Name: freeze-fracture electron microscopy for extracellular vesicle analysis
Uploaded: 2022-09-16T12:50:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis at JoVE.com

这项研究由斯洛文尼亚研究机构资助（研究核心资金没有。P3-0108 和项目 J7-2594）和 MRIC UL IP-0510 基础设施计划。这项工作有助于成本行动CA17116将围产期衍生物研究转化为治疗方法的国际网络（SPRINT），由COST（欧洲科学和技术合作）支持。作者要感谢琳达·斯特鲁斯、桑贾·恰布拉哈、娜达·帕夫利卡·杜巴里奇和萨宾娜·泽列兹尼克在细胞培养和制备样本方面的技术支持，并感谢马尔科·沃格林克、奥塔·谢尔卡·罗斯和内杰克·德贝维克为准备视频提供的技术帮助。

1. 癌性尿路上皮细胞的培养和EV的分离
注意：提出了从人浸润性膀胱癌尿路上皮细胞（T24）细胞系获得EV的方案。然而，必须优化培养条件以使用其他细胞类型。
<ol><li>将密度为3×10 4个细胞/ cm2的T24细胞放入三个烧瓶中（生长表面为75 cm2），并开始在CO 2培养箱中在37°C和5%CO2下培养3天（图2A）。<ol>
<li>在A-DMEM和F12的1：1（v / v）混合物中使用T24细胞培养基，并补充5%胎牛血清（FBS），4mM谷氨酰胺，100mg / mL链霉素和100 U / mL青霉素。 注意：以下隔离产生在MV中丰富的EV。在开始分离之前，用光学显微镜检查细胞以确认活力和汇合度（图2B）。当T24细胞汇合度为70%时，开始从条件培养基中收集EV。</li>
	</ol>
</li>
	<li>用移液管从烧瓶（T75）中用MVs收集培养基到锥形离心管中（图2C）。在4°C下以300× g 离心10分钟（图2D）。</li>
	<li>小心地将上清液收集到带有移液管的新离心管中（图2E）。</li>
	<li>将上清液在4°C下以2，000× g离心20分钟。</li>
	<li>用移液管小心地将上清液收集到新的离心管中。</li>
	<li>在4°C下以10，000× g 离心40分钟。 寻找管子底部有白色颗粒的存在。 注：如有必要，请更换离心机转子以达到所需的重力。EV颗粒在离心管底部被视为白色颗粒（图2F）;标记其位置以避免在移液过程中丢失沉淀（图2G）。</li>
	<li>用移液管小心地丢弃上清液。向沉淀中加入1.5 mL PBS并重悬含有MV的沉淀。</li>
	<li>在4°C下以10，000× g 离心40分钟，并在管底部寻找白色沉淀的存在。 注意：EV颗粒在离心管底部被视为白色斑块;标记其位置以避免在移液过程中丢失沉淀。</li>
	<li>用移液管小心地丢弃上清液。轻轻地将固定剂2.5%戊二醛加入0.1M二甲酸钠缓冲液（pH 7.2）中。在4°C下静置20分钟（图2H）。 注意：戊二醛和二甲砷酸钠是有毒的。在通风橱中工作，戴上防护手套，并适当地丢弃它们。</li>
	<li>用移液管小心地取出固定剂。向沉淀中加入洗涤缓冲液（0.1M二甲砷酸钠缓冲液）。在4°C下静置10分钟，不要重悬沉淀。</li>
</ol>2. 电动汽车的冷冻
注意：在冷冻之前，首先用甘油冷冻保护样品。
<ol><li>制备0.1M二甲酰亚酸钠缓冲液。除去洗涤缓冲液，在0.1M卡卡代酸缓冲液中加入50μL30%甘油。轻轻地重悬EV以使溶液均匀。在4°C下孵育30分钟。</li>
	<li>用氯仿超声浴中的中心凹坑清洁铜载体5分钟（图3A）。如果使用多个样品，请风干它们并用颜色标记它们（图3B）。使用前，请将载体存放在干燥、干净的地方（例如，在培养皿中的镜头纸上）。请勿徒手触摸托架。<ol>
<li>准备移液器，溶液，滤纸，镊子，立体显微镜，带有氟利昂和液氮（LN2）的杜瓦瓶，金属棒和冷冻管。用LN2冷却它。 注意：在处理LN2 和冷却的氟利昂时，请穿戴防护设备并相应地工作。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在冻结之前再次重悬电动汽车。避免形成气泡。 注：快速执行步骤2.4-2.7。</li>
	<li>在立体显微镜下工作（图3C）。将1.5-1.7μL样品转移到铜载体的中心凹坑中，使凸起的液滴高于铜载体边缘，同时不会将样品溢出边缘（图3D）。如果溢出，请使用滤纸干燥载体的外环。</li>
	<li>将凝固的氟利昂与金属棒混合以再次液化（图3E）。</li>
	<li>用镊子抓住铜载体的外圈，并将其浸入冷却的氟利昂中，轻轻摇动镊子8秒（图3F）。8秒后，快速将载体转移到另一个装满LN2的杜瓦瓶中。</li>
	<li>立即进行压裂或将样品储存在LN2中。在后一种情况下，标记冷冻管并通过将其浸入LN2 中来冷却小瓶和镊子尖端（图3G）。在LN2下，将冷冻的铜载体收集到小瓶中，将其关闭，并将其储存在LN2 容器中（图3H）直到冻结破裂。</li>
</ol>3. EV的断裂和复制品的制作
注意：根据制造商的操作说明准备冷冻压裂装置。（图 4A）。清洁设备的腔室。将铂 （Pt/C） 和碳 （C） 喷枪分别以 45° 和 90° 的角度放置（图 4B）。
<ol><li>启动单元真空系统。当压力达到 6.6 × 10−2 Pa（5 × 10−4 托）时，将单元室冷却至 −150 °C。</li>
	<li>使用干镊子将带有冷冻样品的铜载体转移到冷冻压裂装置中（图4C）。使用低温透射仪或快速工作，以避免样品解冻和冰晶沉积。将载体固定在样品台上。</li>
	<li>等到真空再次达到6.6×10-2 Pa（5×10-4 托），然后将刀温设置为-100°C（图4D）。</li>
	<li>等到真空达到 1.0 × 10−3 Pa （8 × 10−6 托）。</li>
	<li>用双筒望远镜观察样品并小心地接近刀（图4E）。</li>
	<li>通过打开刀的电动运动开始切片样品（图4F），并切片直到样品表面光滑（图4G）。</li>
	<li>对于压裂，关闭切刀的电动运动，然后缓慢手动控制切刀，从而压裂样品（图4H）。为了保护断裂表面在阴影之前不形成冰晶和碎屑，请将刀移到断裂样品上方。</li>
	<li>继续以45°的Pt阴影（图4I，J）。<ol>
<li>准备秒表和/或打开冷冻压裂装置上的石英晶体监测器，这将可以监督样品上铂的厚度。在石英晶体监视器上测量的Pt层的推荐厚度为2.5 nm，对应于给定高张力和电流下的4秒阴影（即Pt阴影速度为0.63 nm / s）。</li>
		<li>在开始阴影之前，将刀从样品上移开。在 Pt/C 喷枪上施加高张力 （1，600 V），并将电流增加到 60 mA。Pt的火花应该出现，并且应该开始遮蔽样品。此时，开始4秒倒计时和/或观察并定位石英晶体监视器上Pt的位置。 注意：C层的推荐厚度为2.5 nm，相当于在给定的高张力和电流下10秒的阴影。</li>
		<li>当获得所需的Pt厚度时，关闭电流和高张力。</li>
	</ol>
</li>
	<li>以90°进行C阴影（即C阴影的速度为0.25 nm / s）。<ol>
<li>在C枪上施加高张力（1，900 V），将电流增加到90 mA，并且应该出现C的火花并开始阴影样品;在那一刻，开始10秒倒计时。当获得所需的C厚度时，关闭电流和高张力。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 清理复本和复本分析
<ol><li>使用样品表中的铜载体，并用镊子将它们转移到12孔瓷板中室温下的蒸馏水中（图4K）。复制品将漂浮在水面上，而载体下沉（图4L）。</li>
	<li>用钢丝环将复制品从蒸馏水中转移到含有次氯酸钠的孔中。盖上盖子，在室温下在通风橱中放置过夜。 注意：次氯酸钠有毒。在通风橱中工作，戴上防护手套，并适当地丢弃它们。</li>
	<li>将复制品转移到ddH2O并洗涤30分钟。重复3次。</li>
	<li>将带有线环的复制品转移到网格铜TEM网格（例如，方形或蜂窝100+网格）。风干网格2小时，然后将其储存在网格存储盒中直到显微镜检查。 注意：通常，网格可以在黑暗，干燥的室温条件下储存数月。</li>
	<li>使用TEM显微镜对复制品进行成像并获得显微照片。<ol>
<li>为此，请插入带有复制品的TEM网格，并根据制造商的操作手册启动TEM成像。可在 80 kV 或 100 kV 下工作。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用TEM上的相机检查样品并以较低和较高的放大倍率获取显微照片。</li>
	<li>分析中小型车的显微照片。要测量中压直径，请使用斐济/ImageJ软件16。根据Hallett等人的说法，MVs的直径是显微照片上测量值的4/π倍。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Willms, E., Cabanas, C., Mager, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+heterogeneity:+Subpopulations,+isolation+techniques,+and+diverse+functions+in+cancer+progression.">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Cocucci, E., Racchetti, G., Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+microvesicles:+Artefacts+no+more.">Shedding microvesicles: Artefacts no more.</a> Trends in Cell Biology. 19 (2), 43-51 (2009).</li><li>Urabe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+for+cancer.">Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 29-39 (2020).</li><li>Tricarico, C., Clancy, J., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+biogenesis+of+shed+microvesicles.">Biology and biogenesis of shed microvesicles.</a> Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).</li><li>Georgantzoglou, N., Pergaris, A., Masaoutis, C., Theocharis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+biomarkers+carriers+in+bladder+cancer:+Diagnosis,+surveillance,+and+treatment.">Extracellular vesicles as biomarkers carriers in bladder cancer: Diagnosis, surveillance, and treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2744 (2021).</li><li>S&#322;omka, A., Urban, S. K., Lukacs-Kornek, V., &#379;ekanowska, E., Kornek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+extracellular+vesicles:+Have+we+found+the+holy+grail+of+inflammation.">Large extracellular vesicles: Have we found the holy grail of inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2723 (2018).</li><li>Han, L., Lam, E. W. F., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment:+Old+stories,+but+new+tales.">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: Old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., Clancy, J. W., Sedgwick, A., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles:+Mediators+of+extracellular+communication+during+cancer+progression.">Microvesicles: Mediators of extracellular communication during cancer progression.</a> Journal of Cell Science. 123, 1603-1611 (2010).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (3), 547-576 (2007).</li><li>Severs, N. J., Robenek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+cytochemistry+in+cell+biology.">Freeze-fracture cytochemistry in cell biology.</a> Methods in Cell Biology. 88, 181-186 (2008).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Hallett, F. R., Nickel, B., Samuels, C., Krygsman, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+vesicle+size+distributions+by+freeze-fracture+electron+microscopy.">Determination of vesicle size distributions by freeze-fracture electron microscopy.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 17 (4), 459-466 (1991).</li><li>Nigro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+microvesicles+is+a+major+issue+of+the+differential+centrifugation+isolation+protocols.">Selective loss of microvesicles is a major issue of the differential centrifugation isolation protocols.</a> Scientific Reports. 11, 3589 (2021).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+(EVs)+characterization.">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1153 (2017).</li><li>Iliev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+exosome+release+by+extracellular+DNA+is+conserved+across+multiple+cell+types.">Stimulation of exosome release by extracellular DNA is conserved across multiple cell types.</a> The FEBS Journal. 285 (16), 3114-3133 (2018).</li><li>Zupan&#269;i&#269;, D., Zakraj&#353;ek, M., Zhou, G., Romih, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localization+of+four+uroplakins+in+urothelial+preneoplastic+lesions.">Expression and localization of four uroplakins in urothelial preneoplastic lesions.</a> Histochemistry and Cell Biology. 136 (4), 491-500 (2011).</li><li>Wu, X. R., Manabe, M., Yu, J., Sun, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+purification+and+immunolocalization+of+bovine+uroplakins+I,+II,+and+III.+Molecular+markers+of+urothelial+differentiation.">Large scale purification and immunolocalization of bovine uroplakins I, II, and III. Molecular markers of urothelial differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 19170-19179 (1990).</li><li>Kreft, M. E., Hudoklin, S., Jezernik, K., Romih, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maintenance+of+blood-urine+barrier+in+urothelium.">Formation and maintenance of blood-urine barrier in urothelium.</a> Protoplasma. 246 (1-4), 3-14 (2010).</li><li>Kreft, M. E., Robenek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+replica+immunolabelling+reveals+urothelial+plaques+in+cultured+urothelial+cells.">Freeze-fracture replica immunolabelling reveals urothelial plaques in cultured urothelial cells.</a> PLoS One. 7 (6), 38509 (2012).</li><li>Robenek, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+lipid+droplet-associated+proteins:+Insights+from+freeze-fracture+replica+immunogold+labeling.">Topography of lipid droplet-associated proteins: Insights from freeze-fracture replica immunogold labeling.</a> Journal of Lipids. 2011, 409371 (2011).</li></ol>

作者声明没有利益冲突。

在开始下游分析（如“组学”研究或功能研究）之前，MV或任何其他孤立的EV群体的表征至关重要11，18。本文通过离心分离来自人浸润性膀胱癌尿路上皮T24细胞的EV，并按照提供的冷冻骨折电子显微镜分析方案，我们证明分离的部分富集在MVs11，13中。MV的分离没有细胞碎片或细胞器，证实了成功的分离和纯化方案。
化学固定和冷冻的结合是协议的关键步骤，保留了EV12的球形。但是，在通过冻结压裂17评估EV直径时需要采取预防措施。由于裂缝随机穿过样品，因此中压膜被分成赤道平面和非赤道平面。为了提供一种分析冻结断裂和阴影标本图像的严格方法，Hallett等人表明，平均囊泡直径是图像17上水泡直径实际大小的4/π倍。考虑到这一点，来自T24电池的EV的直径为304 nm，这符合MV的理论尺寸分布范围100-1000 nm19。
冷冻压裂可以补充负染色，这是用于可视化EV的最广泛使用的TEM技术。通过负染色，样品通常被化学固定，干燥并附着在TEM网格上，并与铀酰溶液形成对比。如果没有支持媒体，电动汽车往往会崩溃，这使它们具有杯形外观。通过冷冻压裂，我们表明MV是球体，它在细胞外空间和体液中反映了它们的形状12。因此，我们的结果也与冷冻超薄部分20中对EV的观察结果一致。
冷冻断裂技术的一个关键优势是它能够解决限制膜的内部组织，这是了解EV如何靶向受体膜并与受体膜相互作用的关键因素。在这里，我们分析了MV的膜，但冷冻压裂可以揭示任何其他EV群体的膜组织。MV由质膜萌芽形成;因此，质膜蛋白和蛋白簇有望在MV膜中发现。我们的结果支持来自T24细胞的MV含有膜内颗粒，呈现完整的膜蛋白。基于E面和P面之间的颗粒分布，可以合理地期望在MV中观察到的颗粒是跨膜蛋白尿素蛋白，其是尿路上皮细胞特异性21，24。观察到的颗粒是稀疏的，这与先前的研究报告在尿路上皮癌变过程中尿素减少21，22，23一致。然而，为了进一步研究MV膜的蛋白质组成，建议使用冷冻骨折复制免疫标记（FRIL）技术。FRIL是所提出的冷冻断裂技术的升级，致力于通过抗体识别24，25揭示复制品中蛋白质的身份。综上所述，冷冻断裂技术是一种电子显微镜技术，适用于表征EV限制膜，以及分离的EV级分的形状，尺寸和纯度。所提出的方案也可用于评估其他孤立的EV人群;因此，冷冻压裂技术值得纳入国际细胞外囊泡学会指南，用于探索EV限制膜组织的研究。

细胞外囊泡（EV）是从细胞释放到细胞外空间的膜受限囊泡。EV的三个主要群体是外泌体，微囊泡（MV）和凋亡体，它们的起源，大小和分子组成不同1，2，3。EV的组成反映了供体细胞的分子谱及其生理状态（即健康或患病）4，5。这使得电动汽车在人类疾病的诊断，预后和治疗方面具有巨大的潜力，并且它们在个性化医疗中具有广阔的医疗应用6，7，8。
电动汽车是细胞间通信的介质。它们含有生物活性蛋白，脂质和RNA，它们干扰受体细胞中的生物过程并可以改变其行为9，10。然而，EV限制膜的组成对于与受体细胞膜的相互作用至关重要。
电动汽车的来源是体液和条件培养基。为了隔离EV群体，必须使用合适的隔离技术。例如，在10，000×g下离心产生以MV为单位富集的分数，而离心力为≥100，000×g 产生在外泌体中富集的分数11，12。电动汽车的分离部分必须在纯度，尺寸和形状方面进行验证。为此，国际细胞外囊泡学会2018推荐了三类高分辨率成像技术：电子显微镜，原子力显微镜和基于光学显微镜的超分辨率显微镜13。这些技术都不能提供有关EV膜内部的信息。
冻裂电子显微镜是一种打破冷冻标本以揭示其内部结构的技术，特别是提供膜内部的视图。样品制备的步骤是（1）快速冷冻，（2）压裂，（3）制作复制品，和（4）清洗复制品14。在步骤1中，样品（可选地）化学固定，用甘油冷冻保护，并在液体氟利昂中冷冻。在步骤2中，冷冻试样在冷冻断裂单元中断裂，该单元暴露膜双层的内部。在步骤3中，暴露的断裂面被铂（Pt）和碳（C）遮蔽以产生复制品。在步骤4中，有机材料被除去。在透射电子显微镜（TEM）中分析复制品。为了准确解释显微照片，必须遵循其正确方向的指南14，15。简而言之，显微照片中阴影的方向是参考，用于定位显微照片（即确定Pt阴影的方向），从而确定凸形和凹形（图1）。通过冷冻压裂膜分裂膜可以看到两个称为膜双层断裂面的内部视图：原生质面（P面）和外质面（E面）。P面代表与细胞原生质相邻的膜小叶，而E面代表与细胞外空间相邻的膜小叶。整体膜蛋白及其关联被视为突出的膜内颗粒14，15。
在这里，目标是应用冷冻断裂技术来表征MV的尺寸，形状和限制膜的结构。在这里，我们提出了一种用于分离和冷冻压裂来自人类浸润性膀胱癌性尿路上皮细胞的MV的方案。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A-DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>12491015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balzers freeze-fracture device</td>
			<td>Balzers AG, Liechtenstein</td>
			<td>Balzers BAF 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator HeraCell&#160;</td>
			<td>Heraues, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper carriers</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>BB 113 142-2</td>
			<td>100+ mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids</td>
			<td>SPI, United States</td>
			<td>2010C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask T75</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>growing surface 75 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 (HAM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>21765029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glazed Porcelain Plate 6 Well</td>
			<td>Fischer Sientific, United States</td>
			<td>50-949-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Kemika, Croatia</td>
			<td>711901</td>
			<td>final concentration 30 % (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaradehyde&#160;</td>
			<td>Serva, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td>final concentration 2.5 % (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050-079</td>
			<td>final concentration 4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>final concentration 100 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contast inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>model Eclipse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>A 4-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipetts</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>50mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochloride solution in water</td>
			<td>Carlo Erba, Italy</td>
			<td>481181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>final concentration 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Philips, The Netherlands</td>
			<td>model CM100</td>
			<td>working at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>SPI, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

freeze-fracture electron microscopy for extracellular vesicle analysis

细胞外囊泡（EV）是从细胞释放到细胞外空间的膜限制结构，与细胞间通讯有关。EV由三个囊泡种群组成，即微囊泡（MV），外泌体和凋亡体。EV的限制膜与受体细胞的相互作用至关重要，这可能导致生物活性分子转移到受体细胞，从而影响它们的行为。冷冻-断裂电子显微镜技术用于研究生物膜的内部组织。在这里，我们提出了一种从培养的癌性尿路上皮细胞中分离MV的方案，以及通过快速冷冻，断裂，制造和清洁复制品的步骤以及MV的冷冻断裂，并用透射电子显微镜分析它们。结果表明，分离方案产生均匀的EV群体，其对应于MV的形状和大小，膜内颗粒主要存在于限制膜的原生质面中。因此，冷冻断裂是表征MV的直径，形状和膜蛋白分布的首选技术。所介绍的协议适用于其他电动汽车群体。

在差异离心后，从癌症尿路上皮T24细胞的条件培养基中分离MV。根据协议，EV级分在10，000× g 下离心后首次检测到，当时它被视为白色颗粒（图2G）。
接下来，根据上述协议对EV进行处理，并在TEM下进行检查。Pt/C 阴影产生（图 4L）相对较大的副本，这些副本在清理步骤中经常分解成较小的碎片。在TEM网格上挑选大型复制品及其较小的碎片，并在显微镜下进行比较。结果表明，无论复制品表面的大小如何，其质量没有差异，因此它们都可以使用。低放大倍率检查显示复制品的区域具有i）均匀的表面（背景），ii）凹凸的球形轮廓（囊泡），以及iii）受损表面的区域（伪影; 图 5A）。典型的伪影被视为破裂，褶皱和不规则的变暗阴影（即标本上冰晶沉积物的复制品）。同样重要的是要注意，没有看到细胞碎片或细胞器，证实了样品的纯度（图5B）。
分离出的水疱通常以三个或更多个的簇聚集或单独分布（图5B）。囊泡是球形的，这表明在分离，固定和冷冻过程中可以很好地保存超微结构（图5C）。偶尔看到的“平球”和细长囊泡（图5C）可能是制备的伪影，并且不包括在随后的囊泡直径测量中。可见光轮廓的直径为238.5 nm（±8.0 nm，n = 190），考虑到Hallett等人提出的校正因子，其对应于平均囊泡直径304 nm（±10 nm; 图 5D）。尺寸与100 nm至1000 nm之间的MV直径范围相关，证明了所用隔离方案的有效性。囊泡的图像以及直径测定明确证实分离物中的EV富含MV。
对复制品的分析揭示了MV限制膜的P面和E面的组织。观察到MV为凹凸圆形（图5C，E，F），反映了断裂平面。凸起的形状代表E面（即膜的断裂外质小叶; 图 5E）。电动汽车的外质面具有光滑，均匀的外观。凹面形状对应于P面（图5F）。在P面中，在光滑的膜内看到一些突出的膜内颗粒（图5C，F）。这意味着从癌症尿路上皮T24细胞分离的MV仅含有少量的膜蛋白。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig01.jpg"> 图1：冷冻破裂后膜测定的示意图 （A）微囊泡芽从质膜进入细胞外空间。（B）微囊泡被P-和E-膜小叶限制，直到冷冻分级，其分裂小叶并暴露小叶的内部视图，称为骨折面。（C）Pt / C阴影后，可以识别出两个骨折面：具有面向细胞质（原生质）的凸形的原生质面（P面）和具有面向细胞外间隙的凹形的外质面（E面）。 图 1 是使用 Biorender.com 创建的。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig02.jpg"> 图2：在CO 2培养箱中生长的EV的分离（A）用（B）光学显微镜检查其在MV分离之前的活力和汇合度。（C）收集细胞培养基，（D）每次收集上清液时以300×g和2，000×g（E）连续离心。（F，G）在10，000×g离心后，可见并标记出指示沉淀的白色斑块。除去上清液，并将（H）固定剂小心地添加到沉淀中而不重复使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig03.jpg"> 图3：电动汽车的冷冻 （A）带有中心凹坑的风干清洁铜载体在加工前（B）标记。将微囊泡重悬于甘油中以获得均匀的样品，并将（C）添加到立体显微镜下库珀载体的中心坑中。（D）必须添加一定体积的样品，使其在中心凹坑中形成凸起的液滴。（E）在冷冻前立即将LN2冷却的氟利昂与金属棒混合以液化氟利昂。（F）通过将样品浸没在氟利昂中冷冻，然后（G）将其转移到LN2中。（H）带有冷冻样品的载体可以收集到冷冻管中并储存在LN2 杜瓦瓶中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig04.jpg"> 图 4：冷冻压裂和制作复制品 （A） 冷冻压裂装置。单元室（B）内有铂（Pt）和碳（C）电子枪，一把刀和样品台。（C）为了开始压裂，将带有样品的载体转移到样品台上，（D）冷却冷冻压裂装置，并建立真空。（E）切口是通过电动（F）移动刀完成的，但压裂最好是手动完成的。（G）切片前的样品和（H）压裂后的样品。（I）压裂后立即制作复制品。（J）在此过程中，Pt在样品上被阴影覆盖。铂金阴影被视为室内的明亮光线（火花）。（K）将样品载体收集到装满水的瓷井中。（L）复制品（箭头）在清洗步骤中漂浮在次氯酸钠溶液中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig05.jpg"> 图5：冻裂和Pt / C阴影MV的电子显微照片 （A）冷冻断裂和阴影EV颗粒的概述（i）在较低放大倍率下。均匀的表面是背景（ii），明亮的区域是复制品中的破裂（iii），较暗的区域是复制品的褶皱（星号），不规则的较暗阴影是由于冰晶（两个星号）。（B）具有凹面和凸面的圆形EV集群。（C） EV的高放大倍率。在EV膜P面的凸形骨折中，可以看到膜内颗粒（箭头）和光滑表面的斑块（箭头）。发现具有细长（星形）和平球形（两颗星）的细胞外囊泡。（D）根据Hallett等人提出的尺寸测量，分离的尿路上皮MV的平均直径为304nm±10nm。数据以平均值表示±SEM.（E，F）MV的E面和P面，图例：箭头=P面中的膜内颗粒，环绕箭头=Pt / C阴影的方向。比例尺：A = 10 μm，B-F = 400 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

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Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis

我们提出了一种用于分离和冷冻压裂来自癌性尿路上皮细胞的细胞外囊泡（EV）的方案。冷冻断裂技术揭示了EV的直径和形状，并且作为一个独特的特征 ，EV膜的内部组织。这些对于了解电动汽车如何与受体膜相互作用非常重要。

用于细胞外囊泡分析的冻裂-断裂电子显微镜

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-limited structures released from the cells into the extracellular space and are implicated in intercellular ...

在视频中，我们介绍了一种在体外冷冻压裂来自膀胱癌细胞的细胞外囊泡的方案。细胞外囊泡是膜受限囊泡，来源于细胞释放到细胞外空间并在细胞间通讯中起作用。在细胞外囊泡中，我们区分了三个群体，外泌体，微泡泡和凋亡体，它们的起源，大小和分子组成各不相同。细胞外囊泡的分子组成反映了供体细胞的分子谱并干扰受体细胞中的生物过程。然而，细胞囊泡限制膜的组成对于与受体细胞膜的相互作用至关重要。为了分析限制膜的组织，必须首先分离细胞外囊泡，然后接近冷冻断裂技术。冷冻断裂是一种电子显微镜技术，专门用于研究生物膜（包括囊泡）的二维组织。冷冻-压裂的步骤是快速冷冻试样，压裂试样，制作冻裂断裂表面的复制品，清洗复制品以去除生物材料。复制品最终用透射电子显微镜可视化。我们的目标是使用冷冻断裂技术从形状，大小和膜组成的角度表征微囊泡。从细胞培养箱中的细胞生长开始。在显微镜下检查细胞以确认其变异性和汇合度。将带有微囊泡的培养基收集到管中，并以300g力离心10分钟。收集上清液。随后，在2000 g力和10， 000 g力下离心上清液。之后，观察管的尖端是否有指示微囊泡的白色颗粒。小心地除去上清液。加入1.5毫升PBS，并重新悬浮含有微囊泡的颗粒。然后以10， 000 g力离心。观察白色颗粒。取出上清液，轻轻加入固定剂。在 4 摄氏度下静置 20 分钟。接下来，取出固定剂，并加入洗涤缓冲液冲洗沉淀而不重新悬浮。在 4 摄氏度下静置 10 分钟。除去洗涤缓冲液，加入30%甘油至沉淀。将沉淀重新悬浮成均匀的悬浮液，并在4摄氏度下孵育30分钟。准备带有中心凹坑的清洁铜载体，并开发带有皱眉和液氮的烧瓶。在显微镜下，将样品转移到铜载体的中心坑中。混合凝固的氟利昂变成液化。用镊子抓住载体的外圈，并将其浸入冷却的氟利昂中。八秒钟后，迅速将载体转移到装有液氮的显影瓶中。马克哭泣和冷却它。在液氮下将载体收集到病毒中，将其关闭，并储存在液氮容器中直至冻结破裂。根据制造商的操作说明准备冷冻分数单位。启动真空系统并将单元室冷却至零下150摄氏度。将带有冷冻样品的铜载体转移到冷冻分馏装置中。将刀温设置为零下100摄氏度，等待真空。通过打开刀具的电动运动开始切片样品，直到样品表面光滑。对于压裂，请关闭刀具的电动运动，并继续缓慢手动控制刀具。继续以45度角进行铂金阴影。打开高压并增加铂金枪的电流。铂金的火花应该开始遮蔽样品。监督铂在石英晶体厚度监视器上的位置。铂金的推荐厚度为2.5纳米。关闭电流和高张力。以90度角继续进行碳阴影。打开高压并增加碳枪的电流。碳的火花应该开始遮蔽样品。当获得2.5纳米的碳时，关闭电流和高张力。将这些带有复制品的样品从冷冻压裂装置转移到装有双蒸馏水的12阀板中。复制品将漂浮在水面上，而载体下沉。将带有钢丝环的复制品转移到充满次氯酸钠的12阀板中，并孵育过夜。在双蒸馏水中清洗复制品。将它们收集在网状铜TM炉排上，并让它们在空气中干燥两个小时。使用透射电子显微镜对复制品进行成像并获得显微照片。为了准确解释复制品和显微照片，请遵循正确命名方向的指南。对复制品的分析表明，分离的条件培养基含有富集的囊泡部分。孤立的囊泡要么聚集在三个或更多个簇中，要么非常单独分布。囊泡呈球形。囊泡的直径对应于微囊泡的直径。冷冻压裂也揭示了微囊泡膜的二维组织。微泡的外质相具有光滑，均匀的外观，而在原生质体阶段，我们观察到膜间颗粒。膜间颗粒零星出现，这意味着从癌物质细胞中分离出的微囊泡仅含有少量的膜蛋白或蛋白质组装体。总而言之，所提出的方案中使用的冷冻骨折技术被证明是表征细胞外囊泡的最佳技术，可用于评估其他细胞外囊泡群体。冷冻骨折技术的一个关键优点是它能够解决囊泡限制膜的内部组织，这决定了细胞外囊泡的生物学功能。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

骨肉瘤前小鼠模型对肿瘤与间充质干细胞细胞外囊泡介导通信的定义

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

科研

癌症研究

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