Name: co-culture of murine small intestine epithelial organoids with innate lymphoid cells
Uploaded: 2022-03-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells at JoVE.com

Э.Р. получает степень доктора философии от Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. получает степень доктора философии от Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. признает докторскую степень студента от NIHR GSTT BRC. J.F.N. признает стипендию Марии Склодовской-Кюри, стипендию Королевской премии, стипендию Фонда Резерфорда RCUK /UKRI (MR/R024812/1) и премию Seed Award в области науки от Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Мы также благодарим основную команду проточной цитометрии BRC, базирующуюся в больнице Гая. Мыши-репортеры Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 были щедрым подарком от Г. Эберля (Институт Пастера, Париж, Франция). Мыши CD45.1 C57BL/6 были любезно предоставлены Т. Лоуренсом (Королевский колледж Лондона, Лондон) и. Барралом (Королевский колледж Лондона, Лондон).

Все эксперименты должны быть завершены в соответствии и с соблюдением всех соответствующих нормативных и институциональных руководящих принципов для использования животных. Этическое одобрение для исследования, описанного в следующей статье и видео, было получено в соответствии и с...

<ol>
	<li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mend+your+fences.">Mend your fences.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li><li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells:+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis.">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).</li><li>Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cell-epithelial+cell+modules+sustain+intestinal+homeostasis.">Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis.</a> Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).</li><li>Ebbo, M., Crinier, A., V&#233;ly, F., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells:+major+players+in+inflammatory+diseases.">Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells:+10+years+on.">Innate lymphoid cells: 10 years on.</a> Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).</li><li>Klose, C. S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+type+1+ILCs+from+a+common+progenitor+to+all+helper-like+innate+lymphoid+cell+lineages.">Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages.</a> Cell. 157 (2), 340-356 (2014).</li><li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-12+and+-23+control+plasticity+of+CD127++group+1+and+group+3+innate+lymphoid+cells+in+the+intestinal+lamina+propria.">Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria.</a> Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).</li><li>Jowett, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ILC1+drive+intestinal+epithelial+and+matrix+remodelling.">ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling.</a> Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).</li><li>Wong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+ROR&#945;+is+critical+for+nuocyte+development.">Transcription factor ROR&#945; is critical for nuocyte development.</a> Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).</li><li>Neill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuocytes+represent+a+new+innate+effector+leukocyte+that+mediates+type-2+immunity.">Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity.</a> Nature. 464, 1367-1370 (2010).</li><li>Mj&#246;sberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA3+is+essential+for+the+function+of+human+type+2+innate+lymphoid+cells.">The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).</li><li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells.">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-25-responsive,+lineage-negative+KLRG1hi+cells+are+multipotential+'inflammatory'+type+2+innate+lymphoid+cells.">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).</li><li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit.">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529, 221-225 (2016).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites.">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529, 226-230 (2016).</li><li>Eberl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+function+for+the+nuclear+receptor+RORgamma(t)+in+the+generation+of+fetal+lymphoid+tissue+inducer+cells.">An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells.</a> Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).</li><li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature.">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).</li><li>Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+lymph+nodes+collect+CD4+CD3-+LTbeta++cells+that+can+differentiate+to+APC,+NK+cells,+and+follicular+cells+but+not+T+or+B+cells.">Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells.</a> Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).</li><li>Lindemans, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-22+promotes+intestinal-stem-cell-mediated+epithelial+regeneration.">Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration.</a> Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).</li><li>Meininger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+features+of+innate+lymphoid+cells.">Tissue-specific features of innate lymphoid cells.</a> Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).</li><li>Dutton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+innate+lymphoid+cell+populations+at+different+sites+in+mice+with+defective+T+cell+immunity.">Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity.</a> Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).</li><li>Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+innate+lymphoid+cell+subsets.">Plasticity of innate lymphoid cell subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).</li><li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+type+1+innate+lymphoid+cells+accumulate+in+inflamed+mucosal+tissues.">Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues.</a> Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche.">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).</li><li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture.">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2012).</li><li>Date, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-gut+organoids:+reconstitution+of+the+stem+cell+niche.">Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).</li><li>Bartfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+infectious+diseases+and+host-microbe+interactions+in+gastrointestinal+organoids.">Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids.</a> Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Tallapragada, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflation-collapse+dynamics+drive+patterning+and+morphogenesis+in+intestinal+organoids.">Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+lymphocytes+from+the+mouse+small+intestinal+immune+system.">Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+maintenance+of+mouse+intestinal+stem+cells.">Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells.</a> Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).</li><li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development.">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).</li><li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration.">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li><li>Cardoso, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+type+2+innate+lymphoid+cells+via+neuromedin+U.">Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U.</a> Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).</li><li>Gury-BenAri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+and+regulatory+landscape+of+intestinal+innate+lymphoid+cells+are+shaped+by+the+microbiome.">The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome.</a> Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).</li><li>Seehus, C., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+murine+innate+lymphoid+cells+from+common+lymphoid+progenitor+cells.">In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells.</a> Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).</li></ol>

Этот протокол описывает методы установления органоидов тонкой кишки мышей, выделения редких ILC1 путем минимизации потери лимфоцитов во время протокола диссоциации кишечника и установления кокультур между этими двумя компартментами. В этом протоколе есть много шагов, и хотя некоторые ...

Связь между кишечным эпителием и кишечно-резидентной иммунной системой занимает центральное место в поддержании кишечного гомеостаза1. Нарушения этих взаимодействий связаны как с местными, так и с системными заболеваниями, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и рак желудочно-кишечного тракта2. Примечательным примером одного недавно описанного критического регулятора гомеостаза является исследование врожденных лимфоидных клеток (ILC), которые стали ключевыми игроками в кишечном иммунном ландшафте3. ILC представляют собой группу гетерогенных врожденных иммунных клеток, которые регулируют гомеостаз кишечника и организуют воспаление в основном через цитокин-опосредованную сигнализацию4.
Мышиные ILC широко делятся на подтипы на основе транскрипционного фактора, рецептора и профилей экспрессии цитокинов5. ILC типа-1, которые включают цитотоксические естественные киллерные (NK) клетки и хелпероподобные ILC типа 1 (ILC1s), определяются экспрессией транскрипционного фактора (эомезодермина) Эомса и белка Т-бокса, экспрессируемого в Т-клетках (T-bet)6, соответственно, и секретируют цитокины, связанные с иммунитетом Т-хелпера типа 1 (TH1): интерферон-γ (IFNγ) и фактор некроза опухоли (TNF), в ответ на интерлейкин (IL)-12, Ил-15 и Ил-187. Во время гомеостаза тканевые резиденты ILC1 секретируют трансформирующий фактор роста β (TGF-β), чтобы стимулировать пролиферацию эпителия и ремоделированиематрицы 8. ILC типа 2 (ILC2s) в первую очередь реагируют на гельминтную инфекцию через секрецию цитокинов, ассоциированных с T-хелпером типа 2 (TH2): IL-4, IL-5 и IL-13, и характеризуются экспрессией ретиноевой кислоты, связанной с орфанным рецептором (ROR) α (ROR-α)9 и GATA-связывающим белком 3 (GATA-3)10,11,12 . У мышей кишечные «воспалительные» ILC2 дополнительно характеризуются экспрессией лектин-подобного рецептора клеток-киллеров (подсемейство G-член 1, KLRG)13, где они реагируют на эпителиальный пучко-клеточный IL-2514,15. Наконец, ILC типа 3, которые включают клетки индуктора лимфоидной ткани и хелпероподобные ILC типа 3 (ILC3s), зависят от транскрипционного фактора ROR-γt16 и группируются в группы, которые секретируют либо гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), IL-17 или IL-22 в ответ на местные сигналы IL-1β и IL-2317. Клетки-индукторы лимфоидной ткани группируются в пятнах Пейера и имеют решающее значение для развития этих вторичных лимфоидных органов во время развития18, тогда как ILC3s являются наиболее распространенным подтипом ILC во взрослой мочевой тонкой кишке lamina propria. Одна из самых ранних мышиных кишечных органоидных кокультурных систем с ILC3s была использована для того, чтобы отделить влияние цитокина IL-22 на сигнальный преобразователь и активатор транскрипции 3 (STAT-3), опосредованный лейцин-богатым повторением, содержащим рецептор, связанный с G-белком, 5 (Lgr5) + пролиферацию кишечных стволовых клеток19, мощный пример регенеративного ILC-эпителиального взаимодействия. ILC проявляют импринт-гетерогенность между органами 20,21 и проявляют пластичность между подмножествами в ответ на поляризующие цитокины22. То, что движет этими тканеспецифическими отпечатками и различиями в пластичности, и какую роль они играют в хронических заболеваниях, таких как ВЗК23, остаются захватывающими темами, которые могут быть решены с использованием органоидных кокультур.
Кишечные органоиды стали успешной и надежной моделью для изучения кишечного эпителия24,25. Они генерируются культивированием эпителиальных стволовых клеток Lgr5+ или целых изолированных крипт, которые включают клетки Paneth в качестве эндогенного источника члена семейства Wnt 3A (Wnt3a). Эти 3D-структуры поддерживаются либо в синтетических гидрогелях26, либо в биоматериалах, которые имитируют базальную lamina propria, например, термосшивающий базальный внеклеточный матрикс (TBEM), и дополнительно дополняются факторами роста, которые имитируют окружающую нишу, в первую очередь эпителиальным фактором роста (EGF), ингибитором костного морфогенетического белка (BMP) Ноггином и Lgr5-лигандом и Wnt-агонистом R-Spondin127. . В этих условиях органоиды сохраняют эпителиальную апико-базальную полярность и рекапитулируют крипто-ворсинчатую структуру кишечного эпителия с почковыми криптами стволовых клеток, которые терминально дифференцируются в абсорбирующие и секреторные клетки в центре органоида, которые затем сбрасываются во внутренний псевдолюменаноикисом 28. Хотя одни только кишечные органоиды были чрезвычайно выгодны в качестве редукционистских моделей развития и динамики эпителия в изоляции29,30, они обладают огромным будущим потенциалом для понимания того, как это поведение регулируется, влияет или даже нарушается иммунным компартментом.
В следующем протоколе описан метод кокультурирования между мышиными тонкокишечными органоидами и ILC1, полученными из lamina propria, который недавно был использован для определения того, как эта популяция неожиданно уменьшает кишечные сигнатуры воспаления и вместо этого способствует увеличению эпителиальной пролиферации через TGF-β в этой системе8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 (BV510)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse NK1.1 (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-5941-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD127 Monoclonal Antibody (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-1271-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0193-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0051-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COLLAGENASE D, 500MG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells</td>
			<td>Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNASE I, GRADE II</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21969-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilenediamine Tetraacetate Acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC block</td>
			<td>2B Scientific</td>
			<td>BE0307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12549069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T- mNoggin-Fc Cells</td>
			<td>Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5893-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (500mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25-3351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1 X) 7.2 pH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12549079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier free)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>589106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-7 (carrier free)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>407-ML-005/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Bio-techne</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pippette</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E4860-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>11507411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL pippette</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E4860-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p10 pippette tips</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>S1121-3810-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pippette tips</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>I1026-7810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pippette tips</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1011-0921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tissue culture treated 24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and temperature controled incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Assisted Cellular Sorter</td>
			<td>BD equipment</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated shaker</td>
			<td>Stuart Equipment</td>
			<td>SI500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice box</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p10 pippette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3124000016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pippette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3124000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pippette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3124000032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4430000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of murine small intestine epithelial organoids with innate lymphoid cells

Сложные кокультуры органоидов с иммунными клетками обеспечивают универсальный инструмент для опроса о двунаправленных взаимодействиях, которые лежат в основе тонкого баланса гомеостаза слизистой оболочки. Эти 3D, многоклеточные системы предлагают редукционистскую модель для решения многофакторных заболеваний и разрешения технических трудностей, возникающих при изучении редких типов клеток, таких как ткане-резидентные врожденные лимфоидные клетки (ILC). В этой статье описывается мышиная система, которая сочетает в себе органоиды тонкой кишки и lamina propria тонкой кишки, полученные из хелпероподобных ILC типа 1 (ILC1), которые могут быть легко распространены на другие ILC или иммунные популяции. ILC - это популяция, проживающая в тканях, которая особенно обогащена слизистой оболочкой, где они способствуют гомеостазу и быстро реагируют на повреждение или инфекцию. Органоидные кокультуры с ILC уже начали проливать свет на новые эпителиально-иммунные сигнальные модули в кишечнике, показывая, как различные подмножества ILC влияют на целостность и регенерацию кишечного эпителиального барьера. Этот протокол позволит продолжить исследования взаимных взаимодействий между эпителиальными и иммунными клетками, которые могут обеспечить новое понимание механизмов гомеостаза слизистой оболочки и воспаления.

При успешном завершении свежеизолированные крипты должны образовать почковые криптовые структуры в течение 2-4 дней (рисунок 1А). Здоровые и крепкие органоидные культуры должны активно расти и могут проходить и расширяться, как подробно описано в протоколе.
<p class="jove_cont...

Watch this Scientific Journal Video about Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells at JoVE.com

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Этот протокол предлагает подробные инструкции по созданию органоидов тонкой кишки мышей, выделению врожденных лимфоидных клеток типа 1 из мышиной тонкой кишки lamina propria и созданию 3-мерных (3D) кокультур между обоими типами клеток для изучения двунаправленных взаимодействий между эпителиальными клетками кишечника и врожденными лимфоидными клетками типа 1.

Кокультура эпителиальных органоидов тонкой кишки мышей с врожденными лимфоидными клетками

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Этот протокол предоставляет важный инструмент для изучения взаимодействия между иммунными клетками кишечника и эпителием и для анализа того, как эти взаимодействия могут регулироваться при кишечном гомеостазе и воспалении. Основным преимуществом этой методики является изысканный объем экспериментального контроля, облегчаемый моделью редукции in vitro, которая может быть использована для решения вопросов эпителиальной и иммунной биологии. Эта система уже использовалась для определения роли ILC1 в расширении CD44-положительных эпителиальных крипт и имеет потенциал для дальнейшего продвижения нашего понимания опосредованных воспалением желудочно-кишечных заболеваний.Для начала поместите тепловой сшивающий базальный внеклеточный матрикс на лед, чтобы оттаять и предварительно нагреть стандартную тканевую обработанную культурой 24-луночную пластину, поместив ее в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. После этого извлеките пластину, содержащую органоиды, из инкубатора и выбросьте среду из колодца для прохождения. Затем добавьте в скважины 500 микролитров холодного холодного DMEM F12 и, используя наконечник P-1000, извлеките органоиды из всех скважин в 15-миллилитровую трубку.Промойте дно скважин 250-300 микролитрами холодного холодного DMEM F12, гарантируя, что в скважине не останется органоидов, и поместите в 15-миллилитровую трубку, содержащую извлеченные органоиды. Повторное суспендирование одно-двухдневной извлеченной органоидной гранулы в одном миллилитре ледяного холодного усовершенствованного DMEM F12. Предварительно покрыв одну 1,5-миллилитровую трубку PBS2 на врожденные лимфоидные клетки реплицируют образец, а затем, используя предварительно покрытый наконечник PBS2, распределяют примерно от 100 до 200 органоидов в трубку.Используя наконечник P-1000 с покрытием PBS2, добавьте объем не менее 500 ILC1s, рассчитанный на этапе сортировки, в 1,5-миллилитровую трубку с покрытием PBS2, содержащую органоиды. Вращайте ILC1 и органоиды при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и избегайте настольных центрифуг малого диаметра, так как они будут тянуть ячейки вдоль края внутренней части трубки, а не создавать гранулу на кончике трубки. Затем медленно и осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулу, и поместите образец на лед.Удерживая трубку на холодной поверхности, повторно суспендируют органоиды и ILC в 30 микролитрах термосшивающего базального внеклеточного матрикса не менее 10-15 раз, чтобы обеспечить равномерное распределение. Нанесите 30 микролитров на лунку органоидов ILC в термосшивающем базальном внеклеточном матриксе на предварительно нагретую 24- или 48-луночную пластину, чтобы сформировать единый купол. После этого поместите пластину непосредственно в инкубатор на 10-20 минут при температуре 37 градусов цельсия и 5% углекислого газа.Затем добавьте 550 микролитров полной среды ILC1 на лунку с любыми желаемыми экспериментальными цитокинами или блокирующими антителами и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Через 24 часа аккуратно извлеките пластину из инкубатора и дайте пластине посидеть в тканевом культуральном капюшоне в течение одной минуты, чтобы убедиться, что лимфоциты оседают. Удалите от 200 до 250 микролитров среды и поместите ее в пустой колодец из 24-луночной пластины.Используя инвертированный микроскоп, проверьте супернатант, чтобы убедиться, что лимфоциты не были удалены. Если супернатант прозрачный, добавьте 300 микролитров свежей среды ILC1 к совместной культуре в исходной лунке. Если в супернатанте присутствуют лимфоциты, центрифугируют при 300-400 г в течение трех-пяти минут при четырех градусах Цельсия и повторно суспендируют гранулу в 300 микролитрах свежей среды ILC1.Затем добавляют клеточную суспензию к оставшимся 200-250 микролитрам среды в исходной лунке. Выполнение последующего анализа с использованием иммунофлуоресценции, проточной цитометрии или очистки FACS целевых популяций в буфер лизиса для анализа экспрессии генов с помощью одноклеточного или объемного РНК-поиска или RT-qPCR, как описано в тексте. После успешного завершения прохождения здоровые и крепкие органоидные культуры показали, что свежеизолированные крипты должны образовывать почковые структуры крипт в течение двух-четырех дней.Проточный цитометрический анализ был выполнен для выделения ILC1 тонкой кишки из трансгенной репортерной линии ROR gamma-T мышей, и было обнаружено, что ожидаемый диапазон количества ILC составляет от 350 до 3 500 изолированных клеток. После посева органоидами кокультуры могут быть визуализированы с помощью иммунохимической цитохимии. Конфокальная микроскопия выявила изображения тонкокишечных органоидов, которые культивируются отдельно и в присутствии ILC1s.Иммуноцитохимическое окрашивание выявляет наличие CD45-положительного ILC1 в непосредственной близости от белково-1-положительных эпителиальных клеток Zonula occludens в органоидных кокультурах ILC1. Проточная цитометрия показала, что молекула клеточной адгезии эпителия маркирует эпителиальные клетки кишечника в органоидах, в то время как CD45 маркирует ILC1s. Проточный цитометрический график и иммунохимия выявили повышенную экспрессию CD44 в эпителиальных клетках кишечника при совместной культивации с ILC1.Исследования RT-qPCR показывают, что кокультура ILC1 специфически повышала регуляцию CD44 варианта 6, который ингибировался TGF-бета-1, 2, 3 нейтрализующим антителом и регулировался рекомбинантным TGF-бета-1 в культурах только тонких кишечных органоидов. Важно быть щадящим во время манипуляций с органоидами, чтобы обеспечить поддержание целых структур и проверить, что структуры достаточно гранулировались после центрифугирования. Увеличивая сложность системы путем добавления других иммунных и неиммунных компонентов, эта система in vitro может быть использована для решения дальнейших вопросов в биологии кишечника.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Сотрудничество культуры Модели Синегнойной палочки Биопленки выращенных на живые человеческие клетки дыхательных путей

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Экстракорпоральное поколение мышиный плазмоцитов дендритных клеток из общего предшественники лимфоидных клеток с использованием Feeder System АС-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Органоиды как модель для инфекционных болезней: Культура человека и мыши желудка органоидов и Микроинъекция Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Интравитальная визуализация интраэпителиальных лимфоцитов в Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Изоляция миндалевидных моноядерных клеток для изучения Ex Vivo Врожденные иммунные реакции в человеческой мукозальной лимфоидной ткани

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

П. аэругиноза Зараженная 3D сокультура бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов при воздушно-жидком интерфейсе для доклинической оценки антиинфекционных элементов

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Визуализация клеточной адаптации легких во время комбинированного озона и ЛПС-индуцированного острого повреждения легких

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...