Name: freeze-fracture electron microscopy for extracellular vesicle analysis
Uploaded: 2022-09-16T12:50:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis at JoVE.com

Cette recherche a été financée par l’Agence slovène de recherche (financement de base de la recherche no. P3-0108 et projet J7-2594) et le programme d’infrastructure MRIC UL IP-0510. Ces travaux contribuent à l’action COST CA17116 International Network for Translating Research on Perinatal Derivatives into Therapeutic Approaches (SPRINT), soutenu par COST (European Cooperation in Science and Technology). Les auteurs tiennent à remercier Linda Štrus, Sanja Čabraja, Nada Pavlica Dubarič et Sabina Železnik pour leur aide technique pour la culture cellulaire et la préparation des échantillons, ainsi que Marko Vogrinc, Ota Širca Roš et Nejc Debevec pour leur aide technique à la préparation de la vidéo.

1. Culture des cellules urothéliales cancéreuses et isolement des VE
REMARQUE : Un protocole pour obtenir des VE à partir d’une lignée cellulaire urothéliale (T24) du cancer de la vessie invasive humaine est présenté. Cependant, les conditions de culture doivent être optimisées pour utiliser d’autres types de cellules.
<ol><li>Plaque de cellules T24 d’une densité de 3 × 104 cellules/cm2 dans trois flacons (surface de croissance de 75 cm2) et commencent par cultiver les cellules dans un incubateur à CO2 pendant 3 jours à 37 °C et 5 % de CO2 (Figure 2A).<ol>
<li>Utiliser un milieu de culture pour les cellules T24 dans un mélange 1:1 (v/v) d’A-DMEM et de F12 complété par 5 % de sérum fœtal bovin (FBS), 4 mM de glutamax, 100 mg/mL de streptomycine et 100 U/mL de pénicilline. REMARQUE: L’isolation suivante produit des véhicules électriques enrichis en véhicules électriques. Avant de commencer l’isolement, inspectez les cellules avec un microscope optique pour confirmer la viabilité et la confluence (Figure 2B). Commencez à collecter les VE à partir du milieu de culture conditionné lorsque les cellules T24 sont à 70% de confluence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir le milieu de culture avec des MV à l’aide d’une pipette de flacons (T75) dans des tubes centrifuges coniques (Figure 2C). Centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C (Figure 2D).</li>
	<li>Recueillir soigneusement le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse à l’aide de la pipette (Figure 2E).</li>
	<li>Centrifuger le surnageant à 2 000 × g pendant 20 min à 4 °C.</li>
	<li>Collectez soigneusement le surnageant avec la pipette dans un nouveau tube de centrifugeuse.</li>
	<li>Centrifuger à 10 000 × g pendant 40 min à 4 °C. Recherchez la présence d’une pastille blanchâtre au fond du tube. REMARQUE: Si nécessaire, changez le rotor de la centrifugeuse pour atteindre la force g requise. La pastille EV est vue comme une pastille blanche au fond du tube de centrifugeuse (Figure 2F); marquer son emplacement pour éviter de perdre la pastille pendant le pipetage (Figure 2G).</li>
	<li>Jetez soigneusement le surnageant avec une pipette. À la pastille, ajouter 1,5 mL de PBS et remettre en suspension la pastille contenant des MV. Placer la suspension dans un nouveau tube de centrifugeuse.</li>
	<li>Centrifuger à 10 000 × g pendant 40 min à 4 °C et rechercher la présence d’une pastille blanche au fond du tube. REMARQUE: La pastille EV est vue comme une tache blanche au fond du tube de centrifugeuse; marquer son emplacement pour éviter de perdre la pastille pendant le pipetage.</li>
	<li>Jetez soigneusement le surnageant avec une pipette. Ajouter doucement le fixateur, 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate de sodium de 0,1 M (pH 7,2). Laisser reposer 20 min à 4 °C (Figure 2H). ATTENTION : Le glutaraldéhyde et le cacodylate de sodium sont toxiques. Travaillez dans une hotte aspirante, portez des gants de protection et jetez-les de manière appropriée.</li>
	<li>Retirez soigneusement le fixateur à l’aide d’une pipette. Ajouter un tampon de lavage (tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M) à la pastille. Laisser reposer 10 min à 4 °C sans remettre la pastille en suspension.</li>
</ol>2. Congélation des véhicules électriques
REMARQUE: Avant la congélation, cryoprotégez d’abord les échantillons avec du glycérol.
<ol><li>Préparer un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M. Retirez le tampon de lavage et ajoutez 50 μL de glycérol à 30 % dans un tampon cacodylate de 0,1 M. Remettez doucement en suspension les véhicules électriques pour rendre la solution homogène. Incuber pendant 30 min à 4 °C.</li>
	<li>Nettoyez les supports en cuivre avec une fosse centrale dans le bain à ultrasons avec du chloroforme pendant 5 min (Figure 3A). Séchez-les à l’air libre et marquez-les avec des couleurs si vous utilisez plusieurs échantillons (Figure 3B). Jusqu’à utilisation, conservez les supports dans un endroit sec et propre (par exemple, sur du papier à lentilles dans une boîte de Pétri). Ne touchez pas les supports à mains nues.<ol>
<li>Préparez des pipettes, des solutions, du papier filtre, une pince à épiler, un stéréomicroscope, une fiole Dewar avec du fréon et de l’azote liquide (LN2), une tige métallique et des cryoviales. Refroidissez-le avec LN2. ATTENTION : Portez un équipement de protection et travaillez en conséquence lorsque vous manipulez du LN2 et du fréon refroidi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remettez en suspension les véhicules électriques avant de les geler. Évitez la formation de bulles d’air. REMARQUE: Effectuez rapidement les étapes 2.4 à 2.7.</li>
	<li>Travailler sous stéréomicroscope (Figure 3C). Transférer 1,5 à 1,7 μL de l’échantillon dans la fosse centrale du support de cuivre pour effectuer une chute convexe atteignant plus haut que le bord du support de cuivre sans renverser l’échantillon sur le bord (Figure 3D). En cas de débordement, utilisez du papier filtre pour sécher l’anneau extérieur du support.</li>
	<li>Mélanger le fréon solidifié avec une tige métallique pour le liquéfier à nouveau (Figure 3E).</li>
	<li>Saisissez l’anneau extérieur du support en cuivre avec une pince à épiler et immergez-le dans du fréon refroidi en secouant doucement les pinces à épiler pendant 8 s (Figure 3F). Après 8 s, transférez rapidement le porte-bagages dans une autre fiole Dewar remplie de LN2.</li>
	<li>Procéder immédiatement à la fracturation ou au stockage des échantillons dans LN2. Dans ce dernier cas, marquez un cryovial et refroidissez les embouts du flacon et de la pince en les immergeant dans LN2 (Figure 3G). Sous LN2, recueillir les supports de cuivre congelés dans le flacon, le fermer et les stocker dans le récipient LN2 (Figure 3H) jusqu’à la fracturation par congélation.</li>
</ol>3. Fracturation des véhicules électriques et fabrication des répliques
REMARQUE: Préparez l’unité de congélation-fracturation conformément aux instructions d’utilisation du fabricant. (Figure 4A). Nettoyez la chambre de l’appareil. Positionnez les canons en platine (Pt/C) et en carbone (C) à des angles de 45° et 90°, respectivement (Figure 4B).
<ol><li>Démarrez le système de vide unitaire. Lorsque la pression de 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) est atteinte, refroidir la chambre de l’unité à −150 °C.</li>
	<li>Transférer les supports de cuivre avec des échantillons congelés dans une unité de congélation-fracturation à l’aide d’une pince à épiler sèche (figure 4C). Utilisez le cryotransfert ou travaillez rapidement pour éviter de décongeler l’échantillon et de déposer les cristaux de glace. Fixez les supports sur la table d’échantillonnage.</li>
	<li>Attendez que le vide atteigne à nouveau 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr), puis réglez la température du couteau à −100 °C (Figure 4D).</li>
	<li>Attendez que le vide atteigne 1,0 × 10−3 Pa (8 × 10−6 Torr).</li>
	<li>Observez l’échantillon avec des jumelles et approchez-vous soigneusement du couteau (Figure 4E).</li>
	<li>Commencez à sectionner l’échantillon en allumant le mouvement motorisé du couteau (figure 4F) et de la section jusqu’à ce que la surface de l’échantillon soit lisse (figure 4G).</li>
	<li>Pour la fracturation, éteignez le mouvement motorisé du couteau et procédez à un contrôle manuel lent du couteau, fracturant ainsi l’échantillon (Figure 4H). Afin de protéger la surface fracturée de la formation de cristaux de glace et de débris jusqu’à l’ombre, déplacez le couteau au-dessus de l’échantillon fracturé.</li>
	<li>Procédez avec l’ombrage Pt à 45° (Figure 4I, J).<ol>
<li>Préparez un chronomètre et/ou allumez le moniteur à cristaux de quartz sur l’unité de congélation-fracturation, ce qui permettra de surveiller l’épaisseur du Pt sur l’échantillon. L’épaisseur recommandée de la couche Pt mesurée sur le moniteur à cristaux de quartz est de 2,5 nm, ce qui correspond à 4 s d’ombrage à une tension et un courant élevés donnés (c’est-à-dire que la vitesse de l’ombrage Pt est de 0,63 nm / s).</li>
		<li>Avant de commencer l’ombrage, éloignez le couteau de l’échantillon. Appliquez une tension élevée sur le pistolet Pt/C (1 600 V) et augmentez le courant à 60 mA. Des étincelles de Pt doivent apparaître et commencer à ombrer l’échantillon. À ce stade, lancez le compte à rebours de 4 s et/ou observez et localisez la position de Pt sur le moniteur à quartz. REMARQUE: L’épaisseur recommandée de la couche C est de 2,5 nm, ce qui correspond à 10 s d’ombrage à une tension et un courant élevés donnés.</li>
		<li>Éteignez le courant et la haute tension lorsque l’épaisseur souhaitée de Pt est obtenue.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procédez avec l’ombrage C à 90° (c’est-à-dire que la vitesse de l’ombrage C est de 0,25 nm/s).<ol>
<li>Appliquer une tension élevée sur le canon C (1 900 V), augmenter le courant à 90 mA et des étincelles de C devraient apparaître et commencer à ombrer l’échantillon; à ce moment-là, commencez le compte à rebours de 10 s. Éteignez le courant et la haute tension lorsque l’épaisseur souhaitée de C est obtenue.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Nettoyage des répliques et analyse des réplicas
<ol><li>Utilisez les supports en cuivre de la table d’échantillonnage et transférez-les avec une pince à épiler dans de l’eau distillée à température ambiante dans une plaque en porcelaine de 12 puits (Figure 4K). Les répliques flotteront à la surface de l’eau, tandis que les porteurs couleront (Figure 4L).</li>
	<li>Transférer les répliques avec une boucle métallique de l’eau distillée dans un puits avec de l’hypochlorite de sodium. Couvrir et laisser reposer toute la nuit à température ambiante dans une hotte. ATTENTION : L’hypochlorite de sodium est toxique. Travaillez dans une hotte aspirante, portez des gants de protection et jetez-les de manière appropriée.</li>
	<li>Transférer les répliques dans ddH2O et laver pendant 30 min. Répétez 3 fois.</li>
	<li>Transférez les répliques avec une boucle de fil vers une grille TEM en cuivre maillé (par exemple, maille carrée ou nid d’abeille 100+). Séchez les grilles à l’air libre pendant 2 h, puis stockez-les dans une boîte de stockage en grille jusqu’à la microscopie. REMARQUE: Généralement, les grilles peuvent être stockées pendant des mois dans des conditions sombres, sèches et à température ambiante.</li>
	<li>Utilisez un microscope TEM pour imager les répliques et obtenir des micrographies.<ol>
<li>Pour ce faire, insérez une grille TEM avec une réplique et démarrez l’imagerie TEM conformément aux manuels d’utilisation du fabricant. Travailler à 80 kV ou 100 kV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inspectez l’échantillon et acquérez des micrographies à des grossissements de plus en plus élevés avec une caméra sur TEM.</li>
	<li>Analyser les micrographies des MV. Pour les mesures des diamètres MV, utilisez le logiciel Fiji/ImageJ16. Le diamètre des MV est 4/π fois la mesure sur les micrographies selon Hallett et al.17.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La caractérisation des MV, ou de toute autre population de VE isolés, est d’une importance primordiale avant de commencer les analyses en aval comme les études « omiques » ou les études fonctionnelles11,18. Ici, les VE provenant de cellules Urothéliales T24 invasives du cancer de la vessie humaine ont été isolés par centrifugation, et en suivant le protocole fourni pour l’analyse par microscopie électronique par congélation-fracture, nous avons démontré que la fraction isolée était enrichie en MV11,13. L’isolat des MV était dépourvu de débris cellulaires ou d’organites, confirmant un protocole d’isolement et de purification réussi.
La combinaison de la fixation chimique et de la congélation, qui sont des étapes critiques du protocole, a conservé la forme sphérique des VE12. Cependant, des précautions sont nécessaires lors de l’évaluation du diamètre des VÉHICULES par congélation-fracturation17. Étant donné que la fracture traverse l’échantillon de manière aléatoire, les membranes MV sont divisées en leurs plans équatorial et non équatorial. Pour fournir une méthode rigoureuse d’analyse des images d’échantillons fracturés par gel et ombragés, Hallett et al. ont montré que le diamètre moyen des vésicules est 4/π fois la taille réelle du diamètre vésiculeux sur l’image17. En tenant compte de cela, les VE des cellules T24 ont été calculés pour avoir un diamètre de 304 nm, ce qui correspond à la plage de distribution de taille théorique du MV de 100-1000 nm19.
La fracturation par congélation peut compléter la coloration négative, la technique TEM la plus largement utilisée pour visualiser les véhicules électriques. Par coloration négative, l’échantillon est généralement fixé chimiquement, séché et attaché à une grille TEM, et contrasté avec une solution d’uranyle. Sans supports, les véhicules électriques ont tendance à s’effondrer, ce qui leur donne une apparence en forme de coupe. Par congélation-fracturation, nous montrons que les MV sont des sphères, qui reflètent leur forme dans les espaces extracellulaires et les fluides corporels12. De ce fait, nos résultats sont également en accord avec les observations des VE dans les sections cryo-ultraminces20.
Un avantage crucial de la technique de congélation-fracture est son pouvoir de résoudre l’organisation interne de la membrane limitante, qui est un facteur clé pour comprendre comment les VE sont ciblés et interagissent avec les membranes réceptrices. Ici, nous avons analysé les membranes des MV, mais la fracturation par congélation pourrait révéler l’organisation membranaire de toute autre population de VE. Les MV sont formés par le bourgeonnement de la membrane plasmique; par conséquent, on s’attend à ce que des protéines de la membrane plasmique et des grappes de protéines se trouvent dans la membrane MV. Nos résultats ont confirmé que les MV des cellules T24 contenaient des particules intramembranaires, présentant des protéines membranaires intégrales. Sur la base de la distribution des particules entre la face E et la face P, il est raisonnable de s’attendre à ce que les particules observées dans les MV soient des protéines transmembranaires uroplakines, qui sont des cellules urothéliales spécifiques21,24. Les particules observées étaient clairsemées, ce qui est conforme aux études précédentes rapportant une réduction des uroplakines au cours de la cancérogenèse urothéliale 21,22,23. Cependant, pour étudier plus en détail la composition protéique des membranes MV, l’utilisation de la technique frileuse de marquage immunitaire de la réplique par congélation-fracture (FRIL) est recommandée. FRIL est une mise à niveau de la technique de gel-fracture présentée et est dédié à révéler l’identité des protéines dans les répliques par reconnaissance d’anticorps24,25. Pour résumer, la technique de congélation-fracture est une technique de microscopie électronique adaptée à la caractérisation de la membrane limitante EV, ainsi qu’à la forme, à la taille et à la pureté des fractions EV isolées. Le protocole présenté peut également être utilisé pour l’évaluation d’autres populations de véhicules électriques isolés; par conséquent, la technique de fracturation par congélation mérite d’être incluse dans les lignes directrices de l’International Society for Extracellular Vesicles pour les études explorant l’organisation des membranes limitant les VE.

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des vésicules limitées par la membrane libérées par les cellules dans l’espace extracellulaire. Les trois principales populations de VE sont les exosomes, les microvésicules (MV) et les corps apoptotiques, qui diffèrent par leur origine, leur taille et leur composition moléculaire 1,2,3. La composition des VE reflète le profil moléculaire de la cellule donneuse et son état physiologique (c.-à-d. sain ou malade)4,5. Cela donne aux VE un immense potentiel dans le diagnostic, le pronostic et le traitement des maladies humaines, et ils ont des applications médicales prometteuses pour l’utilisation en médecine personnalisée 6,7,8.
Les VE sont des médiateurs de la communication intercellulaire. Ils contiennent des protéines biologiquement actives, des lipides et des ARN, qui interfèrent avec les processus biologiques dans la cellule réceptrice et peuvent modifier son comportement 9,10. Cependant, la composition de la membrane limitante EV est cruciale pour l’interaction avec la membrane cellulaire réceptrice.
Les sources des VE sont les fluides corporels et les milieux de culture conditionnés. Pour isoler une population de VE, une technique d’isolement appropriée doit être utilisée. Par exemple, la centrifugation à 10 000 × g donne une fraction enrichie en MV, tandis que les forces centrifuges de 100 000 ≥ 000 × g donnent une fraction enrichie en exosomes11,12. La fraction isolée des véhicules électriques doit être validée en termes de pureté, de taille et de forme. À cette fin, l’International Society for Extracellular Vesicles 2018 a recommandé trois classes de techniques d’imagerie à haute résolution : la microscopie électronique, la microscopie à force atomique et la microscopie à super-résolution basée sur la microscopie optique13. Aucune de ces techniques ne peut fournir d’informations sur l’intérieur de la membrane EV.
La microscopie électronique par congélation-fracture est une technique de rupture d’échantillons congelés pour révéler leurs structures internes, en particulier en donnant une vue de l’intérieur de la membrane. Les étapes de la préparation de l’échantillon sont (1) la congélation rapide, (2) la fracturation, (3) la fabrication de la réplique et (4) le nettoyage de la réplique14. À l’étape 1, l’échantillon est (éventuellement) fixé chimiquement, cryoprotégé avec du glycérol et congelé dans du fréon liquide. À l’étape 2, l’échantillon congelé est fracturé dans une unité de congélation-fracture, ce qui expose l’intérieur de la bicouche membranaire. À l’étape 3, les faces fracturées exposées sont ombragées avec du platine (Pt) et du carbone (C) pour produire des répliques. À l’étape 4, la matière organique est éliminée. La réplique est analysée au microscope électronique à transmission (TEM). Pour une interprétation précise des micrographies, il faut suivre les directives pour leur bonne orientation14,15. En bref, la direction des ombres dans la micrographie est une référence pour orienter la micrographie (c.-à-d. pour déterminer la direction de l’ombrage Pt) et, par conséquent, pour déterminer les formes convexes et concaves (figure 1). Deux vues intérieures appelées faces fracturées de la bicouche membranaire peuvent être vues à la suite de la division de la membrane par congélation-fracturation: la face protoplasmique (face P) et la face exoplasmique (face E). La face P représente la feuillet membranaire adjacente au protoplasme cellulaire, tandis que la face E représente la feuillet membranaire adjacente à l’espace extracellulaire. Les protéines membranaires intégrales et leurs associations sont considérées comme des particules intramembranaires saillantes14,15.
Ici, l’objectif est d’appliquer la technique de congélation-fracture pour caractériser les MV en termes de taille, de forme et de structure de leur membrane limitante. Nous présentons ici un protocole pour l’isolement et la fracturation par congélation des MV provenant de cellules urothéliales cancéreuses invasives de la vessie humaine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A-DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>12491015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balzers freeze-fracture device</td>
			<td>Balzers AG, Liechtenstein</td>
			<td>Balzers BAF 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator HeraCell&#160;</td>
			<td>Heraues, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper carriers</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>BB 113 142-2</td>
			<td>100+ mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids</td>
			<td>SPI, United States</td>
			<td>2010C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask T75</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>growing surface 75 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 (HAM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>21765029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glazed Porcelain Plate 6 Well</td>
			<td>Fischer Sientific, United States</td>
			<td>50-949-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Kemika, Croatia</td>
			<td>711901</td>
			<td>final concentration 30 % (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaradehyde&#160;</td>
			<td>Serva, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td>final concentration 2.5 % (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050-079</td>
			<td>final concentration 4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>final concentration 100 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contast inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>model Eclipse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>A 4-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipetts</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>50mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochloride solution in water</td>
			<td>Carlo Erba, Italy</td>
			<td>481181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>final concentration 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Philips, The Netherlands</td>
			<td>model CM100</td>
			<td>working at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>SPI, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

freeze-fracture electron microscopy for extracellular vesicle analysis

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures membranaires limitées libérées par les cellules dans l’espace extracellulaire et sont impliquées dans la communication intercellulaire. Les VE se composent de trois populations de vésicules, à savoir les microvésicules (MV), les exosomes et les corps apoptotiques. La membrane limitante des VE est impliquée de manière cruciale dans les interactions avec les cellules réceptrices, ce qui pourrait conduire au transfert de molécules biologiquement actives vers les cellules réceptrices et, par conséquent, affecter leur comportement. La technique de microscopie électronique par congélation-fracture est utilisée pour étudier l’organisation interne des membranes biologiques. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement MV des cellules urothéliales cancéreuses en culture et la congélation-fracture des MV dans les étapes de congélation rapide, de fracturation, de fabrication et de nettoyage des répliques, et leur analyse avec la microscopie électronique à transmission. Les résultats montrent que le protocole d’isolement donne une population homogène de VE, qui correspondent à la forme et à la taille des MV. Les particules intramembranaires se trouvent principalement dans la face protoplasmique de la membrane limitante. Par conséquent, la congélation-fracture est la technique de choix pour caractériser le diamètre, la forme et la distribution des protéines membranaires des MV. Le protocole présenté s’applique à d’autres populations de véhicules électriques.

Les MV ont été isolés à partir du milieu conditionné des cellules T24 urothéliales cancéreuses après des centrifugations différentielles. Selon le protocole, la fraction EV a été détectée pour la première fois après centrifugation à 10 000 × g lorsqu’elle a été vue comme une pastille blanche (Figure 2G).
Ensuite, les véhicules électriques ont été traités conformément au protocole ci-dessus et examinés dans le cadre de la GDT. L’ombrage Pt/C a produit (Figure 4L) des répliques relativement grandes qui se sont souvent brisées en fragments plus petits pendant l’étape de nettoyage. De grandes répliques et leurs plus petits fragments ont été prélevés sur la grille TEM et comparés au microscope. Les résultats n’ont montré aucune différence dans la qualité des surfaces de réplique, quelle que soit leur taille, et elles peuvent donc toutes être utilisées. Les examens à faible grossissement ont montré des régions de la réplique avec i) une surface homogène (arrière-plan), ii) des profils sphériques concaves et convexes (vésicules) et iii) des régions de surface endommagée (artefacts; Figure 5A). Les artefacts typiques ont été vus comme des ruptures, des plis et des ombres plus sombres irrégulières (c.-à-d. des répliques de dépôts de cristaux de glace sur le spécimen). Il est également important de noter qu’aucun débris cellulaire ou organites cellulaires n’a été vu, ce qui confirme la pureté de l’échantillon (figure 5B).
Les vésicules isolées étaient généralement rassemblées en grappes de trois ou plus ou étaient distribuées individuellement (figure 5B). Les vésicules étaient sphériques, ce qui indique une bonne préservation de l’ultrastructure pendant l’isolement, la fixation et la congélation (Figure 5C). Les vésicules « à boule plate » et allongées (figure 5C), que l’on voyait occasionnellement, étaient vraisemblablement des artefacts de préparation et n’étaient pas incluses dans les mesures ultérieures du diamètre des vésicules. Le diamètre des profils visibles était de 238,5 nm (±8,0 nm, n = 190), ce qui, compte tenu du facteur de correction proposé par Hallett et al.17, correspond au diamètre moyen des vésicules de 304 nm (±10 nm; Figure 5D). La taille est corrélée à une plage de diamètre de MV comprise entre 100 nm et 1000 nm et prouve l’efficacité du protocole d’isolement utilisé. Les images des vésicules ainsi que la détermination du diamètre ont confirmé sans équivoque que les VE de l’isolat étaient enrichis en MV.
L’analyse des répliques a révélé l’organisation des faces P et E des membranes limitantes MV. Les MV ont été observés sous forme de formes rondes concaves et convexes (Figure 5C, E, F), reflétant le plan de fracture. Les formes convexes représentent des faces E (c.-à-d. feuillet exoplasmique fracturé des membranes; Figure 5E). Les faces exoplasmiques des VE avaient un aspect lisse et uniforme. Les formes concaves correspondent aux faces P (Figure 5F). Dans les faces P, quelques particules intramembranaires saillantes ont été observées dans les membranes lisses (Figure 5C,F). Cela implique que les MV isolés à partir de cellules T24 urothéliales cancéreuses ne contiennent qu’une faible quantité de protéines membranaires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig01.jpg"> Figure 1: Présentation schématique de la détermination de la membrane après la fracturation par congélation. (A) Les microvésicules bourgeonnent de la membrane plasmique dans l’espace extracellulaire. (B) La microvésicule est limitée par une feuillet membranaire P et E jusqu’au fractionnement par congélation, ce qui divise les folioles et expose les vues intérieures des folioles, appelées faces fracturées. (C) Après ombre Pt/C, deux faces fracturées sont discernables : la face protoplasmique (face P) de forme convexe face au cytoplasme (protoplasme) et la face exoplasmique (face E) de forme concave face à l’espace extracellulaire. La figure 1 a été créée à l’aide de Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig02.jpg"> Figure 2 : Isolement des VE. (A) Les cellules T24 cultivées dans un incubateur à CO2 sont examinées au microscope optique (B) pour confirmer leur viabilité et leur confluence avant l’isolement des MV. (C) Le milieu de culture cellulaire est collecté et (D) centrifugé consécutivement à 300 × g et à 2 000 × g (E) chaque fois que le surnageant est recueilli. (F,G) Après la centrifugation à 10 000 × g, une tache blanche indiquant une pastille est visible et marquée. Le surnageant est retiré et le fixateur (H) est soigneusement ajouté à la pastille sans le remettre en suspension. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig03.jpg"> Figure 3: Congélation des véhicules électriques. (A) Les supports en cuivre propre séchés à l’air avec une fosse centrale sont marqués (B) avant le traitement. Les microvésicules sont remises en suspension dans du glycérol pour obtenir un échantillon homogène et (C) ajoutées à une fosse centrale d’un porteur de tonnelier sous un stéréomicroscope. (D) Il faut ajouter un volume de l’échantillon tel qu’il forme une goutte convexe dans la fosse centrale. (E) Immédiatement avant la congélation, mélanger le fréon refroidi au LN2 avec une tige métallique pour liquéfier le fréon. (F) Congeler l’échantillon en le submergeant dans du fréon, puis (G) le transférer dans LN2. (H) Les supports avec l’échantillon congelé peuvent être prélevés dans des cryoviales et stockés dans un récipient LN2 Dewar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig04.jpg"> Figure 4 : Fracturation par congélation et fabrication d’une réplique. (A) Unité de fracturation par congélation. À l’intérieur de la chambre de l’unité (B) se trouve un pistolet à électrons en platine (Pt) et en carbone (C), un couteau et la table d’échantillonnage. (C) Pour commencer la fracturation, les porteurs avec l’échantillon sont transférés à la table d’échantillonnage, (D) l’unité de congélation-fracturation est refroidie et un vide est établi. (E) Le sectionnement se fait par mouvement motorisé (F) du couteau, mais la fracturation se fait de préférence manuellement. (G) Échantillon avant sectionnement et (H) après fracturation. (I) Immédiatement après la fracturation, la réplique est faite. (J) Au cours de ce processus, Pt est ombré sur l’échantillon. L’ombre en platine est considérée comme une lumière vive (étincelles) dans la chambre. (K) Les porte-échantillons sont recueillis dans un puits en porcelaine rempli d’eau. (L) Réplique (flèche) flottant dans la solution d’hypochlorite de sodium pendant l’étape de nettoyage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig05.jpg"> Figure 5 : Micrographies électroniques des MV gèle-fractures et Pt/C ombrés. (A) Un aperçu de la pastille EV décongelée et ombragée (i) à faible grossissement. La surface homogène est l’arrière-plan (ii), les zones claires sont des ruptures dans les répliques (iii), les zones plus sombres sont des plis de répliques (astérisque) et les ombres plus sombres irrégulières sont dues à des cristaux de glace (deux astérisques). (B) Groupe de véhicules électriques de forme ronde avec des surfaces concaves et convexes. (C) Grossissement élevé des véhicules électriques. Dans les fractures convexes, qui présentent une face P des membranes EV, des particules intramembranaires (flèches) et des taches d’une surface lisse (pointes de flèches) sont observées. On trouve des vésicules extracellulaires en forme allongée (étoile) et en boule plate (deux étoiles). (D) Le diamètre moyen des MV urothéliales isolées est de 304 nm ± 10 nm selon les mesures de taille proposées par Hallett et al.17. Les données sont présentées comme moyennes ± SEM. (E,F) Face E et face P des MV. Légende: flèches = particules intramembranaires dans la face P, flèches encerclées = direction de l’ombrage Pt/C. Barres d’échelle : A = 10 μm, B-F = 400 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis

Nous présentons un protocole pour l’isolement et la congélation-fracturation des vésicules extracellulaires (VE) provenant de cellules urothéliales cancéreuses. La technique de congélation-rupture a révélé le diamètre et la forme des véhicules électriques et, en tant que caractéristique unique, l’organisation interne des membranes des véhicules électriques. Ceux-ci sont d’une importance capitale pour comprendre comment les véhicules électriques interagissent avec les membranes réceptrices.

Microscopie électronique par congélation-fracture pour l’analyse des vésicules extracellulaires

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-limited structures released from the cells into the extracellular space and are implicated in intercellular ...

En vidéo, nous présentons un protocole de congélation-fracturation des vésicules extracellulaires provenant de cellules cancéreuses de la vessie in vitro. Les vésicules extracellulaires sont des vésicules limitées par la membrane qui dérivées de cellules sont libérées dans l’espace extracellulaire et jouent un rôle dans la communication intercellulaire. Au sein des vésicules extracellulaires, nous discriminons trois populations, les exosomes, les microvésicules et les corps apoptotiques, qui diffèrent par leur origine, leur taille et leur composition moléculaire.La composition moléculaire des vésicules extracellulaires reflète le profil moléculaire de la cellule donneuse et interfère avec les processus biologiques dans la cellule receveuse. Cependant, la composition de la membrane limitante des vésicules cellulaires est cruciale pour l’interaction avec la membrane cellulaire réceptrice. Pour analyser l’organisation de la membrane limitante, les vésicules extracellulaires doivent d’abord être isolées, puis approchées pour la technique de gel-fracture.La freeze-fracture est une technique de microscopie électronique dédiée à l’étude de l’organisation bidimensionnelle des membranes biologiques, y compris les vésicules. Les étapes de la fracturation par congélation sont la congélation rapide de l’échantillon, la fracturation de l’échantillon, la fabrication de la réplique de la surface gelée-fracturée et le nettoyage de la réplique pour éliminer les matières biologiques. Les répliques sont finalement visualisées au microscope électronique à transmission.Notre objectif était d’utiliser la technique de la fracture par gel pour caractériser les microvésicules en termes de forme, de taille et de composition de la membrane. Commencez par la croissance des cellules dans l’incubateur cellulaire. Inspectez les cellules au microscope pour confirmer leur variabilité et leur confluence.Recueillir les milieux de culture avec des microvésicules dans des tubes et centrifuger à des forces de 300 g pendant 10 minutes. Collecter le surnageant. Par la suite, centrifugez le surnageant à 2000 g de forces et 10 000 g de forces.Après cela, observez l’extrémité du tube pour une pastille blanchâtre indiquant des microvésicules. Retirez soigneusement le surnageant. Ajouter 1,5 millilitre de PBS et suspendre à nouveau les microvésicules contenant des pastilles.Puis centrifuger à 10 000 g-forces. Observez la présence de la pastille blanchâtre. Retirez le surnageant et ajoutez doucement un fixateur.Laisser reposer 20 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, retirez le fixateur et ajoutez un tampon de lavage pour rincer la pastille sans la suspendre à nouveau. Laisser reposer 10 minutes à 4 degrés Celsius.Retirez le tampon de lavage et ajoutez 30% de glycérol aux granulés. Remettez les granulés en suspension homogène et incubez pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Préparez des supports de cuivre propres avec une fosse centrale et développez une fiole avec froncement de sourcils et azote liquide.Au microscope, transférer l’échantillon dans la fosse centrale du support en cuivre. Mélanger le fréon solidifié pour qu’il se liquéfie. Prenez l’anneau extérieur du support avec une pince à épiler et immergez-le dans du fréon refroidi.Après huit secondes, transférez rapidement le support dans une fiole de développement avec de l’azote liquide. Marquez cryo vile et refroidissez-le. Sous l’azote liquide, collectez les supports dans le vile, fermez-le et stockez-le dans le récipient d’azote liquide jusqu’à la fracturation par congélation.Préparer l’unité de fraction de congélation conformément aux instructions d’utilisation du fabricant. Démarrez le système de vide et refroidissez la chambre de l’unité à moins 150 degrés Celsius. Transférer les supports de cuivre avec l’échantillon congelé dans l’unité de fractionnement de congélation.Réglez la température du couteau à moins 100 degrés Celsius et attendez l’aspirateur. Commencez à sectionner l’échantillon en allumant le mouvement motorisé du couteau jusqu’à ce que la surface de l’échantillon soit lisse. Pour la fracturation, éteignez le mouvement motorisé du couteau et procédez à un contrôle manuel lent du couteau.Procédez avec l’ombrage en platine à l’angle de 45 degrés. Allumez la haute tension et augmentez le courant vers le pistolet à platine. Des étincelles de platine devraient commencer à ombrer l’échantillon.Supervisez la position du platine sur le moniteur d’épaisseur du cristal de quartz. L’épaisseur recommandée du platine est de 2,5 nanomètres. Éteignez le courant et la tension élevée.Procédez à l’ombrage en carbone à un angle de 90 degrés. Allumez la haute tension et augmentez le courant jusqu’au pistolet en carbone. Des étincelles de carbone devraient commencer à ombrer l’échantillon.Lorsque 2,5 nanomètres de carbone sont obtenus, éteignez le courant et la tension élevée. Transférez ces échantillons avec les répliques de l’unité de congélation-rupture sur une plaque de 12 soupapes remplie d’eau double distillée. Les répliques flotteront à la surface de l’eau pendant que les transporteurs coulent.Transférez les répliques avec boucle métallique sur une plaque à 12 valves remplie d’hypoclorite de sodium et incubez pendant la nuit. Lavez les répliques dans de l’eau double distillée. Rassemblez-les sur une grille en cuivre TM et laissez-les sécher à l’air pendant deux heures.Utilisez un microscope électronique à transmission pour imager des répliques et obtenir des micrographies. Pour une interprétation précise des répliques et des micrographies, suivez les directives pour l’orientation appropriée de la nomenclature. Les analyses de répliques ont montré que le milieu conditionné isolé contenait une fraction enrichie de vésicules.Les vésicules isolées ont été soit rassemblées en grappes de trois ou plus, soit distribuées très individuellement. Les vésicules étaient de forme sphérique. Le diamètre des vésicules correspondait au diamètre des microvésicules.La fracturation par congélation a également révélé une organisation bidimensionnelle de la membrane des microvésicules. La phase exoplasmique des microvésicules avait un aspect lisse et uniforme tandis que dans la phase des protoplastes, nous avons observé des particules intermembranaires. Des particules intermembranaires sont apparues sporadiquement, ce qui implique que les microvésicules isolées à partir de cellules cancéreuses ne contiennent qu’une faible quantité de protéines membranaires ou d’assemblages de protéines.Pour résumer, la technique de congélation-fracture utilisée dans le protocole présenté s’avère être une technique optimale pour la caractérisation des vésicules extracellulaires et peut être utilisée pour l’évaluation d’autres populations de vésicules extracellulaires. Un avantage crucial de la technique de gel-fracture est son pouvoir de résoudre l’organisation interne de la membrane limitant les vésicules, qui détermine la fonction biologique des vésicules extracellulaires.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Un modèle de souris préclinique de l’ostéosarcome pour définir la Communication médiée par les vésicules extracellulaire entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Cytométrie en flux phospho avec cellule fluorescente code-barres pour seule cellule signalisation d’analyse et découverte de Biomarker

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modèle de matrice extracellulaire OS en trois dimensions pour l’ostéosarcome

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Étudier les effets normaux du rayonnement tissulaire à l'aide d'hydrogels de matrice extracellulaire

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide

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Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Microscopie à fluorescence pour l’internalisation de l’ATP médiée par la macropinocytose dans les cellules tumorales humaines et les souris xénogreffées

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...