Name: highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes
Uploaded: 2022-04-21T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes at JoVE.com

Agradecemos ruth A. Singer e Richard K.P. Benninger por fornecer tecidos de pâncreas de rato. A W.M. reconhece o suporte do NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) e exército dos EUA (W911NF-19-1-0214).

O protocolo foi conduzido de acordo com o protocolo experimental animal (AC-AABD1552) aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Columbia.
1. Preparação de anticorpos conjugados por Raman-corante
<ol><li>Prepare o tampão de conjugação como ~0,1 M NaHCO3 em tampão PBS, pH = 8,3, armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Prepare a solução de sonda MARS (Material Suplementar) com função N-hidroxisuccinimidy (NHS)...

<ol>
	<li>Goltsev, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+profiling+of+mouse+splenic+architecture+with+CODEX+multiplexed+imaging.">Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging.</a> Cell. 174 (4), 968-981 (2018).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+(IHC)+and+immunofluorescence+(IF)+staining+and+validation.">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).</li><li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology.">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li><li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+epitope-based+tissue+imaging+for+discovery+and+healthcare+applications.">Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications.</a> Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).</li><li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+protein+composition+and+tissue+organization:+a+primer+for+multiplexed+antibody-based+imaging.">Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging.</a> Nature Methods. , (2021).</li><li>Lin, J. -. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+immunofluorescence+imaging+of+human+tissues+and+tumors+using+t-CyCIF+and+conventional+optical+microscopes.">Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes.</a> eLife. 7, 31657 (2018).</li><li>Black, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CODEX+multiplexed+tissue+imaging+with+DNA-conjugated+antibodies.">CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies.</a> Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).</li><li>Giesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+imaging+of+tumor+tissues+with+subcellular+resolution+by+mass+cytometry.">Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry.</a> Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).</li><li>Keren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIBI-TOF:+A+multiplexed+imaging+platform+relates+cellular+phenotypes+and+tissue+structure.">MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure.</a> Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).</li><li>Gerdes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+single-cell+analysis+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue.">Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IBEX:+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues.">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplex+vibrational+imaging.">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544, 465 (2017).</li><li>Wei, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+preresonance+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).</li><li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+resonant+stimulated+Raman+scattering+micro-spectroscopy.">Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).</li><li>Fujioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+activatable+Raman+probes+for+simultaneous+detection+of+plural+enzyme+activities.">Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).</li><li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly-multiplexed+volumetric+mapping+with+Raman+dye+imaging+and+tissue+clearing.">Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li><li>Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9-Cyanopyronin+probe+palette+for+super-multiplexed+vibrational+imaging.">9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging.</a> Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).</li><li>Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe+design+for+super-multiplexed+vibrational+imaging.">Probe design for super-multiplexed vibrational imaging.</a> Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).</li><li>Qian, N., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplexed+vibrational+probes:+Being+colorful+makes+a+difference.">Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).</li><li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+biomolecules+using+molecule+anchorable+gel-enabled+nanoscale+in-situ+fluorescence+microscopy.">Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy.</a> Nature Portfolio. , (2021).</li><li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+vibrational+imaging+using+expansion+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+understanding+of+&#946;-cell+heterogeneity+and+in+situ+islet+function.">New understanding of &#946;-cell heterogeneity and in situ islet function.</a> Diabetes. 67 (4), 537 (2018).</li><li>Hu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supermultiplexed+optical+imaging+and+barcoding+with+engineered+polyynes.">Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes.</a> Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).</li><li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li><li>. Coherent Raman Scattering Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/</a> (2022)</li></ol>

Aqui, apresentamos o protocolo imuno-eprSRS que é amplamente aplicável aos tipos de tecidos comuns, incluindo tecidos de camundongos recém-preservados, tecidos humanos FFPE e tecidos de camundongos congelados. O imuno-eprSRS foi validado para um painel de epítopos em células e tecidos, conforme listado na Tabela 1. Esta plataforma de um tiro é particularmente adequada para aplicações onde estratégias cíclicas não funcionam bem. Por exemplo, a fluorescência cíclica é exigente para tecidos gr...

Sistemas complexos de tecidos são compostos de subpopulações celulares distintas cujos locais espaciais e redes de interação estão profundamente entrelaçados com suas funções e disfunções 1,2. Para revelar a arquitetura tecidual e interrogar sua complexidade, o conhecimento dos locais espaciais das proteínas na resolução unicelular é essencial. Assim, tecnologias altamente multiplexadas de imagem de proteína têm sido cada vez mais apreciadas e podem se tornar uma pedra angular para estudar biologia tecidual 3,4,5. Os métodos atuais de imagem de proteína multiplexada comum podem ser classificados em duas categorias principais. Uma delas é a imagem de imunofluorescência em série que se baseia em múltiplas rodadas de coloração e imagem de tecido, e a outra é a citometria de massa de imagem juntamente com anticorpos marcados por metais pesados 6,7,8,9,10,11,12.
Aqui, uma estratégia alternativa para imagens proteicas baseadas em anticorpos multiplexados é introduzida. Ao contrário da modalidade de imagem de fluorescência predominante, que só pode visualizar 4-5 canais simultaneamente devido à ampla excitação e espectros de emissão (largura total à metade do máximo (FWHM) ~500 cm-1), a microscopia raman exibe largura de linha espectral muito mais estreita (FWHM ~10 cm-1) e, portanto, fornece multiplexidade escalável. Recentemente, aproveitando o espectro estreito, um novo esquema de microscopia raman chamado pré-ressonância eletrônica estimulada pela microscopia de dispersão de Raman (epr-SRS) foi desenvolvido, fornecendo uma estratégia poderosa para imagens multiplexadas13. Ao sondar os modos vibracionais acoplados eletronicamente dos corantes Raman, o epr-SRS consegue um efeito de aprimoramento drástico de 1013 vezes nas seções transversais de Raman e supera o gargalo de sensibilidade da microscopia Raman convencional (Figura 1A)13,14,15. Como resultado, o limite de detecção de epr-SRS foi empurrado para sub-μM, o que permite à detecção de Raman de marcadores moleculares interessantes, como proteínas específicas e organelas dentro das células13,16. Em particular, utilizando anticorpos conjugados por raman, a imagem epr-SRS de proteínas específicas em células e tecidos (chamadas imuno-eprSRS) foi demonstrada com sensibilidade comparável à imunofluorescência padrão (Figura 1B)13,17. Ao ajustar o comprimento de onda da bomba em apenas 2 nm, o sinal epr-SRS estará completamente desligado (Figura 1B), que apresenta alto contraste vibracional.
No lado da sonda, um conjunto de sondas Raman semelhantes ao arco-íris chamadas manhattan Raman scattering dyes (MARS) foi desenvolvido para conjugação de anticorpos 13,18,19,20. Esta paleta raman única consiste em novos corantes com laços triplos conjugados π (Material Suplementar), cada um exibindo um pico único e estreito epr-SRS na faixa espectral raman bioortogonal (Figura 1C). Modificando a estrutura do cromoforeiro central e editando isotopicamente ambos os átomos da ligação tripla (Material Suplementar), sondas Raman separadas espectralmente foram desenvolvidas. Aproveitando a multiplexidade escalável, a microscopia epr-SRS juntamente com a paleta de corante MARS oferece uma estratégia óptica para imagens de proteína multiplex de um tiro em células e tecidos.
O Immuno-eprSRS fornece uma estratégia alternativa aos métodos atuais de imagem de proteína multiplex com forças únicas. Em comparação com abordagens de fluorescência com coloração cíclica, imagem e remoção de sinal, esta plataforma baseada em Raman garante coloração e imagem de uma rodada. Portanto, contorna a complexidade prática em procedimentos cíclicos e simplifica em grande parte o protocolo, abrindo assim novos territórios de imagem de proteína multiplexada. Por exemplo, aproveitando um protocolo de limpeza de tecido sob medida raman-dye, o imuno-eprSRS foi estendido para três dimensões para mapeamento de proteínas altamente multiplexadas em tecidos intactos espessos17. Mais de 10 alvos de proteína foram visualizados ao longo de tecidos cerebrais de camundongosde espessura milimétrica 17. Mais recentemente, acoplamento do imuno-eprSRS com um protocolo otimizado de microscopia de expansão de retenção de biomolécula (ExM)protocolo 21, imagens nanoescala de um tiro de vários alvos também foram demonstradas22. Em comparação com a espectroscopia de massa de imagem 4,9, a epr-SRS é não destrutiva e tem capacidade de secção intrinsecamente óptica. Além disso, o EPR-SRS é mais eficiente no escaneamento de tecidos. Normalmente, uma região de tecido de 0,25 mm2 com um tamanho de pixel de 0,5 μm leva apenas alguns minutos para ser imagem para um único canal epr-SRS. Por exemplo, o tempo total de imagem de quatro canais SRS mais quatro canais de fluorescência na Figura 4 é de cerca de 10 minutos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18251</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>625902</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-III-tubulin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>657402</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-III-tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab41489</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131205</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, low gellling temperature</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td>For brain embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (&#945;-tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52866</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GABA B receptor R2&#160; antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB2255</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-18598</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glucagon&#160; antibody produced in mouse (Glucagon)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-514592</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>IR00261-2</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MBP antibody produced in rat (MBP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7349</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-78639</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SAB2500747</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1)</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>06-1379</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab30788</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>KR Electronics</td>
			<td>KR2724</td>
			<td>8 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC 50 Ohm Terminator</td>
			<td>Mini Circuits</td>
			<td>STRM-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cable</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>2249-C</td>
			<td>Coaxial Cable, BNC Male / Male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broadband dielectric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BB1-E03</td>
			<td>750 - 1100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>oil immersion, 1.4 N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 18</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7797</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 18</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24561</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply</td>
			<td>TopWard</td>
			<td>6302D</td>
			<td>Bias voltage is 64 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100CL</td>
			<td>Kinematic Mount for up to 1.3&#34; (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Chicken IgY (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-005-155</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-005-147</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>706-005-148</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-005-151</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-005-152</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-005-153</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>713-005-147</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab71916</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-speed look-in amplifier</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td>DC - 50 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrillarin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5821</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giantin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24586</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-514592</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1790</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High O.D. bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET890/220m</td>
			<td>Filter the Stokes beam and transmit the pump beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1384846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>701265</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated SRS laser system</td>
			<td>Applied Physics &#38; Electronics, Inc.</td>
			<td>picoEMERALD</td>
			<td>picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720&#8211;950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser-scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200MPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>POLARIS-K1-2AH</td>
			<td>2 Low-Profile Hex Adjusters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0636-5 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass dichroic beam splitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R980-25x36</td>
			<td>980 nm laser BrightLine&#160;single-edge laser-flat dichroic beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801810</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoQuant Plate</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-566-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPlan N</td>
			<td>x25, 1.05-NA, MP, working distance&#8201;=&#8201;2&#8201;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periscope assembly</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RS99</td>
			<td>includes the top and bottom units, &#216;1&#34; post, and clamping fork.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230&#8211;1000 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>51-6900</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 Medium</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td>gel filtration resin for desalting and buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shielded box with BNC connectors</td>
			<td>Pomona Electronics</td>
			<td>2902</td>
			<td>Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS1010</td>
			<td>350&#8211;1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>OSS00073G</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-035813</td>
			<td>Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8069</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes

Visualizar um vasto escopo de biomarcadores específicos em tecidos desempenha um papel vital na exploração das intrincadas organizações de sistemas biológicos complexos. Assim, tecnologias de imagem altamente multiplexadas têm sido cada vez mais apreciadas. Aqui, descrevemos uma plataforma emergente de imagem vibracional altamente multiplexada de proteínas específicas com sensibilidade comparável à imunofluorescência padrão através de imagens eletrônicas de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes raman semelhantes ao arco-íris. Este método contorna o limite de canais espectralmente solucionáveis na imunofluorescência convencional e fornece uma abordagem óptica de um tiro para interrogar vários marcadores em tecidos com resolução subcelular. É geralmente compatível com preparações de tecidos padrão, incluindo tecidos fixos paraformaldeído, tecidos congelados e tecidos humanos fixos de parafina (FFPE). Prevemos que esta plataforma fornecerá uma imagem mais abrangente das interações proteicas de espécimes biológicos, particularmente para tecidos intactos espessos. Este protocolo fornece o fluxo de trabalho desde a preparação de anticorpos até a coloração da amostra de tecido, ao conjunto de microscópios SRS, à imagem de tecido epr-SRS.

A Figura 3 mostra exemplos de imagens de epr-SRS em diferentes amostras, incluindo células fixas (Figura 3A), paraformaldeído (PFA) tecidos de camundongos fixos (Figura 3B) e amostras humanas parafina fixas em formalina (FFPE) (Figura 3C). A resolução espacial da microscopia SRS é limitada à difração, a resolução lateral típica é de ~300 nm, e a resolução axial é de 1-2 μm usando luz qua...

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Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

A imagem eletrônica de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes Raman semelhantes ao arco-íris é uma nova plataforma para imagens de proteínas à base de epítope altamente multiplexadas. Aqui, apresentamos um guia prático, incluindo preparação de anticorpos, coloração de amostras de tecido, montagem de microscópio SRS e imagem de tecido epr-SRS.

Imagem de tecido altamente multiplexado com corantes raman

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...

Imagens vibracionais altamente multiplexadas fornecem uma abordagem óptica de um tiro para interrogar múltiplos marcadores proteicos em tecidos com resolução subcelular. Esta plataforma fornece uma imagem abrangente das interações proteicas dos sistemas biológicos. A principal vantagem dessa técnica é sua multiplexidade livre de ciclos.Esta técnica é particularmente adequada para aplicações onde as estratégias de ciclismo não funcionam bem, como em seções de tecido grosso. Esse método permite a caracterização celular individual in situ para a compreensão de estruturas do sistema complexo, como a construção de atlas tecidual, micro ambientes tumorais fenotínuos e o circuito cerebral de criação de perfil. Para começar, prepare aproximadamente 0,1 bicarbonato de sódio molar no tampão PBS em PHA 0.3 para ser usado como tampão de conjugação e armazená-lo a quatro graus Celsius.Em seguida, prepare três millimolar n-hidroxisuccinimide ester função solução sonda MARS em sulfóxido de dimetil anidro. Dissolva os sólidos de anticorpos no tampão de conjugação a uma concentração de dois miligramas por mililitro. Para anticorpos dissolvidos em outros buffers, concentre-os em um filtro centrífuga e, em seguida, adicione no tampão de conjugação a uma concentração de um a dois miligramas por mililitro.Para realizar a reação de conjugação para anticorpos secundários, adicione 15 vezes o excesso molar da solução de corante à solução de anticorpos em um frasco de vidro lentamente com agitação e incubar a mistura de reação à temperatura ambiente com agitação por uma hora. Para realizar a purificação, prepare o chorume adicionando 10 mililitros de pó de resina de filtragem de gel em 40 mililitros de tampão PBS em um tubo de 50 mililitros. Mantenha a solução em um banho de água a 90 graus Celsius por uma hora.Em seguida, decantar o supernaspe, adicionar o PBS até 40 mililitros, e armazenar o chorume a quatro graus Celsius. Embale a coluna de exclusão de tamanho com a solução de chorume até a altura de 10 a 15 centímetros, depois enxágue e lave a coluna com aproximadamente 10 mililitros de PBS para embalar ainda mais a resina. Posteriormente, pipeta a mistura de reação conjugal à coluna.Depois de carregar a mistura de reação, adicione imediatamente um mililitro de PBS como o tampão de eluição. Em seguida, colete o eluente da solução conjugada olhando para a cor na coluna ou medindo a absorvância em 280 nanômetros. Usando o filtro centrífugo, concentre a solução coletada em um a dois miligramas por mililitro.Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe um limite em torno das seções teciduais na lâmina. Em seguida, incubar os tecidos com 0,3 a 0,5% PBST por 10 minutos e um tampão de bloqueio por 30 minutos. Para preparar a solução primária de coloração, adicione todos os anticorpos primários a 200 a 500 microliters de tampão de coloração nas concentrações desejadas.Centrifugar a solução de coloração primária a 13.000 vezes G por cinco minutos e use o supernatante se o precipitado aparecer. Em seguida, incubar o tecido na solução de anticorpos primários a quatro graus Celsius por um a dois dias. Lave os slides três vezes com 0,3 a 0,5% PBST por cinco minutos em temperatura ambiente em um frasco de slides e certifique-se de que os tecidos estão imersos na solução.Mais tarde, incubar o tecido em 200 a 500 microliters de tampão de bloqueio por 30 minutos. Para preparar a solução de coloração secundária, adicione todos os anticorpos secundários a 200 a 500 mililitros de tampão de coloração com concentrações desejadas. Em seguida, centrifugar a solução de coloração secundária a 13.000 vezes G por cinco minutos e usar o supernatante se precipitar aparecer.Em seguida, incubar os tecidos em 200 a 500 microliters de solução de anticorpos secundários a quatro graus Celsius por um a dois dias. Em seguida, lave os slides duas vezes com 0,3 a 0,5% PBST em temperatura ambiente por cinco minutos cada. Além disso, incubar com 200 a 500 microliters de solução DAPI por 30 minutos.Novamente, lave os slides três vezes com PBS à temperatura ambiente por cinco minutos cada e transfira as seções de tecido flutuante para as lâminas de vidro com a pipeta de queda de vidro. Espalhe o tecido com uma escova de tecido e limpe o ambiente com lenços umedecidos, se necessário. Posteriormente, monte o tecido em uma gota de reagentes anti-desbotados com uma mancha de vidro e fixe-o com esmalte.Para realizar imagens multicanal-eprSRS, defina a potência laser do feixe da bomba para 10 a 40 miliwatts e o feixe de stokes para 40 a 80 miliwatts no painel de controle a laser. Em seguida, defina o tempo de habitação do pixel para dois a quatro microssegundos e use vários quadros em média de 10 a 20 quadros no software de microscopia. Além disso, defina as constantes de tempo do amplificador de travamento para metade do tempo de moradia dos pixels.A imagem de corante raman de marcadores proteicos distintos e células HeLa paraformaldeído-fixo cortex cerebral do camundongo e tecido FFPE rim úmido foram realizadas através de rotulagem imuno. A imagem imuno-eprSRS de células HeLa com uma alfa-tubulina revelou estruturas subcelulares finas, como microtúbulos. A imagem eprSRS de Astrócitos Manchados de MARS 2145 e mars 2228 manchados neurônios de grânulo cerebelar no tecido cerebral do camundongo demonstrou padrões tridimensionais com resolução subcelular.Foi realizada a imagem de fluorescência de rS SRS de sete cores de hormônios e fatores de transcrição no tecido de ilhota congelada do rato. As imagens obtidas revelaram um bom contraste e padrões corretos. Foram realizadas as imagens tandem de fluorescência de oito cores dos marcadores do tipo celular nos tecidos de cerebelo do camundongo fixo paraformaldeído.Diferentes tipos de células foram identificadas, como neurônios de grânulo cerebelar, neurônios Purkinje, astrócitos, oligodenrócitos e neurônios GABAérgicos. Este procedimento pode ser ainda mais combinado com a limpeza tecidual para realizar imagens de proteínas altamente multiplexadas em tecidos intactos espessos. Nosso grupo desenvolveu um protocolo de limpeza de tecido sob medida para isso.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Rejeição de fundo de fluorescência em Ressonância e microspectroscopy Raman espontâneo

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

Bioengenharia

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protocolo Relativo Avaliação hidrodinâmica de Tri-folheto polímero Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal de mão tridimensional Optoacoustic imagem Sonda para Deep Tissue Angiografia Humano e Estudos pré-clínicos funcionais em Tempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Perfusable rede Vascular com um modelo de tecido em um dispositivo Microfluidic

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Estabelecendo co-culturas baseadas em uma única célula de forma determinística com um chip Microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Imagem de fluxo sanguíneo com Doppler Ultrarrápido

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...