Name: highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes
Uploaded: 2022-04-21T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes at JoVE.com

Agradecemos a Ruth A. Singer y Richard K.P. Benninger por proporcionar tejidos de páncreas de ratón. W.M. agradece el apoyo de NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) y del Ejército de los Estados Unidos (W911NF-19-1-0214).

El protocolo se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de experimentación animal (AC-AABD1552) aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia.
1. Preparación de anticuerpos conjugados con colorante Raman
<ol><li>Prepare el tampón de conjugación como ~0.1 M NaHCO3 en tampón PBS, pH = 8.3, almacenar a 4 °C.</li>
	<li>Prepare la solución de sonda MARS (material suplementario) con función de...

<ol>
	<li>Goltsev, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+profiling+of+mouse+splenic+architecture+with+CODEX+multiplexed+imaging.">Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging.</a> Cell. 174 (4), 968-981 (2018).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+(IHC)+and+immunofluorescence+(IF)+staining+and+validation.">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).</li><li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology.">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li><li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+epitope-based+tissue+imaging+for+discovery+and+healthcare+applications.">Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications.</a> Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).</li><li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+protein+composition+and+tissue+organization:+a+primer+for+multiplexed+antibody-based+imaging.">Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging.</a> Nature Methods. , (2021).</li><li>Lin, J. -. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+immunofluorescence+imaging+of+human+tissues+and+tumors+using+t-CyCIF+and+conventional+optical+microscopes.">Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes.</a> eLife. 7, 31657 (2018).</li><li>Black, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CODEX+multiplexed+tissue+imaging+with+DNA-conjugated+antibodies.">CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies.</a> Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).</li><li>Giesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+imaging+of+tumor+tissues+with+subcellular+resolution+by+mass+cytometry.">Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry.</a> Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).</li><li>Keren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIBI-TOF:+A+multiplexed+imaging+platform+relates+cellular+phenotypes+and+tissue+structure.">MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure.</a> Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).</li><li>Gerdes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+single-cell+analysis+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue.">Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IBEX:+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues.">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplex+vibrational+imaging.">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544, 465 (2017).</li><li>Wei, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+preresonance+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).</li><li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+resonant+stimulated+Raman+scattering+micro-spectroscopy.">Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).</li><li>Fujioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+activatable+Raman+probes+for+simultaneous+detection+of+plural+enzyme+activities.">Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).</li><li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly-multiplexed+volumetric+mapping+with+Raman+dye+imaging+and+tissue+clearing.">Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li><li>Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9-Cyanopyronin+probe+palette+for+super-multiplexed+vibrational+imaging.">9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging.</a> Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).</li><li>Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe+design+for+super-multiplexed+vibrational+imaging.">Probe design for super-multiplexed vibrational imaging.</a> Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).</li><li>Qian, N., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplexed+vibrational+probes:+Being+colorful+makes+a+difference.">Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).</li><li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+biomolecules+using+molecule+anchorable+gel-enabled+nanoscale+in-situ+fluorescence+microscopy.">Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy.</a> Nature Portfolio. , (2021).</li><li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+vibrational+imaging+using+expansion+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+understanding+of+&#946;-cell+heterogeneity+and+in+situ+islet+function.">New understanding of &#946;-cell heterogeneity and in situ islet function.</a> Diabetes. 67 (4), 537 (2018).</li><li>Hu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supermultiplexed+optical+imaging+and+barcoding+with+engineered+polyynes.">Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes.</a> Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).</li><li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li><li>. Coherent Raman Scattering Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/</a> (2022)</li></ol>

Aquí, presentamos el protocolo immuno-eprSRS que es ampliamente aplicable a los tipos de tejidos comunes, incluidos los tejidos de ratón recién conservados, los tejidos humanos FFPE y los tejidos de ratón congelados. Immuno-eprSRS ha sido validado para un panel de epítopos en células y tejidos, como se indica en la Tabla 1. Esta plataforma one-shot es particularmente adecuada para aplicaciones donde las estrategias cíclicas no funcionan bien. Por ejemplo, la fluorescencia cíclica es exigente para...

Los sistemas tisulares complejos están compuestos por distintas subpoblaciones celulares cuyas ubicaciones espaciales y redes de interacción están profundamente entrelazadas con sus funciones y disfunciones 1,2. Para revelar la arquitectura del tejido e interrogar su complejidad, el conocimiento de las ubicaciones espaciales de las proteínas a resolución de una sola célula es esencial. Por lo tanto, las tecnologías de imágenes de proteínas altamente multiplexadas han sido cada vez más apreciadas y podrían convertirse en una piedra angular para el estudio de la biología de los tejidos 3,4,5. Los métodos actuales comunes de imágenes de proteínas multiplexadas se pueden clasificar en dos categorías principales. Una es la imagen de inmunofluorescencia en serie que se basa en múltiples rondas de tinción e imágenes de tejidos, y la otra es la citometría de masa de imágenes junto con anticuerpos marcados con metales pesados 6,7,8,9,10,11,12.
Aquí, se introduce una estrategia alternativa para la obtención de imágenes de proteínas basadas en anticuerpos multiplexados. A diferencia de la modalidad de imágenes de fluorescencia prevalente, que solo puede visualizar 4-5 canales simultáneamente debido a los amplios espectros de excitación y emisión (ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) ~ 500 cm-1), la microscopía Raman exhibe un ancho de línea espectral mucho más estrecho (FWHM ~ 10 cm-1) y, por lo tanto, proporciona una multiplexidad escalable. Recientemente, aprovechando el espectro estrecho, se ha desarrollado un nuevo esquema de microscopía Raman llamado microscopía de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia electrónica (epr-SRS), que proporciona una poderosa estrategia para imágenes multiplexadas13. Al sondear los modos vibratorios acoplados electrónicamente de los tintes Raman, epr-SRS logra un efecto de mejora drástico de 1013 veces en las secciones transversales Raman y supera el cuello de botella de sensibilidad de la microscopía Raman convencional (Figura 1A)13,14,15. Como resultado, el límite de detección de epr-SRS se ha reducido a sub-μM, lo que permite la detección Raman de marcadores moleculares interesantes, como proteínas específicas y orgánulos dentro de las células13,16. En particular, utilizando anticuerpos conjugados con colorante Raman, se demostraron imágenes epr-SRS de proteínas específicas en células y tejidos (llamadas inmuno-eprSRS) con una sensibilidad comparable a la inmunofluorescencia estándar (Figura 1B)13,17. Al ajustar la longitud de onda de la bomba en solo 2 nm, la señal epr-SRS estará completamente apagada (Figura 1B), lo que muestra un alto contraste vibratorio.
En el lado de la sonda, se ha desarrollado un conjunto de sondas Raman similares al arco iris llamadas colorantes de dispersión Raman de Manhattan (MARS) para la conjugación de anticuerpos 13,18,19,20. Esta paleta Raman única consiste en nuevos tintes que llevan π triples enlaces conjugados (Material Suplementario), cada uno de los cuales muestra un pico epr-SRS único y estrecho en el rango espectral Bioorthogonal Raman (Figura 1C). Modificando la estructura del cromóforo central y editando isotópicamente ambos átomos del triple enlace (Material Suplementario), se han desarrollado sondas Raman separadas espectralmente. Aprovechando la multiplexidad escalable, la microscopía epr-SRS junto con la paleta de tintes MARS ofrece una estrategia óptica para imágenes de proteínas multiplex de una sola toma en células y tejidos.
Immuno-eprSRS proporciona una estrategia alternativa a los métodos actuales de imágenes de proteínas multiplex con fortalezas únicas. En comparación con los enfoques de fluorescencia con tinción cíclica, imágenes y eliminación de señales, esta plataforma basada en Raman garantiza la tinción e imágenes de una sola ronda. Por lo tanto, elude la complejidad práctica en los procedimientos cíclicos y simplifica en gran medida el protocolo, abriendo así nuevos territorios de imágenes de proteínas multiplexadas. Por ejemplo, aprovechando un protocolo de limpieza de tejidos adaptado a tinte Raman, immuno-eprSRS se ha extendido a tres dimensiones para el mapeo de proteínas altamente multiplexadas en tejidos gruesos intactos17. Se visualizaron más de 10 dianas proteicas a lo largo de tejidos cerebrales de ratón de un milímetro de grosor17. Más recientemente, también se ha demostrado el acoplamiento de inmuno-eprSRS con un protocolo optimizado de microscopía de expansión de retención de biomoléculas (ExM)21, imágenes a nanoescala de una sola toma de múltiples objetivos22. En comparación con la espectroscopia de masaspor imágenes 4,9, epr-SRS no es destructiva y tiene una capacidad de seccionamiento intrínsecamente óptica. Además, epr-SRS es más eficiente en el tiempo en la exploración de tejidos. Por lo general, una región tisular de 0,25 mm2 con un tamaño de píxel de 0,5 μm tarda solo unos minutos en obtener una imagen de un solo canal epr-SRS. Por ejemplo, el tiempo total de imagen de cuatro canales SRS más cuatro canales de fluorescencia en la Figura 4 es de aproximadamente 10 min.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18251</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>625902</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-III-tubulin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>657402</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-III-tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab41489</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131205</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, low gellling temperature</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td>For brain embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (&#945;-tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52866</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GABA B receptor R2&#160; antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB2255</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-18598</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glucagon&#160; antibody produced in mouse (Glucagon)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-514592</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>IR00261-2</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MBP antibody produced in rat (MBP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7349</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-78639</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SAB2500747</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1)</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>06-1379</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab30788</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>KR Electronics</td>
			<td>KR2724</td>
			<td>8 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC 50 Ohm Terminator</td>
			<td>Mini Circuits</td>
			<td>STRM-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cable</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>2249-C</td>
			<td>Coaxial Cable, BNC Male / Male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broadband dielectric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BB1-E03</td>
			<td>750 - 1100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>oil immersion, 1.4 N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 18</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7797</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 18</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24561</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply</td>
			<td>TopWard</td>
			<td>6302D</td>
			<td>Bias voltage is 64 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100CL</td>
			<td>Kinematic Mount for up to 1.3&#34; (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Chicken IgY (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-005-155</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-005-147</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>706-005-148</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-005-151</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-005-152</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-005-153</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>713-005-147</td>
			<td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab71916</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-speed look-in amplifier</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td>DC - 50 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrillarin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5821</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giantin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24586</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-514592</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1790</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High O.D. bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET890/220m</td>
			<td>Filter the Stokes beam and transmit the pump beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1384846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>701265</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated SRS laser system</td>
			<td>Applied Physics &#38; Electronics, Inc.</td>
			<td>picoEMERALD</td>
			<td>picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720&#8211;950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser-scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200MPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>POLARIS-K1-2AH</td>
			<td>2 Low-Profile Hex Adjusters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L0636-5 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass dichroic beam splitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R980-25x36</td>
			<td>980 nm laser BrightLine&#160;single-edge laser-flat dichroic beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801810</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FluoView</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoQuant Plate</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-566-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPlan N</td>
			<td>x25, 1.05-NA, MP, working distance&#8201;=&#8201;2&#8201;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periscope assembly</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RS99</td>
			<td>includes the top and bottom units, &#216;1&#34; post, and clamping fork.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230&#8211;1000 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD95</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>51-6900</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 Medium</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td>gel filtration resin for desalting and buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shielded box with BNC connectors</td>
			<td>Pomona Electronics</td>
			<td>2902</td>
			<td>Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS1010</td>
			<td>350&#8211;1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin 2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>OSS00073G</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-035813</td>
			<td>Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8069</td>
			<td>Primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes

La visualización de una amplia gama de biomarcadores específicos en los tejidos desempeña un papel vital en la exploración de las intrincadas organizaciones de los sistemas biológicos complejos. Por lo tanto, las tecnologías de imágenes altamente multiplexadas han sido cada vez más apreciadas. Aquí, describimos una plataforma emergente de imágenes vibratorias altamente multiplexadas de proteínas específicas con sensibilidad comparable a la inmunofluorescencia estándar a través de imágenes electrónicas de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia (epr-SRS) de colorantes Raman similares al arco iris. Este método elude el límite de los canales resolubles espectralmente en la inmunofluorescencia convencional y proporciona un enfoque óptico de una sola toma para interrogar múltiples marcadores en tejidos con resolución subcelular. Por lo general, es compatible con preparaciones de tejidos estándar, incluidos los tejidos fijos en paraformaldehído, los tejidos congelados y los tejidos humanos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE). Prevemos que esta plataforma proporcionará una imagen más completa de las interacciones proteicas de especímenes biológicos, particularmente para tejidos gruesos intactos. Este protocolo proporciona el flujo de trabajo desde la preparación de anticuerpos hasta la tinción de muestras de tejido, el ensamblaje del microscopio SRS y las imágenes de tejidos epr-SRS.

La Figura 3 muestra imágenes de ejemplo de epr-SRS en diferentes muestras, incluyendo células fijas (Figura 3A), tejidos de ratón fijados en paraformaldehído (PFA) (Figura 3B) y especímenes humanos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE) (Figura 3C). La resolución espacial de la microscopía SRS es limitada por difracción, la resolución lateral típica es de ~ 300 nm y la resolución ...

Watch this Scientific Journal Video about Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes at JoVE.com

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

La imagen electrónica de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia (epr-SRS) de tintes Raman similares al arco iris es una nueva plataforma para imágenes de proteínas basadas en epítopos altamente multiplexados. Aquí, presentamos una guía práctica que incluye preparación de anticuerpos, tinción de muestras de tejido, ensamblaje de microscopio SRS e imágenes de tejido epr-SRS.

Imágenes de tejidos altamente multiplexados con tintes Raman

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...

Las imágenes vibratorias altamente multiplexadas proporcionan un enfoque óptico de una sola toma para interrogar múltiples marcadores de proteínas en tejidos con resolución subcelular. Esta plataforma proporciona una imagen completa de las interacciones proteicas de los sistemas biológicos. La principal ventaja de esta técnica es su multiplexidad sin ciclos.Esta técnica es particularmente adecuada para aplicaciones donde las estrategias de ciclismo no funcionan bien, como en secciones de tejido grueso. Este método permite la caracterización celular individual in situ para comprender las estructuras del sistema complejo, como la construcción de atlas de tejidos, el fenotipado de microambientes tumorales y el circuito cerebral de perfiles. Para comenzar, prepare aproximadamente bicarbonato de sodio molar 0.1 en tampón PBS a PHA 0.3 para usarlo como tampón de conjugación y guárdelo a cuatro grados Celsius.A continuación, prepare tres milimolares solución de sonda MARS con éster de n-hidroxisuccinimida en sulfóxido de dimetilo anhidro. Disolver los sólidos de anticuerpos en el tampón de conjugación a una concentración de dos miligramos por mililitro. Para los anticuerpos disueltos en otros tampones, concéntrelos en un filtro centrífugo y luego agréguelos al tampón de conjugación a una concentración de uno a dos miligramos por mililitro.Para realizar la reacción de conjugación para anticuerpos secundarios, agregue 15 veces el exceso molar de solución de colorante a la solución de anticuerpos en un vial de vidrio lentamente con agitación e incube la mezcla de reacción a temperatura ambiente con agitación durante una hora. Para realizar la purificación, prepare la suspensión agregando 10 mililitros de polvo de resina de filtración de gel en 40 mililitros de tampón PBS en un tubo de 50 mililitros. Mantenga la solución en un baño de agua a 90 grados centígrados durante una hora.Luego decanta el sobrenadante, agrega el PBS hasta 40 mililitros y almacena la suspensión a cuatro grados centígrados. Empaque la columna de exclusión de tamaño con la solución de lodo a la altura de 10 a 15 centímetros, luego enjuague y lave la columna con aproximadamente 10 mililitros de PBS para empacar aún más la resina. Posteriormente, pipetee la mezcla de reacción de conjugación a la columna.Después de cargar la mezcla de reacción, agregue inmediatamente un mililitro de PBS como tampón de elución. Después, recoja el eluyente de la solución conjugada observando el color de la columna o midiendo la absorbancia a 280 nanómetros. Usando el filtro centrífugo, concentre la solución recolectada a uno o dos miligramos por mililitro.Usando una pluma hidrofóbica, dibuje un límite alrededor de las secciones de tejido en la diapositiva. Luego incube los tejidos con 0.3 a 0.5% PBST durante 10 minutos y un tampón de bloqueo durante 30 minutos. Para preparar la solución de tinción primaria, agregue todos los anticuerpos primarios a 200 a 500 microlitros de tampón de tinción a las concentraciones deseadas.Centrifugar la solución de tinción primaria a 13, 000 veces G durante cinco minutos y usar el sobrenadante si aparece precipitado. Luego incube el tejido en la solución primaria de anticuerpos a cuatro grados centígrados durante uno o dos días. Lave los portaobjetos tres veces con 0.3 a 0.5% PBST durante cinco minutos a temperatura ambiente en un frasco de pie de portaobjetos y asegúrese de que los pañuelos estén sumergidos en la solución.Más tarde, incuba el tejido en 200 a 500 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos. Para preparar la solución de tinción secundaria, agregue todos los anticuerpos secundarios a 200 a 500 mililitros de tampón de tinción con las concentraciones deseadas. Luego centrifugue la solución de tinción secundaria a 13, 000 veces G durante cinco minutos y use el sobrenadante si aparece precipitado.A continuación, incube los tejidos en 200 a 500 microlitros de solución secundaria de anticuerpos a cuatro grados centígrados durante uno o dos días. Luego lave las diapositivas dos veces con 0.3 a 0.5% PBST a temperatura ambiente durante cinco minutos cada una. Además, incube con 200 a 500 microlitros de solución DAPI durante 30 minutos.Una vez más, lave las diapositivas tres veces con PBS a temperatura ambiente durante cinco minutos cada una y transfiera las secciones de tejido flotantes a las diapositivas de vidrio con la pipeta de gota de vidrio. Extienda el pañuelo con un cepillo de pañuelos y limpie el entorno con toallitas si es necesario. Posteriormente, monte el tejido en una gota de reactivos antidesvanecimiento con una funda de vidrio y asegúrelo con esmalte de uñas.Para realizar imágenes eprSRS multicanal, ajuste la potencia láser del haz de la bomba a 10 a 40 milivatios y el haz stokes a 40 a 80 milivatios en el panel de control láser. A continuación, establezca el tiempo de permanencia de píxeles en dos a cuatro microsegundos y utilice varios fotogramas con un promedio de 10 a 20 fotogramas en el software de microscopía. Además, ajuste las constantes de tiempo del amplificador de bloqueo a la mitad del tiempo de permanencia de píxeles.Las imágenes de colorante Raman de distintos marcadores de proteínas y células HeLa fijas en la corteza cerebral del ratón fijadas en paraformaldehído y el tejido FFPE renal húmedo se realizaron a través del marcado inmunológico. Las imágenes inmuno-eprSRS de células HeLa con una alfa-tubulina revelaron estructuras subcelulares finas como los microtúbulos. Las imágenes eprSRS de astrocitos teñidos mars 2145 y neuronas granulosas cerebelosas teñidas MARS 2228 en tejido cerebral de ratón demostraron patrones tridimensionales con resolución subcelular.Se realizaron las imágenes en tándem de fluorescencia SRS de siete colores de hormonas y factores de transcripción en tejido de islotes de ratón congelados. Las imágenes obtenidas revelaron un buen contraste y patrones correctos. Se realizaron las imágenes en tándem de fluorescencia SRS de ocho colores de marcadores de tipo celular en tejidos cerebelosos de ratón fijados en paraformaldehído.Se identificaron diferentes tipos de células, como las neuronas granulares cerebelosas, las neuronas de Purkinje, los astrocitos, los oligodendrocitos y las neuronas GABAérgicas. Este procedimiento se puede combinar aún más con la limpieza de tejidos para realizar imágenes de proteínas altamente multiplexadas en tejidos gruesos intactos. Nuestro grupo ha desarrollado un protocolo de limpieza de tejidos adaptado a tinte Raman para ello.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

Investigación

Bioingeniería

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protocolo para la evaluación relativa hidrodinámico de Tri-lámina polimérica Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Detección de barrera interrupción del tejido con un transistor orgánico Electroquímica

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal de mano-tridimensional optoacústica Imaging Sonda de Tejido Profundo Angiografía Humano y Estudios preclínicos funcionales en Tiempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Perfusable Red Vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Imágenes de flujo sanguíneo con Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...