementation+and+use.">Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).</li><li>Planchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).</li><li>Coward, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).</li><li>Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+decellularization+using+a+combination+of+chemical,+physical+and+bioreactor+methods.">Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods.</a> The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).</li><li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds.">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

I detta arbete skapade vi en bildstyrd bioreaktor som kan möjliggöra (i) övervakning av luftstrupen lumen in situ efter cellavlägsnande och exogen cellleverans och (ii) långsiktig in vitro-odling av den cellfröade luftstrupsvävnaden. Med hjälp av denna specialbyggda bioreaktor demonstrerade vi (i) selektivt avlägsnande av de endogena epitelcellerna från luftstrupens lumen med hjälp av tvättmedel och vibrationsassisterad luftvägstvätt och (ii) enhetlig fördelning av exogena celler på den ...

Den luminala ytan i luftvägarna är fodrad av ett lager av epitel som huvudsakligen består av multicilierade, klubb-, bägare- och basalstamceller 1,2. Epitelskiktet fungerar som en primär försvarsmekanism i lungan, som fungerar som en biofysisk barriär som skyddar den underliggande luftvägsvävnaden mot inhalerade patogener, partiklar eller kemiska gaser. Det skyddar luftvägsvävnaden via flera mekanismer, inklusive intercellulär tät korsningsbildning, mukociliär clearance och antimikrobiell och antioxidantsekretion 3,4. Det defekta luftvägsepitelet är förknippat med förödande luftvägssjukdomar, såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL)5, primär ciliär dyskinesi (PCD)6 och cystisk fibros (CF)7.
Framsteg inom lung-on-chip (LOC) -teknik utgör en möjlighet att studera mänsklig lungutveckling, modellera olika lungsjukdomar och utveckla nya terapeutiska material i tätt reglerade in vitro-miljöer . Till exempel kan luftvägsepitele och endotel odlas på motsatta sidor av ett tunt, poröst membran för att efterlikna gasutbytet av lungvävnad, vilket möjliggör trogen sjukdomsmodellering och drogtestning8. På samma sätt har in vitro-sjukdomsmodeller skapats för att modellera luftvägssjukdomar in vitro, såsom KOL9 och cystisk fibros10. En stor utmaning med LOC-enheter är dock att sammanfatta den komplexa tredimensionella (3D) arkitekturen i lungvävnaden och dynamiska cellvävnadsmatrisinteraktioner in vitro11.
Nyligen har innovativa vävnadstekniska metoder utvecklats som möjliggör manipulation av ex vivo lungvävnader12. Med hjälp av dessa metoder kan förnekade allogena eller xenogena vävnadstransplantat framställas genom att avlägsna de endogena cellerna från lungvävnaden via kemiska, fysiska och mekaniska behandlingar13. Dessutom ger den bevarade inhemska vävnadsextracellulära matrisen (ECM) i de decellulariserade lungställningarna de fysio-mimetiska strukturella, biokemiska och biomekaniska signalerna för implanterade celler att fästa, föröka sig och differentiera 14,15.
Här rapporteras ett bildstyrt bioreaktorsystem skapat genom att kombinera LOC- och vävnadsteknik för att möjliggöra in vitro-vävnadsmanipulation och odling av explanterade råtttrakealvävnader. Med hjälp av denna bioreaktor för luftvägsvävnad visar protokollet selektivt avlägsnande av de endogena epitelcellerna utan att störa de underliggande subepitelcellulära och biokemiska komponenterna i luftvägsvävnaden. Vi visar sedan den homogena fördelningen och momentan avsättning av de nyligen sådda exogena cellerna, såsom mesenkymala stamceller (MSC), på den denuderade luftvägslumen genom att införa den cellladdade kollagen I-förgellösningen. Dessutom, genom att använda den mikrooptiska bildanordningen integrerad i bioreaktorn, görs visualiseringen av luftstrupen lumen under epitelavlägsnande och endogen cellleverans också. Vidare visas att luftstrupen och nyplanterade celler kan odlas i bioreaktorn utan märkbar celldöd och vävnadsnedbrytning i 4 dagar. Vi föreställer oss att den bildaktiverade bioreaktorplattformen, den tunnfilmsbaserade de-epitelialiseringstekniken och cellleveransmetoden som används i denna studie kan vara användbara för att generera luftvägsvävnader för in vitro-sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening.
Bioreaktorn innehåller en rektangulär kammare ansluten till en programmerbar sprutpump, perfusionspump och ventilator för odling av isolerade råttluftstrupar. Bioreaktorn har inlopp och utlopp anslutna till luftstrupen eller vävnadsodlingskammaren för att separat leverera reagenser (t.ex. odlingsmedier) till luftstrupens inre och yttre utrymmen (figur 1). Ett specialbyggt bildsystem kan användas för att visualisera det inre av den in vitro-odlade råtttrasen på cellulär nivå (figur 2). Det endogena epitelet i luftstrupen avlägsnas via instillation av en tvättmedelsbaserad decellulariseringslösning följt av vibrationsassisterad luftvägstvätt (figur 3). Hydrogellösning, såsom kollagen av typ I, används som ett leveransfordon för sådd av exogena celler jämnt och omedelbart över denuderade luftstrupen lumen (Figur 4). Alla material som används för att konstruera bioreaktorn och genomföra experimenten finns i materialförteckningen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

Upprepad skada på luftvägsvävnad kan försämra lungfunktionen och orsaka kronisk lungsjukdom, såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom. Framsteg inom regenerativ medicin och bioreaktorteknik erbjuder möjligheter att producera laboratorieodlade funktionella vävnads- och organkonstruktioner som kan användas för att screena droger, modellera sjukdomar och konstruera vävnadsersättningar. Här beskrivs en miniatyriserad bioreaktor i kombination med en avbildningsmodalitet som möjliggör in situ-visualisering av den inre lumen hos utplanterade råtttraströr under in vitro-vävnadsmanipulation och odling. Med hjälp av denna bioreaktor visar protokollet bildstyrd selektiv borttagning av endogena cellulära komponenter samtidigt som de inneboende biokemiska egenskaperna och ultrastrukturen i luftvägsvävnadsmatrisen bevaras. Vidare visas leverans, enhetlig fördelning och efterföljande långvarig odling av exogena celler på decellulariserad luftvägslumen med optisk övervakning in situ. Resultaten belyser att den bildstyrda bioreaktorn potentiellt kan användas för att underlätta generering av funktionella in vitro-luftvägsvävnader.

Den GRIN-linsbaserade in situ-avbildningsmodaliteten kan möjliggöra visualisering av trakealens inre lumen in situ (figur 5A). Med hjälp av denna avbildningsmetod kan både ljusfälts- och fluorescerande bilder av de inhemska och de-epitelialiserade luftstruparna erhållas (figur 5B,C). Ingen fluorescerande signal observerades från den ursprungliga luftstrupen före CFSE-märkning (figur 5Bii)....

Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Protokollet beskriver en bildaktiverad bioreaktor som möjliggör selektivt avlägsnande av det endogena epitelet från råtttraset och homogen fördelning av exogena celler på lumenytan, följt av långvarig in vitro-odling av cellvävnadskonstruktionen.

Imaging-guided bioreaktor för generering av bioengineered luftvägsvävnad

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Detta protokoll möjliggör in vitro-odling och direkt mikroskopisk visualisering av de isolerade luftvägsvävnaderna under olika vävnadsmanipulationsprocedurer, såsom de-epitelisering och luftvägsvävnadsregenerering. Den in situ-avbildning som föreslås i denna studie möjliggör snabb och icke-destruktiv övervakning av trakeallumen under avbildningsstyrd kontrollerad borttagning av det endogena epitelet och leverans av de exogena cellerna. Den bildstyrda bioreaktiva plattformen och vävnadsmanipulationsprotokollen kan användas för att generera bioengineered luftvägsvävnad för sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening.Konstruktionen och användningen av den bildaktiverade bioreaktorn för luftvägsvävnad kommer att demonstreras av två doktorander från vår forskargrupp, Mohammad Mir och Jiawen Chen. För att börja skapa in situ-bildbehandlingsenhet, sätt in en rörlins i ett stapelbart linsrör och säkra det med en hållarring. Montera sedan linsbordsenheten på en vetenskaplig CMOS-kamera via en C-mount-adapter.Använd Micromanager-programvaran för att använda kameran och skaffa foton och videor. När du siktar på ett objekt som ligger 10 meter från kameran, justera avståndet mellan rörlinsen och kamerans bildsensor tills en fokuserad bild av objektet bildas på datorskärmen. Använd sedan optiska bursystemkomponenter, såsom monteringsstång, gängad burplatta och burkub för att montera en filterlins på en dubbelkantig, superupplöst, dikroisk spegel och en laser till enheten.Anslut ett 20X objektiv till enheten. Montera sedan en grön lins med en diameter på 500 mikrometer i linsrörets distala ände via X-Y-översättaren. Justera avståndet mellan de gröna och objektivlinserna för att bilda de fokuserade mikroskopiska bilderna.För att visualisera den isolerade råtttrakelumen i ljusfält eller fluorescerande, placera bioreaktorn på bildstadiet. Därefter infusera 500 mikroliter av den nyberedda karboxifluoresceinsuccinimidylester eller CFSE-lösningen med en flödeshastighet på fem milliliter per minut genom luftstrupen via sprutpumpen ansluten till luftrörets kanyl. När CFSE-lösningen fyller luftstrupen, stoppa pumpen.Tvätta luftrörets lumen efter 10 minuter genom att infusera 10 ml PBS med sprutpumpen för att avlägsna de återstående icke-införlivade CFSE-reagenserna. Efter tvätten, sätt in den distala avbildningsänden av den gröna linsen i luftstrupen via luerkontakten fäst vid ena änden av luftstrupen. Flytta sedan försiktigt den gröna linsen inuti luftstrupen tills luftstrupens yta är fokuserad.För att fånga ljusfältsbilderna i micromanager-programvaran, belysa luftstrupens lumen med vitt ljus genom burkuben. Klicka sedan på Live-ikonen för att visa luftrörets lumenala yta i realtid. Använd flikarna Bildåtergivning och Exponering för att ändra exponeringstiden till önskat värde.Om du vill justera kontrasten och ljusstyrkan för bilder använder du histogram- och intensitetsskalningsfönstret för att flytta svartvita pilar vid slutpunkten för den interaktiva histogramvisningen. Klicka på Stop Live för att aktivera Snap-ikonen och klicka sedan på Snap-ikonen för att frysa bilden. Använd sedan inställningen Exportera sedan Bilder som förskjutna flikar för att spara bilderna i önskat format.För att få foton och videor i ett fluorescerande läge, belysa luftstrupens lumen med CFSE-specifikt laserljus genom burkuben och förvärva bilderna i realtid genom att flytta bildsonden fram och tillbaka. När foton och videor har erhållits, ta försiktigt bort den gröna linsen från luftstrupen. För de-epitelialisering av luftstrupen, sätt in 50 mikroliter av det nyberedda 2% natriumdodecylsulfatet genom luftstrupskanyeln för att generera en tunn film av tvättmedelslösningen på luftstrupens lumen.Efter instillationen, stäng bioreaktorns slanganslutningar med manliga eller kvinnliga luerpluggar och överför bioreaktorn till en 37-graders Celsius inkubator i 10 minuter så att SDS kan bo i luftstrupen. Upprepa instillationen en gång. Efter den andra instillationen, ta bort det lyserade epitelet och SDS genom att bevattna luftstrupens lumen tre gånger med 500 mikroliter PBS via sprutpump med en flödeshastighet på 10 ml per minut.Placera sedan bioreaktorn på en shaker för att mekaniskt vibrera med en frekvens av 20 Hertz och en förskjutningsamplitud på 0,3 millimeter för att fysiskt främja avlägsnande av SDS-behandlade epitelceller från luftstrupens lumen. Medan luftstrupen vibreras mekaniskt, sätt in 500 mikroliter PBS två gånger genom luftstrupens lumen för att avlägsna återstående SDS och cellskräp. Efter epitelavlägsnandet, utvärdera clearance av epitelskiktet genom att mäta intensiteten hos CFSE med hjälp av den gröna linsavbildningsanordningen.Efter beredning av en de-epitelialiserad råtttrastke, tina frysta mesenkymala stamceller, eller MSC, i 30 sekunder i ett 37-graders Celsius vattenbad. Räkna sedan cellerna med en hemocytometer, följt av att förbereda en celllösning med en koncentration av fem gånger 10 till de sex cellerna per milliliter. Märk sedan cellerna fluorescerande genom att inkubera dem med två milliliter 100-mikromolär CFSE-lösning vid rumstemperatur.Efter 15 minuter, skölj cellerna med fem milliliter PBS tre gånger innan du återanvänder dem i ett nytt DMEM-odlingsmedium i en slutlig koncentration av tre gånger 10 till de sju cellerna per milliliter. Omedelbart efter beredningen av kollagen I hydrogel, som beskrivs i manuskriptet, tillsätt cellerna till hydrogellösningen med önskad koncentration. Blanda sedan cellerna och gellösningen med en mikropipett för att erhålla en enhetlig cell-hydrogelblandning.Fäst sedan ena änden av luftstrupen i bioreaktorn till en programmerbar sprutpump genom en luerkontakt och leverera fem milliliter färskt odlingsmedium till bioreaktorkammaren vid 37 grader Celsius för att täcka luftrörets yttre yta. Administrera sedan 10 mikroliter bolus av cell-hydrogelblandningen i den de-epitelialiserade luftstrupen i bioreaktorn för att generera ett cellhydrogelskikt på luftstrupen lumen. Efter cellinjektion, placera bioreaktorn i en steril cellodlingsinkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid för gellation i 30 minuter för att möjliggöra gellation.För att visualisera fördelningen av implanterade celler, sterilisera den gröna linsen med 70% isopropylalkohol eller etanol och placera bioreaktorn på bildstadiet för att få foton och videor i både ljusfält och fluorescerande lägen. Efter 30 minuters cellsådd, infusera en milliliter odlingsmedium i luftstrupens lumen med en flödeshastighet av en milliliter per minut. Slutligen odla den cellfröade luftstrupen i bioreaktorn i en inkubator vid 37 grader Celsius under önskad tid.Under cellodlingen, håll media inuti lumen statisk, medan media utanför luftstrupen kontinuerligt perfusioneras via ett enkelriktat flöde. I ljusfälts- och fluorescerande bilder av den de-epitelialiserade luftstrupen observerades ingen fluorescerande signal före CFSE-märkningen. Med CFSE observerades en enhetlig fluorescerande signal i hela epitelet.Efter de-epitelialisering minskade den fluorescerande intensiteten signifikant, vilket indikerar ablation av epitelet. Hematoxylin- och eosinfärgningen av den de-epitelialiserade luftstrupen illustrerade avlägsnandet av det pseudostratifierade epitelet från luftstrupens lumen och bevarandet av celler och extracellulär matris, eller ECM-mikrostrukturer, i underliggande vävnadsskikt. Dessutom bekräftade pentakrom- och trikromfärgningen underhållet av luftstrupens vävnadsarkitektur och ECM-komponenter, såsom kollagen och proteoglykaner.Immunofluorescensen hos epitelceller och kollagen I avslöjade fullständigt avlägsnande av epitelet och bevarande av kollagen I i subepitelvävnaden. Svepelektronmikrograferna indikerade att den ursprungliga luftstrupen var befolkad med multicillierade och bägare celler. I den de-epitelialiserade luftstrupen exponerades basalmembranet, vilket indikeras av ett nätnätverk av extracellulära matrisfibrer och frånvaron av epitelceller.Fluorescensbilderna av den de-epitelialiserade luftstrupen, vid sådd med PBS och kollagen, visas här. Jämfört med cellerna sådda via odlingsmedium förblev de fluorescerande märkta cellerna som levererades via hydrogel vidhäftade mer enhetligt över lumen. Cellviabilitetsstudien visade att livskraften inte påverkades av cellleveransproceduren, och över 90% av cellerna förblev livskraftiga.Att skapa en tunn film av tvättmedel i de-epiteliseringsprocessen och använda hydrogel som ett leveransmedel för celler är viktiga steg för framgången med detta protokoll. Vårt nästa forskningsmål är att implantera laboratorieodlad luftvägs primär eller stamcell på den de-epitelialiserade luftvägsvävnaden för att undersöka om funktionell luftvägsvävnad kan beredas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Design av en Biaxial mekanisk belastning Bioreaktor för Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidic pikoliter Bioreaktor för Microbial Encelliga Analys: Fabrication, Systeminställningar, och Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Drift av Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cellodling in vitro modell för Toxic Inhalerat Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Anpassning av Electro processen med att ge tre unika miljöer för en Tri-lager<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generation av ESC-derived mus epitelceller i luftvägarna med hjälp decellulariserade Lung Ställningar

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Aggregation och Bioreaktor Mognad för brosk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Rekombinant kollagen jag peptid Microcarriers för Cell Expansion och deras potentiella användning som Cell leverans System i en bioreaktor modell

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Hjärt sfäroider som in vitro Bioengineered hjärtvävnader att studera människans hjärta Patofysiologi

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Multi-Stream Perfusion Bioreactor integrerad med utloppsfraktionering för dynamisk cellodling

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...