Name: rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit candida albicans
Uploaded: 2022-03-24T14:00:00
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Diese Arbeit wurde vom Center of Applied Nanomedicine, der National Cheng Kung University vom Featured Areas Research Center Program im Rahmen des Higher Education Sprout Project vom Bildungsministerium (MOE) und vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] an TW Wong finanziert. J.H. Hung erkennt die Finanzierung durch das National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018], und [MOST 110-2314-B-006-086-MY3] an.

1. Vorbereitung des aPDT-Systems
<ol><li>Schneiden Sie vier grüne Leuchtdioden (LEDs) aus einem LED-Streifen (siehe Materialtabelle) und richten Sie sie mit vier Vertiefungen einer 96-Well-Platte aus (Abbildung 1). HINWEIS: Die LEDs wurden zu einem 4 x 3 Array angeordnet. Die Rückseite der LED wurde an einen Kühlkörper geklebt, um die Wärme während der Bestrahlung zu verteilen.</li>
	<li>Messen Sie die Fluenzrate11 der LED ...

<ol>
	<li>Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+secreted+aspartyl+proteinases+in+virulence+and+pathogenesis.">Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).</li><li>Pappas, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice+guideline+for+the+management+of+candidiasis:+2016+update+by+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).</li><li>Ricotta, E. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indocyanine+green-mediated+photodynamic+therapy+reduces+methicillin-resistant+staphylococcus+aureus+drug+resistance.">Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).</li><li>Kim, M. M., Darafsheh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sources+and+dosimetry+techniques+for+photodynamic+therapy.">Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).</li><li>Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+Bowen's+disease+(squamous+cell+carcinoma+in+situ)+of+the+digit.">Photodynamic therapy for Bowen's disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit.</a> Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).</li><li>Wong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+inactivation+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+by+indocyanine+green+and+near+infrared+light.">Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light.</a> Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).</li><li>Stasko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+blue+light+inhibits+infection+and+replication+of+SARS-CoV-2+at+doses+that+are+well-tolerated+by+human+respiratory+tissue.">Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).</li><li>Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+light+field+of+the+Waldmann+PDT+1200+lamp:+potential+for+wide-field+low+light+irradiance+aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy.">Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).</li><li>Feenstra, R. P., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescein+and+rose+bengal+staining.">Comparison of fluorescein and rose bengal staining.</a> Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).</li><li>Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-photosensitizer+binding+and+cell+density+on+microbial+photoinactivation.">Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).</li><li>Shahid, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duclauxin+derivatives+from+fungi+and+their+biological+activities.">Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).</li><li>Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+CLSI+M44-A2+disk+diffusion+and+associated+breakpoint+testing+of+caspofungin+and+micafungin+using+a+well-characterized+panel+of+wild-type+and+fks+hot+spot+mutant+Candida+isolates.">Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).</li><li>Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+yeast,+pseudohyphal,+and+hyphal+morphogenesis+differentially+affects+immune+recognition.">Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition.</a> Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).</li><li>Hung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+photodynamic+therapy+against+fungal+keratitis.">Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis.</a> Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).</li><li>Martinez, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rose+Bengal+photodynamic+antimicrobial+therapy:+a+pilot+safety+study.">Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study.</a> Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).</li></ol>

Ermutigende Ergebnisse der klinischen Anwendungen von RB-PDT bei Pilzkeratitis wurden kürzlichberichtet 19. Der Absorptionspeak von RB liegt bei 450-650 nm. Es ist wichtig, die Fluenzrate der Lichtquelle für eine erfolgreiche aPDT zu bestimmen. Eine hohe Fluenz (normalerweise >100 J / cm2) ist erforderlich, um Krebszellen zu behandeln, während eine niedrigere Fluenz zur Behandlung infizierter Läsionen6 erwartet wird. Eine hohe Fluenz bedeutet eine lange Expos...

C. albicans besiedelt im Magen-Darm- und Urogenitaltrakt gesunder Personen und kann bei etwa 50 Prozent der Individuen als normale Mikrobiota nachgewiesen werden1. Wenn ein Ungleichgewicht zwischen dem Wirt und dem Erreger entsteht, ist C. albicans in der Lage, einzudringen und Krankheiten zu verursachen. Die Infektion kann von lokalen Schleimhautinfektionen bis hin zu multiplem Organversagenreichen 2. In einer multizentrischen Surveillance-Studie in den USA ist etwa die Hälfte der Isolate von Patienten mit invasiver Candidiasis zwischen 2009 und 2017 C. albicans3. Candidämie kann mit hohen Morbiditätsraten, Mortalität, längerem Krankenhausaufenthaltverbunden sein 4. Die US-amerikanischen Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention berichteten, dass etwa 7% aller getesteten Candida-Blutproben gegen das AntimykotikumFluconazol 5 resistent sind. Das Auftreten arzneimittelresistenter Candida-Spezies wirft die Sorge auf, eine alternative oder adjuvante Therapie zu Antimykotika zu entwickeln.
Bei der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT) wird ein spezifischer Photosensibilisator (PS) mit Licht auf der maximalen Absorptionswellenlänge des PS6 aktiviert. Nach der Anregung überträgt das angeregte PS seine Energie oder Elektronen auf die nahe gelegenen Sauerstoffmoleküle und kehrt in den Grundzustand zurück. Während dieses Prozesses bilden sich reaktive Sauerstoffspezies und Singulett-Sauerstoff, die Zellschäden verursachen. aPDT wird seit den 1990er Jahren häufig zur Abtötung von Mikroorganismeneingesetzt 7. Einer der Vorteile von aPDT besteht darin, dass mehrere Organellen in einer Zelle durch Singulett-Sauerstoff und / oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) während der Bestrahlung beschädigt werden; Daher wurde bis heute kein Widerstand gegen aPDT gefunden. Darüber hinaus berichtete eine kürzlich durchgeführte Studie, dass die Bakterien, die nach der aPDT überlebten, empfindlicher auf Antibiotikareagierten 8.
Zu den in aPDT verwendeten Lichtquellen gehören Laser, Metallhalogenlampen mit Filtern, Nahinfrarotlicht und Leuchtdioden (LED) 9,10,11,12. Der Laser liefert eine hohe Lichtleistung, in der Regel größer als 0,5 W/cm2, die die Abgabe einer hohen Lichtdosis in sehr kurzer Zeit ermöglicht. Es wurde häufig in Fällen verwendet, in denen eine längere Behandlungszeit unbequem ist, wie z.B. aPDT für orale Infektionen. Der Nachteil eines Lasers ist, dass seine Spotgröße der Beleuchtung klein ist und von einigen hundert Mikrometern bis 10 mm mit einem Diffusor reicht. Darüber hinaus sind Lasergeräte teuer und erfordern eine spezielle Schulung für die Bedienung. Auf der anderen Seite ist die Bestrahlungsfläche einer Metallhalogenlampe mit Filtern relativ groß13. Allerdings ist die Lampe zu kräftig und teuer. LED-Lichtquellen sind im dermatologischen Bereich zum Mainstream der aPDT geworden, da sie klein und kostengünstiger sind. Die Bestrahlungsfläche kann bei einer Anordnung der LED-Glühbirne relativ groß sein. Das ganze Gesicht kann gleichzeitig beleuchtetwerden 9. Dennoch sind die meisten, wenn nicht alle, heute verfügbaren LED-Lichtquellen für den klinischen Einsatz konzipiert. Es ist möglicherweise nicht für Experimente in einem Labor geeignet, da es platzraubend und teuer ist. Wir haben ein preiswertes LED-Array entwickelt, das sehr klein ist und aus einem LED-Streifen geschnitten und montiert werden kann. Die LEDs können in verschiedene Anordnungen für unterschiedliche Versuchsdesigns eingebaut werden. Verschiedene Bedingungen der aPDT können in einer 96-Well-Platte oder sogar einer 384-Well-Platte in einem Experiment abgeschlossen werden.
Rose Bengal (RB) ist ein farbiger Farbstoff, der häufig verwendet wird, um die Visualisierung von Hornhautschäden in menschlichen Augen zu verbessern14. RB-vermittelte aPDT hat abtötende Wirkungen auf Staphylococcus aureus, Escherichia coli und C. albicans mit einer in etwa vergleichbaren Effizienz wie bei ToluidinblauO 15 gezeigt. Diese Studie zeigt eine Methode zur Validierung der Wirkung von RB-aPDT auf multiresistente C. albicans.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tube</td>
			<td>Neptune, San Diego, USA</td>
			<td>#3745.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon, USA</td>
			<td>#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan</td>
			<td>#16196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>sunmei, Tainan, Taiwan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum heat sink</td>
			<td>Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan</td>
			<td>BK-T220-0051-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, UK</td>
			<td>5415R</td>
			<td>disperses heat from the LED array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad prism software</td>
			<td>GraphPad 8.0, San Diego, California, USA</td>
			<td></td>
			<td>graphing and statistics software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green light emitting diode (LED) strip</td>
			<td>Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan</td>
			<td>2835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Yihder, Taipei, Taiwan</td>
			<td>LM-570D (R)</td>
			<td>Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150&#176;; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light power meter</td>
			<td>Ophir, Jerusalem, Israel</td>
			<td>PD300-3W-V1-SENSOR,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex 0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Merck, NJ, USA</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrug-resistant Candida albicans</td>
			<td>Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan</td>
			<td>BCRC 21538/ATCC 10231</td>
			<td>http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OD600 spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom, London, UK</td>
			<td>Ultrospec 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>330000</td>
			<td>stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized glass tube</td>
			<td>Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan</td>
			<td>AK45048-16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose Medium</td>
			<td>HIMEDIA, India</td>
			<td>M1363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit candida albicans

Die invasive Candida albicans-Infektion ist eine signifikante opportunistische Pilzinfektion beim Menschen, da sie einer der häufigsten Kolonisatoren von Darm, Mund, Vagina und Haut ist. Trotz der Verfügbarkeit von antimykotischen Medikamenten bleibt die Sterblichkeitsrate der invasiven Candidiasis ~ 50%. Leider nimmt die Inzidenz von arzneimittelresistenten C. albicans weltweit zu. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) kann eine alternative oder adjuvante Behandlung bieten, um die Bildung von C. albicans-Biofilmen zu hemmen und Arzneimittelresistenzen zu überwinden. Rose bengal (RB) vermittelte aPDT hat eine effektive Zellabtötung von Bakterien und C. albicans gezeigt. In dieser Studie wird die Wirksamkeit von RB-aPDT auf multiresistente C. albicans beschrieben. Eine hausgemachte grüne Leuchtdioden-Lichtquelle (LED) ist so konzipiert, dass sie sich an der Mitte einer Vertiefung einer 96-Well-Platte ausrichtet. Die Hefen wurden in den Brunnen mit unterschiedlichen Konzentrationen von RB inkubiert und mit unterschiedlichen Grünlichtfluanzen beleuchtet. Die Tötungseffekte wurden mit der Plattenverdünnungsmethode analysiert. Mit einer optimalen Kombination von Licht und RB wurde eine 3-log-Wachstumshemmung erreicht. Es wurde der Schluss gezogen, dass RB-aPDT möglicherweise arzneimittelresistente C. albicans hemmen könnte.

Abbildung 1 zeigt das aPDT-System, das in der vorliegenden Studie verwendet wird. Da hohe Temperaturen zu einem signifikanten Zelltod führen können, wird das LED-Array durch einen elektrischen Lüfter gekühlt, und während der Bestrahlung wird ein Kühlkörper verwendet, um eine konstante Temperatur bei 25 ± 1 ° C aufrechtzuerhalten. Der Hitzeeffekt kann diskontiert werden. Eine gleichmäßige Lichtverteilung ist auch ein wichtiger bestimmender Faktor für eine erfolgreiche aPDT; Daher...

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Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Die zunehmende Inzidenz von arzneimittelresistenten Candida albicans ist weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) kann eine Strategie zur Bekämpfung arzneimittelresistenter Pilzinfektionen bieten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die bengalenvermittelte aPDT-Wirksamkeit von Rose auf einem multiresistenten C. albicans-Stamm in vitro.

Rosenbengalen-vermittelte photodynamische Therapie zur Hemmung von Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

Diese Studie ist ein einfaches, vielseitiges und einfaches System, um verschiedene photodynamische Effekte auf verschiedene Mikroorganismen und Zellen zu untersuchen. In diesem System kann die LED je nach Versuchsdesign unterschiedlich angeordnet werden. Verschiedene Bedingungen der PDT können in einer 96-Well-Platte oder sogar einer 384-Well-Platte in einem Experiment berechnet werden.Diese Technik kann zur Behandlung von Pilzkeratitis eingesetzt werden, wodurch weltweit rund 150.000 Menschen trotz intensiver Behandlungen ihre Augen verlieren. Schneiden Sie zunächst vier grüne LEDs aus einem LED-Streifen und richten Sie sie mit drei Vertiefungen einer 96-Well-Platte aus. Messen Sie die Fluenzrate der LED bei 540 Nanometern mit einem Lichtleistungsmesser.Halten Sie die Temperatur konstant bei 25 Grad Celsius mit einem elektrischen Lüfter, der während der Bestrahlung neben der Platte montiert wurde. Mit einer sterilen Schlaufe eine einzelne Kolonie Candida albicans aus einer Agarplatte entnehmen und in ein sterilisiertes Glasröhrchen mit drei Millilitern YPD-Medium geben. Inkubieren Sie das Rohr bei 25 Grad Celsius bei einer Drehzahl von 155 U / min für 14 bis 16 Stunden, um die Hefekultur zu züchten.Als nächstes verdünnen Sie die Übernachtkultur mit YPD medium auf einen OD 600-Wert von 0,5. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius mit einer Rotation bei 155 U / min für vier Stunden, um die Blockwachstumsphase zu erreichen. Wiederholen Sie die Verdünnung der logarithmischen Phasenkultur mit frischem YPD-Medium auf einen OD 600-Wert von 0,65, um etwa ein Mal 10 bis zur siebten koloniebildenden Einheit pro Milliliter zu erhalten.Bereiten Sie gleichzeitig eine 4%ige Lösung von Rosenbengalen in 1X PBS vor. Filter sterilisieren mit einem 0,22 Mikrometer Filter. Fügen Sie 111 Mikroliter 2% rose bengalische Lösung zu einem Milliliter Log-Phasenkultur hinzu und kokultivieren Sie sie zu verschiedenen Zeitpunkten bei Raumtemperatur, um die Absorption von RB in den Zellen zu verstehen.Zentrifugieren Sie bei 16, 100 x G für 2 1/2 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie die Co-Kultur dreimal mit einem Milliliter 1X PBS. Nach dem Waschen die Candida albicans-Kultur in einem Milliliter 1X PBS aussetzen. Verteilen Sie die Kultur für jede Bedingung in drei verschiedene Vertiefungen in einer 96-Well-Platte.Richten Sie die Vertiefungen am LED-Array aus. Schalten Sie in den lichtexponierten Gruppen den elektrischen Lüfter ein und leuchten Sie. Führen Sie nach der Bestrahlung zweimal zehnfache serielle Verdünnungen durch, indem Sie 20 Mikroliter der Co-Kulturlösung aus einer Vertiefung entnehmen und in ein Röhrchen mit 180 Mikrolitern 1X PBS geben.Lassen Sie dann 20 Mikroliter jeder seriellen Verdünnung in einem Quadranten einer YPD-Agarplatte fallen, um zählbare Kolonien auf der Platte zu erhalten. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine sofortige Färbung von Candida albicans mit Rosenbengalen unter roter Fluoreszenz. Nach 15 Minuten Inkubation wurden die meisten Zellen mit Rosenbengalen gefärbt, was darauf hindeutet, dass sie zeitabhängig in die Zellen gelangen.Darüber hinaus erzeugt die Aktivierung von Rosenbengalen mit Licht freie Radikale und Singulett-Sauerstoff in den Zellen, was zum Zelltod führt. In Abwesenheit von Rosenbengalen oder Bestrahlung wurde kein Zelltod beobachtet. Candida albicans wurde nach Bestrahlung mit grünem Licht in Gegenwart von 0,2% Rosenbengalen in einer lichtdosisabhängigen Weise gehemmt.Es ist wichtig, dass zuerst die 96-Well-Platte mit der Mitte der LED ausgerichtet werden muss. Zweitens muss die verwendete Agarplatte gründlich getrocknet werden, um die Vermischung getrennter Kolonien zu verhindern. Die Candida albicans, die auf dem Teller gewachsen sind, können weiter zur Genanalyse geschickt werden, die beantworten kann, wie PDT die Genexpression der Zellen beeinflusst.Diese Techniken ebnen den Weg, um zu untersuchen, wie PDT auf verschiedenen Zelltypen funktioniert, entweder Krebszellen, Bakterien, Pilze oder Viren mit einer einfachen, kostengünstigen und vielseitigen Plattform.

rose-bengal-mediated-photodynamic-therapy-to-inhibit-candida-albicans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily lead to infections in the dermis which can, in turn, result in the dissemination of pathogens into the bloodstream. Understanding how the immune system fights infections at the very early stage and how the host can eliminate the pathogens is an important step to set the base for future therapeutic interventions. Here we describe a model of Candida albicans infection that can visualize the processes that occur early during an infection, including when the pathogen has passed the epithelial barrier, as well as the immune response elicited by the C. albicans invasion. We used this infection model to perform histological analyses that show the immune cells that infiltrate the skin as well as the presence and localization of the pathogen. Samples collected after the infection can be processed for RNA extraction.

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Here we describe a protocol that allows histological and molecular analysis of skin samples after Candida albicans intradermal injection. This protocol maintains the structural integrity of the skin and allows for the localization of tissue-resident or newly recruited immune cells as well as the pathogen distribution.

Tief dermalen Injektion als ein Modell von Candida Albicans Infektion der Haut für histologische Analysen

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

Tägliche Phototherapie mit rotem Licht zu regulieren Candida Albicans Biofilm Wachstum

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

Klärende und Bildgebung Candida albicans Biofilme

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Ein Ex-vivo-Assay zur Untersuchung von Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Wirksame aPDT mit Curcuminoiden bei oraler Candidiasis bei Mäusen

Curcuminoid-Mediated Antimicrobial Photodynamic Therapy on a Murine Model of Oral Candidiasis

Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) has been extensively investigated in vitro, and preclinical animal models of infections are suitable for evaluating alternative treatments prior to clinical trials. This study describes the efficacy of aPDT in a murine model of oral candidiasis. Forty mice were immunosuppressed with subcutaneous injections of prednisolone, and their tongues were inoculated using an oral swab previously soaked in a C. albicans cell suspension. Tetracycline was administered via drinking water during the course of the experiment. Five days after fungal inoculation, mice were randomly distributed into eight groups; a ninth group of untreated uninfected mice was included as a negative control (n = 5). Three concentrations (20 &#181;M, 40 &#181;M, and 80 &#181;M) of a mixture of curcuminoids were tested with a blue LED light (89.2 mW/cm2; ~455 nm) and without light (C+L+ and C+L- groups, respectively). Light alone (C-L+), no treatment (C-L-), and animals without infection were evaluated as controls. Data were analyzed using Welch&#39;s ANOVA and Games-Howell tests (&#945; = 0.05). Oral candidiasis was established in all infected animals and visualized macroscopically through the presence of characteristic white patches or pseudomembranes on the dorsum of the tongues. Histopathological sections confirmed a large presence of yeast and filaments limited to the keratinized layer of the epithelium in the C-L- group, and the presence of fungal cells was visually decreased in the images obtained from mice subjected to aPDT with either 40 &#181;M or 80 &#181;M curcuminoids. aPDT mediated by 80 &#181;M curcuminoids promoted a 2.47 log10 reduction in colony counts in comparison to those in the C-L- group (p = 0.008). All other groups showed no statistically significant reduction in the number of colonies, including photosensitizer (C+L-) or light alone (C-L+) groups. Curcuminoid-mediated aPDT reduced the fungal load from the tongues of mice.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der photodynamischen Therapie mit Curcumin in einem Mausmodell für orale Candidiasis

This protocol describes the application of antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) in a murine model of oral candidiasis. aPDT was performed using a water-soluble mixture of curcuminoids and blue LED light.