Name: rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit candida albicans
Uploaded: 2022-03-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans at JoVE.com

עבודה זו קיבלה מימון מהמרכז לננו-רפואה יישומית, אוניברסיטת צ'נג קונג הלאומית מתוכנית מרכז המחקר לאזורים נבחרים במסגרת פרויקט הנבטים להשכלה גבוהה על ידי משרד החינוך (MOE), ומשרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן [MOST 109-2327-B-006-005] ל- TW וונג. J.H. Hung מכיר במימון מבית החולים האוניברסיטאי הלאומי צ'נג קונג, טייוואן [NCKUH-11006018], ו[MOST 110-2314-B-006-086-MY3].

1. הכנת מערכת aPDT
<ol><li>חותכים ארבע דיודות פולטות אור ירוק (נוריות LED) מרצועת LED (ראו טבלת חומרים) ומיישרים אותן עם ארבע בארות של לוחית בעלת 96 בארות (איור 1). הערה: נוריות ה-LED סודרו במערך של 4 x 3. החלק האחורי של הנורית הודבק לגוף קירור כדי לפזר חום במהלך ההקרנה.</li...

<ol>
	<li>Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+secreted+aspartyl+proteinases+in+virulence+and+pathogenesis.">Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).</li><li>Pappas, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice+guideline+for+the+management+of+candidiasis:+2016+update+by+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).</li><li>Ricotta, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+candidiasis+species+distribution+and+trends,+United+States,+2009-2017.">Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017.</a> Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).</li><li>Koehler, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morbidity+and+mortality+of+candidaemia+in+Europe:+an+epidemiologic+meta-analysis.">Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis.</a> Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).</li><li>Toda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+active+surveillance+for+culture-confirmed+candidemia+-+four+sites,+United+States,+2012-2016.">Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia - four sites, United States, 2012-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).</li><li>Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daylight+photodynamic+therapy:+an+update.">Daylight photodynamic therapy: an update.</a> Molecules. 25 (21), 5195 (2020).</li><li>Wainwright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+(PACT).">Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT).</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).</li><li>Wong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indocyanine+green-mediated+photodynamic+therapy+reduces+methicillin-resistant+staphylococcus+aureus+drug+resistance.">Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).</li><li>Kim, M. M., Darafsheh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sources+and+dosimetry+techniques+for+photodynamic+therapy.">Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).</li><li>Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+Bowen's+disease+(squamous+cell+carcinoma+in+situ)+of+the+digit.">Photodynamic therapy for Bowen's disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit.</a> Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).</li><li>Wong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+inactivation+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+by+indocyanine+green+and+near+infrared+light.">Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light.</a> Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).</li><li>Stasko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+blue+light+inhibits+infection+and+replication+of+SARS-CoV-2+at+doses+that+are+well-tolerated+by+human+respiratory+tissue.">Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).</li><li>Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+light+field+of+the+Waldmann+PDT+1200+lamp:+potential+for+wide-field+low+light+irradiance+aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy.">Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).</li><li>Feenstra, R. P., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescein+and+rose+bengal+staining.">Comparison of fluorescein and rose bengal staining.</a> Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).</li><li>Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-photosensitizer+binding+and+cell+density+on+microbial+photoinactivation.">Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).</li><li>Shahid, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duclauxin+derivatives+from+fungi+and+their+biological+activities.">Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).</li><li>Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+CLSI+M44-A2+disk+diffusion+and+associated+breakpoint+testing+of+caspofungin+and+micafungin+using+a+well-characterized+panel+of+wild-type+and+fks+hot+spot+mutant+Candida+isolates.">Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).</li><li>Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+yeast,+pseudohyphal,+and+hyphal+morphogenesis+differentially+affects+immune+recognition.">Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition.</a> Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).</li><li>Hung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+photodynamic+therapy+against+fungal+keratitis.">Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis.</a> Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).</li><li>Martinez, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rose+Bengal+photodynamic+antimicrobial+therapy:+a+pilot+safety+study.">Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study.</a> Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).</li></ol>

תוצאות מעודדות של יישומים קליניים של RB-PDT עבור קרטיטיס פטרייתית דווחו לאחרונה19. שיא הספיגה של RB הוא ב 450-650 ננומטר. חיוני לקבוע את קצב הפלואנס של מקור האור עבור aPDT מוצלח. פלואנס גבוה (בדרך כלל >100 J/cm2) נדרש לטיפול בתאים סרטניים, בעוד פלואנס נמוך יותר צפוי לטפל בנגעים נגועים<sup ...

C. albicans מתיישבת במערכת העיכול ובמערכת העיכול והגניטורין של אנשים בריאים וניתן לזהות אותה כמיקרוביוטה רגילה בכ-50 אחוז מהאנשים1. אם נוצר חוסר איזון בין הפונדקאי לפתוגן, C. albicans מסוגל לפלוש ולגרום למחלות. הזיהום יכול לנוע בין זיהומים ריריים מקומיים בממברנה ועד לכשל איברים מרובים2. במחקר מעקב רב-מרכזי בארה"ב, כמחצית מהמבודדים מחולים עם קנדידה פולשנית בין 2009 ל-2017 הם C. albicans3. קנדידמיה יכולה להיות קשורה לשיעורי תחלואה גבוהים, תמותה, שהייה ממושכת בבית החולים4. המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה"ב דיווחו כי כ-7% מכל דגימות הדם של קנדידה שנבדקו עמידות לתרופה האנטי-פטרייתית fluconazole5. הופעתם של מיני קנדידה עמידים לתרופות מעלה את החשש לפתח טיפול חלופי או אדג'ובנטי לחומרים אנטי-מיקוטיים.
טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) כולל הפעלת פוטוס-סנסיטיזר ספציפי (PS) עם אור באורך הגל של שיא הקליטה של ה-PS6. לאחר העירור, PS הנרגש מעביר את האנרגיה או האלקטרונים שלו למולקולות החמצן הסמוכות וחוזר למצב הקרקע. במהלך תהליך זה נוצרים מיני חמצן תגובתי וחמצן סינגלט וגורמים נזק לתאים. aPDT נמצא בשימוש נרחב כדי להרוג מיקרואורגניזמים מאז שנות ה-90של המאה ה-20. אחד היתרונות של aPDT הוא שמספר אברונים ניזוקים בתא על ידי חמצן יחיד ו/או מיני חמצן תגובתי (ROS) במהלך הקרנה; לפיכך, ההתנגדות ל-aPDT לא נמצאה עד היום. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי החיידקים ששרדו לאחר aPDT נעשו רגישים יותר לאנטיביוטיקה8.
מקורות האור המשמשים ב-aPDT כוללים לייזרים, מנורות הלוגן מתכתיות עם מסננים, אור אינפרה-אדום קרוב ודיודה פולטת אור (LED)9,10,11,12. הלייזר מספק עוצמת אור גבוהה, בדרך כלל גדולה מ-0.5 W/cm2, המאפשרת אספקה של מינון אור גבוה בזמן קצר מאוד. זה כבר בשימוש נרחב במקרים שבהם זמן טיפול ארוך יותר אינו נוח כגון aPDT עבור זיהומים דרך הפה. החיסרון של לייזר הוא שגודל התאורה הנקודתי שלו קטן, ונע בין כמה מאות מיקרומטרים ל -10 מ"מ עם מפזר. יתר על כן, ציוד לייזר הוא יקר וזקוק להכשרה ספציפית כדי לפעול. מצד שני, שטח ההקרנה של מנורת הלוגן מתכתית עם פילטרים גדול יחסית13. עם זאת, המנורה חסונה ויקרה מדי. מקורות אור LED הפכו למיינסטרים של aPDT בתחום הדרמטולוגי מכיוון שהוא קטן וזול יותר. שטח ההקרנה יכול להיות גדול יחסית עם סידור מערך של נורת ה-LED. ניתן להאיר את כל הפנים בו זמנית9. עם זאת, רוב, אם לא כל, מקורות תאורת ה-LED הזמינים כיום מיועדים לשימוש קליני. זה לא יכול להיות מתאים לניסויים במעבדה כי זה תופס מקום ויקר. פיתחנו מערך LED זול שהוא קטן מאוד וניתן לחתוך ולהרכיב אותו מרצועת LED. ניתן להתאים את נוריות ה- LED לסידורים שונים עבור עיצובים ניסיוניים שונים. ניתן להשלים תנאים שונים של aPDT בצלחת של 96 בארות או אפילו בצלחת של 384 בארות בניסוי אחד.
ורד בנגל (RB) הוא צבע צבעוני הנמצא בשימוש נרחב להגברת ההדמיה של נזקי הקרנית בעיני אדם14. aPDT בתיווך RB הראה השפעות הרג על סטפילוקוקוס אאורוס, Escherichia coli ו- C. albicans עם יעילות דומה פחות או יותר לזו של טולואידין כחול O15. מחקר זה מדגים שיטה לאימות ההשפעה של RB-aPDT על C. albicans עמידים למולטי-דרוג.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tube</td>
			<td>Neptune, San Diego, USA</td>
			<td>#3745.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon, USA</td>
			<td>#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan</td>
			<td>#16196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>sunmei, Tainan, Taiwan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum heat sink</td>
			<td>Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan</td>
			<td>BK-T220-0051-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, UK</td>
			<td>5415R</td>
			<td>disperses heat from the LED array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad prism software</td>
			<td>GraphPad 8.0, San Diego, California, USA</td>
			<td></td>
			<td>graphing and statistics software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green light emitting diode (LED) strip</td>
			<td>Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan</td>
			<td>2835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Yihder, Taipei, Taiwan</td>
			<td>LM-570D (R)</td>
			<td>Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150&#176;; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light power meter</td>
			<td>Ophir, Jerusalem, Israel</td>
			<td>PD300-3W-V1-SENSOR,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex 0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Merck, NJ, USA</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrug-resistant Candida albicans</td>
			<td>Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan</td>
			<td>BCRC 21538/ATCC 10231</td>
			<td>http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OD600 spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom, London, UK</td>
			<td>Ultrospec 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>330000</td>
			<td>stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized glass tube</td>
			<td>Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan</td>
			<td>AK45048-16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose Medium</td>
			<td>HIMEDIA, India</td>
			<td>M1363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit candida albicans

זיהום קנדידה אלביקנס פולשני הוא זיהום פטרייתי אופורטוניסטי משמעותי בבני אדם מכיוון שהוא אחד המתיישבים הנפוצים ביותר במעיים, בפה, בנרתיק ובעור. למרות הזמינות של תרופות נגד פטריות, שיעור התמותה של קנדידה פולשנית נותר כ -50%. למרבה הצער, השכיחות של C. albicans עמידים לתרופות עולה ברחבי העולם. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) עשוי להציע טיפול חלופי או אדג'ובנטי כדי לעכב את היווצרות הביופילם של C. albicans ולהתגבר על עמידות לתרופות. APDT בתיווך רוז בנגל (RB) הראה הרג יעיל של תאים של חיידקים ושל C. albicans. במחקר זה מתוארת היעילות של RB-aPDT על C. albicans עמידים למולטי-דרוג. מקור אור ביתי של דיודה ירוקה פולטת אור ירוק (LED) מתוכנן להתיישר עם מרכזה של באר של צלחת בעלת 96 בארות. השמרים דוגרו בבארות עם ריכוזים שונים של RB והוארו בפלואנסים משתנים של אור ירוק. השפעות ההרג נותחו בשיטת דילול הצלחת. עם שילוב אופטימלי של אור ו- RB, הושגה עיכוב צמיחה של 3 לוגים. הוסק כי RB-aPDT עשוי לעכב C. albicans עמידים לתרופות.

איור 1 מראה את מערכת ה-aPDT שבה נעשה שימוש במחקר הנוכחי. מכיוון שטמפרטורות גבוהות עלולות לגרום למוות תאי משמעותי, מערך ה-LED מקורר על ידי מאוורר חשמלי, וגוף קירור משמש במהלך הקרנה כדי לשמור על טמפרטורה קבועה של 25 ± 1 °C (74 °F). ניתן לזלזל באפקט החום. התפלגות אור אחידה היא גם גורם מכר...

Watch this Scientific Journal Video about Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans at JoVE.com

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

השכיחות הגוברת של קנדידה אלביקנס עמידים לתרופות היא בעיה בריאותית חמורה ברחבי העולם. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) עשוי להציע אסטרטגיה למאבק בזיהומים פטרייתיים עמידים לתרופות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את יעילות ה-aPDT בתיווך בנגל רוז על זן C. albicans עמיד בפני multidrug במבחנה.

טיפול פוטודינמי בתיווך רוז בנגל לעיכוב קנדידה אלביקנס

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

מחקר זה הוא מערכת פשוטה, רב-תכליתית וקלה לבחינת השפעות פוטודינמיות שונות על מיקרואורגניזמים ותאים שונים. במערכת זו, ניתן להתאים את הנורית לסידור שונה בהתאם לתכנון הניסוי. ניתן לחשב מצב שונה של PDT בלוחית של 96 בארות או אפילו בצלחת של 384 בארות בניסוי אחד.טכניקה זו יכולה לשמש לטיפול קרטיטיס פטרייתית שבגללה ברחבי העולם, סביב 150, 000 אנשים מאבדים את עיניהם למרות טיפולים אינטנסיביים. כדי להתחיל, חותכים ארבע נורות LED ירוקות מרצועת LED ומיישרים אותן עם שלוש בארות של צלחת של 96 בארות. מדוד את קצב הפלואנס של ה- LED ב- 540 ננומטר באמצעות מד הספק אור.שמרו על טמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס עם מאוורר חשמלי שהורכב לצד הצלחת במהלך ההקרנה. עם לולאה סטרילית, בחרו מושבה אחת של קנדידה אלביקנים מתוך צלחת אגר והוסיפו אותה לצינור זכוכית מעוקר המכיל שלושה מיליליטרים של מדיום YPD. דגירה של הצינור ב-25 מעלות צלזיוס במהירות סיבוב של 155 סל"ד למשך 14 עד 16 שעות כדי לגדל את תרבית השמרים.לאחר מכן לדלל את תרבות הלילה עם מדיום YPD לערך OD 600 של 0.5. דגירה ב-30 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-155 סל"ד למשך ארבע שעות כדי להשיג את שלב צמיחת היומן. חזור על הדילול של תרבות שלב היומן עם מדיום YPD טרי לערך OD 600 של 0.65, כדי להגיע בערך פי 10 ליחידות יצירת המושבה השביעית למיליליטר.בו זמנית להכין פתרון מלאי של 4% של בנגל עלה ב 1X PBS. מסנן לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסיפו 111 מיקרוליטרים של תמיסת ורדים בנגלית של 2% למיליליטר אחד של תרבית פאזה של לוג, ותרבית משותפת בנקודות זמן שונות בטמפרטורת החדר כדי להבין את ספיגת ה-RB בתאים.צנטריפוגה ב 16, 100 פעמים G במשך 2 1/2 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף את התרבות המשותפת שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 1X PBS. לאחר הכביסה, יש להחיות את תרבות קנדידה אלביקנס במיליליטר אחד של 1X PBS. עבור כל מצב, פזרו את התרבות לשלוש בארות שונות בצלחת של 96 בארות.יישרו את הבארות עם מערך ה-LED. בקבוצות החשופות באור, הפעילו את המאוורר החשמלי ואת האור. לאחר הקרנה, בצע דילולים סדרתיים פי עשרה פעמיים על ידי לקיחת 20 מיקרוליטרים של תמיסת התרבית המשותפת מבאר אחת, והוספתו לצינור המכיל 180 מיקרוליטרים של 1X PBS.לאחר מכן שחררו 20 מיקרוליטרים של כל דילול סדרתי ברביע אחד של לוחית אגר YPD כדי להשיג מושבות הניתנות לספירה על הצלחת. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הראתה צביעה מיידית של קנדידה אלביקנס עם בנגל ורדים תחת פלואורסצנציה אדומה. לאחר 15 דקות של דגירה, רוב התאים הוכתמו בשומן ורדים, מה שמעיד על כך שהוא נכנס לתאים באופן תלוי זמן.יתר על כן, הפעלה של ורד בנגל עם אור מייצרת רדיקלים חופשיים וחמצן סינגלט בתאים, וכתוצאה מכך מוות תאי. בהיעדר ורדים או הקרנה, לא נצפה מוות תאי. קנדידה אלביקנס עוכבה לאחר הקרנת אור ירוק בנוכחות עלייה של 0.2% בבנגל באופן תלוי מינון קל.חשוב כי תחילה יש ליישר את לוחית 96 הבאר עם מרכז הנורית. שנית, יש לייבש היטב את צלחת האגר המשמשת כדי למנוע ערבוב של מושבות נפרדות. ניתן לשלוח עוד יותר את אלביקנים קנדידה שגדלו על הצלחת לניתוח גנים, מה שיכול לענות על האופן שבו PDT משפיע על ביטוי הגנים של התאים.טכניקות אלה סוללות את הדרך לבחון כיצד PDT פועל על סוגי תאים שונים, בין אם תאים סרטניים, חיידקים, פטריות או וירוסים באמצעות פלטפורמה קלה, זולה ורב-תכליתית.

rose-bengal-mediated-photodynamic-therapy-to-inhibit-candida-albicans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily lead to infections in the dermis which can, in turn, result in the dissemination of pathogens into the bloodstream. Understanding how the immune system fights infections at the very early stage and how the host can eliminate the pathogens is an important step to set the base for future therapeutic interventions. Here we describe a model of Candida albicans infection that can visualize the processes that occur early during an infection, including when the pathogen has passed the epithelial barrier, as well as the immune response elicited by the C. albicans invasion. We used this infection model to perform histological analyses that show the immune cells that infiltrate the skin as well as the presence and localization of the pathogen. Samples collected after the infection can be processed for RNA extraction.

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Here we describe a protocol that allows histological and molecular analysis of skin samples after Candida albicans intradermal injection. This protocol maintains the structural integrity of the skin and allows for the localization of tissue-resident or newly recruited immune cells as well as the pathogen distribution.

עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

פוטותרפיה יומי עם אור אדום כדי לווסת קנדידה אלביקנס Biofilm צמיחה

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

הבהרת והדמיה של קנדידה ביוביאמים

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Ex vivo Assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

שימוש בהדמיית in vivo לבדיקת פנוטיפים של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים של קנדידה אלביקנס במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

aPDT יעיל באמצעות כורכומינואידים לקנדידאזיס פומי בעכברים

Curcuminoid-Mediated Antimicrobial Photodynamic Therapy on a Murine Model of Oral Candidiasis

Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) has been extensively investigated in vitro, and preclinical animal models of infections are suitable for evaluating alternative treatments prior to clinical trials. This study describes the efficacy of aPDT in a murine model of oral candidiasis. Forty mice were immunosuppressed with subcutaneous injections of prednisolone, and their tongues were inoculated using an oral swab previously soaked in a C. albicans cell suspension. Tetracycline was administered via drinking water during the course of the experiment. Five days after fungal inoculation, mice were randomly distributed into eight groups; a ninth group of untreated uninfected mice was included as a negative control (n = 5). Three concentrations (20 &#181;M, 40 &#181;M, and 80 &#181;M) of a mixture of curcuminoids were tested with a blue LED light (89.2 mW/cm2; ~455 nm) and without light (C+L+ and C+L- groups, respectively). Light alone (C-L+), no treatment (C-L-), and animals without infection were evaluated as controls. Data were analyzed using Welch&#39;s ANOVA and Games-Howell tests (&#945; = 0.05). Oral candidiasis was established in all infected animals and visualized macroscopically through the presence of characteristic white patches or pseudomembranes on the dorsum of the tongues. Histopathological sections confirmed a large presence of yeast and filaments limited to the keratinized layer of the epithelium in the C-L- group, and the presence of fungal cells was visually decreased in the images obtained from mice subjected to aPDT with either 40 &#181;M or 80 &#181;M curcuminoids. aPDT mediated by 80 &#181;M curcuminoids promoted a 2.47 log10 reduction in colony counts in comparison to those in the C-L- group (p = 0.008). All other groups showed no statistically significant reduction in the number of colonies, including photosensitizer (C+L-) or light alone (C-L+) groups. Curcuminoid-mediated aPDT reduced the fungal load from the tongues of mice.

מחבר זרקור: חקר טיפול פוטודינמי עם כורכומין במודל מורין לקנדידה אוראלית

This protocol describes the application of antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) in a murine model of oral candidiasis. aPDT was performed using a water-soluble mixture of curcuminoids and blue LED light.