Name: imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Bu araştırma kısmen Amerikan Toraks Derneği Vakfı Araştırma Programı, New Jersey Sağlık Vakfı ve Ulusal Bilim Vakfı (KARİYER Ödülü 2143620) tarafından J.K.'ya desteklenmiştir; ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (P41 EB027062) G.V.N.'ye

Aşağıdaki hayvan dokusu protokolü, Stevens Teknoloji Enstitüsü'ndeki Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi Enstitüsü'nün (IACUC) hayvan refahı kılavuzu ve düzenlemeleri tarafından onaylanmıştır ve deney hayvanlarının kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) kılavuzlarına uygundur.
1. Görüntüleme kılavuzlu sıçan trakea biyoreaktörünün tasarımı ve yapımı
<ol><li>Sıçan trakea biyoreaktörünün tasarımı ve imalatı<ol>
<li>CAD je...

<ol>
	<li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung.">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li><li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+(NHBE)+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies.">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).</li><li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+the+epithelium+in+chronic+upper+airways+diseases.">Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).</li><li>Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+function+of+airway+tract+epithelium.">Barrier function of airway tract epithelium.</a> Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).</li><li>De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium+dysfunction+in+cystic+fibrosis+and+COPD.">Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD.</a> Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).</li><li>Horani, A., Ferkol, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+genetics+of+primary+ciliary+dyskinesia:+Clinical+implications.">Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications.</a> Chest. 154 (3), 645-652 (2018).</li><li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis.">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).</li><li>Shrestha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-on-a-chip:+the+future+of+respiratory+disease+models+and+pharmacological+studies.">Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).</li><li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro.">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li><li>Plebani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pulmonary+cystic+fibrosis+in+a+human+lung+airway-on-a-chip.">Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip.</a> Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).</li><li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Gilpin, S. E., Wagner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+lung+scaffolds+to+model+lung+disease+and+tissue+regeneration.">Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration.</a> European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+lungs+for+transplantation.">Bioengineering lungs for transplantation.</a> Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).</li><li>Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+regeneration:+steps+toward+clinical+implementation+and+use.">Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).</li><li>Planchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).</li><li>Coward, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).</li><li>Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+decellularization+using+a+combination+of+chemical,+physical+and+bioreactor+methods.">Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods.</a> The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).</li><li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds.">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung.">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li><li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary.">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li><li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung.">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).</li><li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung.">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus.">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li><li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering.">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).</li></ol>

Bu çalışmada, (i) hücre çıkarılması ve eksojen hücre iletiminden sonra trakea lümeninin in situ olarak izlenmesine ve (ii) hücre tohumlu trakea dokusunun uzun süreli in vitro kültürüne izin verebilen görüntüleme rehberliğinde bir biyoreaktör oluşturduk. Bu özel yapım biyoreaktörü kullanarak, (i) deterjan ve titreşim destekli hava yolu yıkama kullanarak endojen epitel hücrelerinin trakea lümeninden seçici olarak çıkarıldığını ve (ii) hücre yüklü kollajen I pre-jeli...

Solunum yolunun luminal yüzeyi, esas olarak çok siliyerli, kulüp, kadeh ve bazal kök hücrelerden oluşan bir epitel tabakası ile kaplıdır 1,2. Epitel tabakası, akciğerin birincil savunma mekanizması olarak işlev görür ve altta yatan hava yolu dokusunu solunan patojenlere, partiküllere veya kimyasal gazlara karşı koruyan biyofiziksel bir bariyer görevi görür. Hava yolu dokusunu, hücreler arası sıkı bağlantı oluşumu, mukosiliyer klirens ve antimikrobiyal ve antioksidan sekresyon 3,4 dahil olmak üzere çoklu mekanizmalarla korur. Kusurlu hava yolu epiteli, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH)5, primer siliyer diskinezi (PCD)6 ve kistik fibroz (KF)7 gibi yıkıcı solunum yolu hastalıkları ile ilişkilidir.
Çip üzerinde akciğer (LOC) teknolojisindeki ilerlemeler, insan akciğer gelişimini incelemek, çeşitli akciğer hastalıklarını modellemek ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş in vitro ortamlarda yeni terapötik materyaller geliştirmek için bir fırsat sunmaktadır. Örneğin, hava yolu epiteli ve endotel, akciğer dokusunu değiştiren gazı taklit etmek için ince, gözenekli bir zarın zıt taraflarında kültürlenebilir, bu da sadık hastalık modellemesine ve ilaç testine izin verir8. Benzer şekilde, KOAH9 ve kistik fibroz10 gibi in vitro hava yolu hastalıklarını modellemek için in vitro hastalık modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, LOC cihazlarının en büyük zorluğu, akciğer dokusunun karmaşık üç boyutlu (3D) mimarisini ve in vitro11 dinamik hücre-doku matris etkileşimlerini özetlemektir.
Son zamanlarda, ex vivo akciğer dokularının manipülasyonuna izin veren yenilikçi doku mühendisliği metodolojileri geliştirilmiştir12. Bu metodolojiler kullanılarak, endojen hücrelerin akciğer dokusundan kimyasal, fiziksel ve mekanik işlemlerle çıkarılmasıyla reddedilen allojenik veya ksenojenik doku greftleri hazırlanabilir13. Ek olarak, desellülarize akciğer iskelelerindeki korunmuş doğal doku hücre dışı matrisi (ECM), implante edilmiş hücrelerin14,15'i bağlaması, çoğalması ve ayırt etmesi için fizyo-mimetik yapısal, biyokimyasal ve biyomekanik ipuçları sağlar.
Burada, in vitro doku manipülasyonuna ve ekşimiş sıçan trakeal dokularının kültürüne izin vermek için LOC ve doku mühendisliği teknolojilerinin birleştirilmesiyle oluşturulan görüntüleme rehberliğinde bir biyoreaktör sistemi bildirilmiştir. Bu hava yolu doku biyoreaktörünü kullanarak, protokol, hava yolu dokusunun altta yatan subepitelyal hücresel ve biyokimyasal bileşenlerini bozmadan endojen epitel hücrelerinin seçici olarak çıkarılmasını gösterir. Daha sonra, mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) gibi yeni tohumlanmış eksojen hücrelerin, hücre yüklü kollajen I jel öncesi çözeltisini aşılayarak inkar edilmiş hava yolu lümeni üzerindeki homojen dağılımını ve anlık birikimini göstereceğiz. Ayrıca biyoreaktöre entegre mikro-optik görüntüleme cihazı kullanılarak epitel çıkarılması ve endojen hücre iletimi sırasında trakea lümeninin görselleştirilmesi de yapılmaktadır. Ayrıca, trakea ve yeni implante edilen hücrelerin, 4 gün boyunca gözle görülür hücre ölümü ve doku bozulması olmadan biyoreaktörde kültürlenebileceği gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan görüntüleme özellikli biyoreaktör platformunun, ince film bazlı deepitelizasyon tekniğinin ve hücre dağıtım yönteminin, in vitro hastalık modellemesi ve ilaç taraması için hava yolu dokularının oluşturulmasında yararlı olabileceğini öngörüyoruz.
Biyoreaktör, izole sıçan trakeasını kültürlemek için programlanabilir bir şırınga pompasına, perfüzyon pompasına ve vantilatöre bağlı dikdörtgen bir oda içerir. Biyoreaktör, trakeanın iç ve dış boşluklarına ayrı ayrı reaktifler (örneğin, kültür ortamı) beslemek için trakeaya veya doku kültürü odasına bağlı giriş ve çıkışlara sahiptir (Şekil 1). Özel yapım bir görüntüleme sistemi, in vitro kültürlü sıçan trakeasının içini hücresel düzeyde görselleştirmek için kullanılabilir (Şekil 2). Trakeanın endojen epiteli, deterjan bazlı bir desellülarizasyon çözeltisinin damlatılması ve ardından titreşim destekli hava yolu yıkama ile çıkarılır (Şekil 3). Tip I kollajen gibi hidrojel çözeltisi, eksojen hücrelerin denuded trakea lümeni boyunca düzgün ve anında tohumlanması için bir dağıtım aracı olarak kullanılır (Şekil 4). Biyoreaktörü inşa etmek ve deneyleri yürütmek için kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosunda verilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; PBS</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14048-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-port connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14047-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelerometer</td>
			<td>STMicroelectronics</td>
			<td>IIS3DWBTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum pin stub</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Button head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91255A274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C4W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon double-sided conductive tape</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE labelling kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolv (clearing agent)</td>
			<td>Decon</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive liquid silver paint</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>DI03-R488</td>
			<td>Reflected laser wavelengths:&#160; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer bulkhead to hose barb adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45501-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer to tubing barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female to male luer connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZY-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter lens</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET535/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse E1000 - D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91813A160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>AC120585000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging fiber</td>
			<td>SELFOC, NSG group</td>
			<td>GRIN lens</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Opto Engine</td>
			<td>MDL-D-488-150mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens tubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACH 3 CNC Control Software</td>
			<td>Newfangled Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UCPLFLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>L/S standard digital pump system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific CMOS camera</td>
			<td>PCO Panda</td>
			<td>PCO Panda 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks (2019)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer plate amplifier</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>SPA250DSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subwoofer speaker</td>
			<td>Dayton Audio</td>
			<td>RSS21OHO-4</td>
			<td>Diaphragm diameter: 21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer adapter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45513-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>13-200-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Translator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging-guided bioreactor for generating bioengineered airway tissue

Hava yolu dokusunda tekrarlanan yaralanmalar akciğer fonksiyonunu bozabilir ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi kronik akciğer hastalığına neden olabilir. Rejeneratif tıp ve biyoreaktör teknolojilerindeki ilerlemeler, ilaçları taramak, hastalıkları modellemek ve doku replasmanlarını mühendislik yapmak için kullanılabilecek laboratuarda yetiştirilen fonksiyonel doku ve organ yapıları üretme fırsatları sunmaktadır. Burada, minyatür bir biyoreaktör, in vitro doku manipülasyonu ve kültürü sırasında ekşi sıçan trakeasının iç lümeninin in situ olarak görselleştirilmesini sağlayan bir görüntüleme yöntemi ile birlikte tanımlanmıştır. Bu biyoreaktörü kullanarak, protokol, endojen hücresel bileşenlerin görüntüleme rehberliğinde seçici olarak çıkarılmasını gösterirken, hava yolu doku matrisinin içsel biyokimyasal özelliklerini ve ultrayapısını korur. Ayrıca, desellülarize hava yolu lümenindeki eksojen hücrelerin in situ optik izleme ile verilmesi, homojen dağılımı ve daha sonra uzamış kültürü gösterilmiştir. Sonuçlar, görüntüleme rehberliğindeki biyoreaktörün, fonksiyonel in vitro hava yolu dokularının oluşumunu kolaylaştırmak için potansiyel olarak kullanılabileceğini vurgulamaktadır.

GRIN lens tabanlı in situ görüntüleme yöntemi, trakeal iç lümenin in situ olarak görüntülenmesini sağlayabilir (Şekil 5A). Bu görüntüleme yöntemi kullanılarak doğal ve deepitelize trakeaların hem parlak alan hem de floresan görüntüleri elde edilebilir (Şekil 5B,C). CFSE etiketlemesinden önce doğal trakeadan floresan sinyal gözlenmedi (Şekil 5Bii). Bununla birlikte, trakea...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue at JoVE.com

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Protokol, endojen epitelin sıçan trakeasından seçici olarak çıkarılmasına ve lümen yüzeyindeki eksojen hücrelerin homojen dağılımına izin veren, ardından hücre dokusu yapısının uzun süreli in vitro kültürüne izin veren görüntüleme özellikli bir biyoreaktörü tanımlar.

Biyomühendislik hava yolu dokusu üretmek için görüntüleme kılavuzlu biyoreaktör

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Bu protokol, in vitro ekimine ve deepitelizasyon ve hava yolu dokusu rejenerasyonu gibi farklı doku manipülasyon prosedürleri sırasında izole hava yolu dokularının doğrudan mikroskobik olarak görselleştirilmesine izin verir. Bu çalışmada önerilen in situ görüntüleme, endojen epitelin görüntüleme eşliğinde kontrollü çıkarılması ve eksojen hücrelerin verilmesi sırasında trakeal lümenin hızlı ve tahribatsız izlenmesini sağlar. Görüntüleme rehberliğinde biyoreaktif platform ve doku manipülasyon protokolleri, hastalık modellemesi ve ilaç taraması için biyomühendislik hava yolu dokusu oluşturmak için kullanılabilir.Görüntüleme özellikli hava yolu doku biyoreaktörünün yapımı ve kullanımı, araştırma grubumuzdan iki doktora öğrencisi Mohammad Mir ve Jiawen Chen tarafından gösterilecektir. Yerinde görüntüleme aygıtı oluşturmaya başlamak için, istiflenebilir bir lens tüpüne bir tüp lens yerleştirin ve bir tutma halkası kullanarak sabitleyin. Ardından, lens tablası tertibatını bir C montaj adaptörü aracılığıyla bilimsel bir CMOS kameraya monte edin.Kamerayı çalıştırmak ve fotoğraf ve video almak için Micromanager yazılımını kullanın. Kameradan 10 metre uzakta bulunan bir nesneyi hedeflerken, bilgisayar ekranında nesnenin odaklanmış bir görüntüsü oluşana kadar tüp lensi ile kameranın görüntüleme sensörü arasındaki mesafeyi ayarlayın. Ardından, bir filtre lensini çift kenarlı, süper çözünürlüklü, dikroik aynaya ve bir lazere cihaza monte etmek için montaj çubuğu, dişli kafes plakası ve kafes küpü gibi optik kafes sistemi bileşenlerini kullanın.Cihaza 20X objektif lens bağlayın. Ardından, X-Y tercümanı aracılığıyla lens tüpünün distal ucuna 500 mikrometre çapında yeşil bir lens takın. Odaklanmış mikroskobik görüntüleri oluşturmak için yeşil ve objektif lensler arasındaki mesafeyi ayarlayın.İzole sıçan trakea lümenini parlak alanda veya floresanda görselleştirmek için, biyoreaktörü görüntüleme aşamasına yerleştirin. Daha sonra, taze hazırlanmış karboksifloresein süksinimidil ester veya CFSE çözeltisinin 500 mikrolitresini, trakea kanülünün borusuna bağlı şırınga pompası aracılığıyla trakeadan dakikada beş mililitre akış hızında infüze edin. CFSE çözeltisi trakeayı doldurduktan sonra, pompayı durdurun.10 dakika sonra, artık dahil edilmemiş CFSE reaktiflerini çıkarmak için şırınga pompasını kullanarak 10 mililitre PBS infüze ederek trakea lümenini yıkayın. Yıkamadan sonra, yeşil lensin distal görüntüleme ucunu trakea'nın bir ucuna bağlı luer konektörü aracılığıyla trakeaya yerleştirin. Ardından, trakea yüzeyi odaklanana kadar yeşil lensi trakeanın içinde yavaşça hareket ettirin.Micromanager yazılımında parlak alan görüntülerini yakalamak için, trakea lümenini kafes küpü boyunca beyaz ışıkla aydınlatın. Ardından, trakeanın parlak yüzeyini gerçek zamanlı olarak göstermek için Canlı simgesine tıklayın. Pozlama süresini istenen değere değiştirmek için Görüntüleme ayarını ve Pozlama sekmelerini kullanın.Görüntülerin kontrastını ve parlaklığını ayarlamak için, etkileşimli histogram ekranının bitiş noktasındaki siyah beyaz okları taşımak üzere histogram ve yoğunluk ölçeklendirme penceresini kullanın. Tutturma simgesini etkinleştirmek için Canlı Olarak Durdur'u tıklayın, ardından görüntüyü dondurmak için Tutturma simgesine tıklayın. Ardından, görüntüleri istenen biçimde kaydetmek için Görüntüleri Dışa Aktar ve ardından Yer Değiştir sekmeleri olarak ayarı kullanın.Floresan modunda fotoğraf ve video elde etmek için, trakea lümenini kafes küpünden CFSE'ye özgü lazer ışığıyla aydınlatın ve görüntüleme probunu ileri geri hareket ettirerek görüntüleri gerçek zamanlı olarak elde edin. Fotoğraflar ve videolar elde edildikten sonra, yeşil lensi trakeadan yavaşça çıkarın. Trakeanın epitelizasyonu için, trakea lümeni üzerinde ince bir deterjan çözeltisi filmi oluşturmak için trakea kanülünden taze hazırlanmış% 2 sodyum dodesil sülfatın 50 mikrolitresini aşılayın.Damlatma işleminden sonra, erkek veya dişi luer tapaları kullanarak biyoreaktörün boru bağlantılarını kapatın ve SDS'nin trakea içinde yaşamasına izin vermek için biyoreaktörü 10 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın. Damlatma işlemini bir kez tekrarlayın. İkinci damlatma işleminden sonra, trakea lümenini dakikada 10 mililitre akış hızında şırınga pompası aracılığıyla 500 mikrolitre PBS ile üç kez sulayarak lize epitel ve SDS'yi çıkarın.Daha sonra, SDS ile muamele edilen epitel hücrelerinin trakea lümeninden ayrılmasını fiziksel olarak teşvik etmek için biyoreaktörü 20 Hertz frekansında ve 0.3 milimetrelik bir yer değiştirme genliğinde mekanik olarak titreşmesi için bir çalkalayıcıya yerleştirin. Trakea mekanik olarak titreştirilirken, artık SDS ve hücre kalıntılarını gidermek için trakea lümeninden iki kez 500 mikrolitre PBS aşılayın. Epitel çıkarılmasını takiben, yeşil lens görüntüleme cihazını kullanarak CFSE'nin yoğunluğunu ölçerek epitel tabakasının klirensini değerlendirin.Epitelize edilmiş bir sıçan trakeasını hazırladıktan sonra, dondurulmuş mezenkimal kök hücreleri veya MSC'leri 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 30 saniye boyunca çözün. Daha sonra, hücreleri bir hemositometre ile sayın, ardından mililitre başına altı hücreye beş kez 10 konsantrasyonda bir hücre çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında iki mililitre 100 mikromolar CFSE çözeltisi ile inkübe ederek floresan olarak etiketleyin.15 dakika sonra, hücreleri beş mililitre PBS ile üç kez durulayın, ardından taze bir DMEM kültür ortamında, mililitre başına yedi hücreye üç kez 10 oranında son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın. Kollajen I hidrojelinin hazırlanmasından hemen sonra, makalede açıklandığı gibi, hücreleri istenen konsantrasyonda hidrojel çözeltisine ekleyin. Daha sonra, düzgün bir hücre-hidrojel karışımı elde etmek için hücreleri ve jel çözeltisini bir mikropipetle karıştırın.Daha sonra, biyoreaktör içindeki trakeanın bir ucunu bir luer konektöründen programlanabilir bir şırınga pompasına takın ve trakeanın dış yüzeyini kaplamak için 37 santigrat derecede biyoreaktör odasına beş mililitre taze kültür ortamı verin. Daha sonra, trakea lümeni üzerinde bir hücre-hidrojel tabakası oluşturmak için biyoreaktör içindeki de-epitelize trakeaya hücre-hidrojel karışımının 10 mikrolitre bolusunu uygulayın. Hücre enjeksiyonundan sonra, biyoreaktörü steril bir hücre kültürü inkübatörüne 37 santigrat derecede ve jelleşmeye izin vermek için 30 dakika boyunca jelleşme için% 5 karbondioksit yerleştirin.İmplante edilen hücrelerin dağılımını görselleştirmek için, yeşil lensi% 70 izopropil alkol veya etanol ile sterilize edin ve fotoğrafları ve videoları hem parlak alan hem de floresan modlarında elde etmek için biyoreaktörü görüntüleme aşamasına yerleştirin. 30 dakikalık hücre tohumlamasından sonra, trakea lümenine dakikada bir mililitre akış hızında bir mililitre kültür ortamı demleyin. Son olarak, biyoreaktör içindeki hücre tohumlu trakeayı bir inkübatörde istenen süre boyunca 37 santigrat derecede kültürleyin.Hücre kültürü sırasında, medyayı lümen statik içinde tutarken, trakea dışındaki medya sürekli olarak tek yönlü bir akış yoluyla perfüze edilir. Epitelize trakeanın parlak alan ve floresan görüntülerinde, CFSE etiketlemesinden önce floresan sinyali gözlenmedi. CFSE ile, epitel boyunca düzgün bir floresan sinyali gözlendi.Epitelizasyonun kesilmesini takiben, floresan yoğunluğu önemli ölçüde azaldı ve epitelin ablasyonunu gösterdi. Deepitelize trakeanın hematoksilin ve eozin boyaması, psödo-tabakalaşmış epitelin trakea lümeninden uzaklaştırılmasını ve altta yatan doku katmanlarında hücrelerin ve hücre dışı matriksin veya ECM mikro yapılarının korunmasını göstermiştir. Ayrıca, pentakrom ve trikrom boyama, trakea doku mimarisinin ve kollajen ve proteoglikanlar gibi ECM bileşenlerinin korunmasını doğruladı.Epitel hücrelerinin ve kollajen I'in immünofloresansı, epitelin tamamen çıkarıldığını ve kollajen I'in subepitel dokusu içinde korunduğunu ortaya koydu. Taramalı elektron mikrografları, doğal trakeanın multisiliye ve kadeh hücreleri ile doldurulduğunu gösterdi. Deepitelize trakeada, bazal membran, hücre dışı matriks liflerinin bir ağ ağı ve epitel hücrelerinin yokluğu ile belirtildiği gibi açığa çıktı.Epitelize trakeanın PBS ve kollajen ile tohumlandıktan sonra floresan görüntüleri burada gösterilmiştir. Kültür ortamı yoluyla tohumlanan hücrelerle karşılaştırıldığında, hidrojel yoluyla verilen floresan etiketli hücreler, lümen boyunca daha düzgün bir şekilde yapışmış olarak kaldı. Hücre canlılığı çalışması, canlılığın hücre dağıtım prosedüründen etkilenmediğini ve hücrelerin% 90'ından fazlasının canlı kaldığını göstermiştir.Deepitelizasyon işleminde ince bir deterjan filmi oluşturmak ve hidrojeli hücreler için bir dağıtım aracı olarak kullanmak, bu protokolün başarısı için gerekli adımlardır. Bir sonraki araştırma hedefimiz, fonksiyonel hava yolu dokusunun hazırlanıp hazırlanamayacağını araştırmak için laboratuarda yetiştirilen hava yolu primer veya kök hücresini deepitelize hava yolu dokusuna implante etmektir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Doku Mühendisliği için iki eksenli Mekanik Yükleniyor Biyoreaktör tasarımı

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Bir Benchtop Biyoreaktör Operasyonu

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Zehirli İnhale Kimyasal Test in vitro Hücre Kültürü Modeli

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Elektrospinning Süreci Uyarlama bir Tri-katmanlı için üç Benzersiz ortamlar sağlamak için<em&gt; In Vitro</em&gt; Havayolu Wall Modeli

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Rekombinant kolajen peptid Microcarriers hücre genişletme ve hücre teslim sistemi bir biyoreaktör olarak potansiyel kullanım için ben Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

İn vitro Biyomühendislik Kalp Dokuları Olarak Kardiyak Sferoidler İnsan Kalp Patofizyolojisi Çalışma

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...