Name: rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit candida albicans
Uploaded: 2022-03-24T14:00:00
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이 작품은 교육부 (MOE)의 고등 교육 새싹 프로젝트의 틀 내에서 특집 지역 연구 센터 프로그램으로부터 응용 나노 의학 센터, 국립 청 쿵 대학 (National Cheng Kung University)과 대만 과학 기술부 [MOST 109-2327-B-006-005]에서 TW Wong에 자금을 지원했습니다. J.H. Hung은 대만 국립 청 쿵 대학 병원 [NCKUH-11006018] 및 [MOST 110-2314-B-006-086-MY3]의 자금을 인정합니다.

1. aPDT 시스템 준비
<ol><li>LED 스트립( 재료 표 참조)에서 녹색 발광 다이오드(LED) 4개를 잘라내어 96웰 플레이트의 네 웰에 정렬합니다(그림 1). 참고: LED는 4 x 3 어레이로 배열되었습니다. LED의 뒷면은 조사 중에 열을 분산시키기 위해 방열판에 부착되었습니다.</li>
	<li>광 전력계로 540 nm에서 LED의 플루언스 속도(11 )를 측정 한...

<ol>
	<li>Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+secreted+aspartyl+proteinases+in+virulence+and+pathogenesis.">Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).</li><li>Pappas, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice+guideline+for+the+management+of+candidiasis:+2016+update+by+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).</li><li>Ricotta, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+candidiasis+species+distribution+and+trends,+United+States,+2009-2017.">Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017.</a> Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).</li><li>Koehler, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morbidity+and+mortality+of+candidaemia+in+Europe:+an+epidemiologic+meta-analysis.">Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis.</a> Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).</li><li>Toda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+active+surveillance+for+culture-confirmed+candidemia+-+four+sites,+United+States,+2012-2016.">Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia - four sites, United States, 2012-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).</li><li>Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daylight+photodynamic+therapy:+an+update.">Daylight photodynamic therapy: an update.</a> Molecules. 25 (21), 5195 (2020).</li><li>Wainwright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+(PACT).">Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT).</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).</li><li>Wong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indocyanine+green-mediated+photodynamic+therapy+reduces+methicillin-resistant+staphylococcus+aureus+drug+resistance.">Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).</li><li>Kim, M. M., Darafsheh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sources+and+dosimetry+techniques+for+photodynamic+therapy.">Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).</li><li>Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+Bowen's+disease+(squamous+cell+carcinoma+in+situ)+of+the+digit.">Photodynamic therapy for Bowen's disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit.</a> Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).</li><li>Wong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+inactivation+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+by+indocyanine+green+and+near+infrared+light.">Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light.</a> Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).</li><li>Stasko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+blue+light+inhibits+infection+and+replication+of+SARS-CoV-2+at+doses+that+are+well-tolerated+by+human+respiratory+tissue.">Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).</li><li>Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+light+field+of+the+Waldmann+PDT+1200+lamp:+potential+for+wide-field+low+light+irradiance+aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy.">Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).</li><li>Feenstra, R. P., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescein+and+rose+bengal+staining.">Comparison of fluorescein and rose bengal staining.</a> Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).</li><li>Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-photosensitizer+binding+and+cell+density+on+microbial+photoinactivation.">Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).</li><li>Shahid, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duclauxin+derivatives+from+fungi+and+their+biological+activities.">Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).</li><li>Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+CLSI+M44-A2+disk+diffusion+and+associated+breakpoint+testing+of+caspofungin+and+micafungin+using+a+well-characterized+panel+of+wild-type+and+fks+hot+spot+mutant+Candida+isolates.">Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).</li><li>Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+yeast,+pseudohyphal,+and+hyphal+morphogenesis+differentially+affects+immune+recognition.">Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition.</a> Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).</li><li>Hung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+photodynamic+therapy+against+fungal+keratitis.">Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis.</a> Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).</li><li>Martinez, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rose+Bengal+photodynamic+antimicrobial+therapy:+a+pilot+safety+study.">Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study.</a> Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).</li></ol>

곰팡이 각막염에 대한 RB-PDT의 임상 적용의 고무적인 결과가 최근19 보고되었다. RB의 흡수 피크는 450-650 nm에 있다. 성공적인 aPDT를 위해 광원의 플루언스 속도를 결정하는 것이 필수적입니다. 암세포를 치료하기 위해서는 높은 플루언스 (보통 >100 J /cm2)가 필요하지만 감염된 병변을 치료하기 위해서는 더 낮은 플루언스가 필요합니다6. 높은 플루언스는 ?...

C. 알비칸은 건강한 개인의 위장관 및 비뇨 생식기에서 식민지화되며 개인의 약 50 %에서 정상적인 미생물로 검출 될 수 있습니다1. 숙주와 병원체 사이에 불균형이 생기면 C. albicans 는 침입하여 질병을 일으킬 수 있습니다. 감염은 국소 점막 감염에서 다발성 장기 부전까지 다양 할 수 있습니다2. 미국의 다중 센터 감시 연구에서 2009 년과 2017 년 사이에 침습성 칸디다증 환자로부터 격리 된 환자의 약 절반이 C. albicans3입니다. 칸디다혈증은 높은 이환율, 사망률, 장기간 입원4와 연관될 수 있다. 미국 질병 통제 예방 센터 (US Centers of Disease Control and Prevention)는 검사 된 모든 칸디다 혈액 샘플의 약 7 %가 항진균제 인 플루코나졸5에 내성이 있다고보고했습니다. 약물 내성 칸디다 종의 출현은 항균제에 대한 대안 또는 보조 요법을 개발하려는 우려를 제기합니다.
항미생물 광역학 요법 (aPDT)은 PS6의 피크 흡수 파장에서 빛으로 특정 광감작제 (PS)를 활성화시키는 것을 포함한다. 여기 후, 흥분된 PS는 에너지 또는 전자를 근처의 산소 분자로 전달하고 바닥 상태로 되돌아갑니다. 이 과정에서 반응성 산소 종과 일중항 산소가 형성되어 세포 손상을 일으 킵니다. aPDT는 1990년대7일부터 미생물을 죽이기 위해 널리 사용되어 왔다. aPDT의 이점 중 하나는 조사 중에 단일 산소 및 / 또는 반응성 산소 종 (ROS)에 의해 세포에서 여러 소기관이 손상된다는 것입니다. 따라서 aPDT에 대한 저항은 오늘날까지 발견되지 않았습니다. 더욱이, 최근의 한 연구는 aPDT 이후에 생존한 박테리아가 항생제에 더 민감해졌다고 보고하였다8.
aPDT에 사용되는 광원에는 레이저, 필터가 있는 금속 할로겐 램프, 근적외선 및 발광 다이오드(LED)9,10,11,12가 포함됩니다. 레이저는 일반적으로 0.5W/cm2보다 큰 높은 광전력을 제공하므로 매우 짧은 시간에 높은 광량을 제공할 수 있습니다. 구강 감염에 대한 aPDT와 같이 치료 시간이 길어지는 경우에 널리 사용되고 있다. 레이저의 단점은 조명의 스폿 크기가 작으며 디퓨저를 사용하면 수백 마이크로 미터에서 10mm에 이릅니다. 또한 레이저 장비는 비용이 많이 들고 작동하려면 특정 교육이 필요합니다. 한편, 필터를 이용한 금속 할로겐 램프의 조사 면적은 상대적으로 크다(13). 그러나 램프가 너무 무겁고 비쌉니다. LED 광원은 작고 저렴하기 때문에 피부과 분야에서 aPDT의 주류가되었습니다. 조사 영역은 LED 전구의 어레이 배열로 비교적 클 수 있다. 얼굴 전체를 동시에 비출 수 있습니다9. 그럼에도 불구하고, 전부는 아닐지라도 오늘날 이용 가능한 대부분의 LED 광원은 임상 사용을 위해 설계되었습니다. 그것은 공간을 차지하고 비싸기 때문에 실험실에서의 실험에 적합하지 않을 수 있습니다. 우리는 매우 작고 LED 스트립에서 절단 및 조립 할 수있는 저렴한 LED 어레이를 개발했습니다. LED는 다양한 실험 설계를 위해 다양한 배열로 장착할 수 있습니다. aPDT의 상이한 조건은 하나의 실험에서 96-웰 플레이트 또는 심지어 384-웰 플레이트에서 완성될 수 있다.
로즈 벵골 (RB)은 인간의 눈에서 각막 손상의 시각화를 향상시키기 위해 널리 사용되는 컬러 염료입니다14. RB 매개 aPDT는 스타필로코커스 아우레우스, 에스케리치아 콜리 및 C. 알비칸 에 대한 사멸 효과를 톨루이딘 블루O15의 것과 거의 유사한 효율로 나타냈다. 본 연구는 다제내성 C. 알비칸에 대한 RB-aPDT의 효과를 검증하는 방법을 시연한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tube</td>
			<td>Neptune, San Diego, USA</td>
			<td>#3745.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon, USA</td>
			<td>#352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan</td>
			<td>#16196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>sunmei, Tainan, Taiwan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum heat sink</td>
			<td>Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan</td>
			<td>BK-T220-0051-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, UK</td>
			<td>5415R</td>
			<td>disperses heat from the LED array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad prism software</td>
			<td>GraphPad 8.0, San Diego, California, USA</td>
			<td></td>
			<td>graphing and statistics software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green light emitting diode (LED) strip</td>
			<td>Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan</td>
			<td>2835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Yihder, Taipei, Taiwan</td>
			<td>LM-570D (R)</td>
			<td>Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150&#176;; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light power meter</td>
			<td>Ophir, Jerusalem, Israel</td>
			<td>PD300-3W-V1-SENSOR,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex 0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Merck, NJ, USA</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrug-resistant Candida albicans</td>
			<td>Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan</td>
			<td>BCRC 21538/ATCC 10231</td>
			<td>http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OD600 spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom, London, UK</td>
			<td>Ultrospec 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>330000</td>
			<td>stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized glass tube</td>
			<td>Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan</td>
			<td>AK45048-16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose Medium</td>
			<td>HIMEDIA, India</td>
			<td>M1363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit candida albicans

침습성 칸디다 알비칸스 감염은 장, 입, 질 및 피부의 가장 흔한 식민지 개척자 중 하나이기 때문에 인간에서 중요한 기회 주의적 곰팡이 감염입니다. 항진균제의 가용성에도 불구하고, 침습성 칸디다증의 사망률은 ~ 50 %로 남아 있습니다. 불행히도, 약물 내성 C. 알비칸의 발생률은 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 항미생물 광역학 요법 (aPDT)은 C. 알비칸 생물막 형성을 억제하고 약물 내성을 극복하기 위한 대안 또는 보조제 치료를 제공할 수 있다. 로즈벵골(RB)-매개 aPDT는 박테리아 및 C. 알비칸의 효과적인 세포 사멸을 보여주었다. 이 연구에서, 다제내성 C. 알비칸에 대한 RB-aPDT의 효능이 기재되어 있다. 수제 녹색 발광 다이오드(LED) 광원은 96웰 플레이트의 웰 중앙에 정렬되도록 설계되었습니다. 효모는 상이한 농도의 RB를 갖는 웰에서 배양되었고, 녹색 빛의 다양한 플루언스로 조명되었다. 사멸 효과를 플레이트 희석 방법에 의해 분석하였다. 빛과 RB의 최적 조합으로, 3-로그 성장 억제가 달성되었다. RB-aPDT가 잠재적으로 약물 내성 C. 알비칸을 억제 할 수 있다고 결론지었다.

도 1은 본 연구에 사용되고 있는 aPDT 시스템을 나타낸 것이다. 고온은 상당한 셀 사멸을 일으킬 수 있기 때문에, LED 어레이는 전기 팬에 의해 냉각되고, 25 ± 1°C에서 일정한 온도를 유지하기 위해 조사 중에 방열판이 사용된다. 열 효과는 할인 될 수 있습니다. 균일한 광 분포를 갖는 것은 또한 성공적인 aPDT를 위한 중요한 결정 인자이다; 따라서 조명 중에 LED 전구를 잘 정밀?...

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Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

약물 내성 칸디다 알비 칸스의 발생률이 증가하는 것은 전 세계적으로 심각한 건강 문제입니다. 항균 광역학 요법 (aPDT)은 약물 내성 곰팡이 감염에 맞서 싸울 수있는 전략을 제공 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 시험관내에서 다약제 내성 C. 알비칸 균주에 대한 로즈벵골 매개 aPDT 효능을 기술한다.

로즈 벵골 매개 광역학 치료 칸 디다 알비칸을 억제하기 위해

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

이 연구는 다양한 미생물과 세포에 대한 다양한 광역학 효과를 조사하는 간단하고 다재다능하며 쉬운 시스템입니다. 이 시스템에서 LED는 실험 설계에 따라 다른 배열로 적합할 수 있습니다. PDT의 상이한 조건은 하나의 실험에서 96-웰 플레이트 또는 심지어 384-웰 플레이트에서 계산될 수 있다.이 기술은 곰팡이 각막염을 치료하는 데 사용될 수 있기 때문에 전 세계적으로 약 150, 000 명의 사람들이 집중적 인 치료에도 불구하고 눈을 잃습니다. 시작하려면 LED 스트립에서 네 개의 녹색 LED를 잘라 96웰 플레이트의 세 웰에 맞춥니다. 광 전력계로 540나노미터에서 LED의 플루언스 속도를 측정합니다.조사 중에 플레이트와 함께 조립 된 전기 팬으로 섭씨 25도에서 일정한 온도를 유지하십시오. 멸균 루프를 사용하여 한천 플레이트에서 칸디다 알비 칸의 단일 식민지를 골라 YPD 배지 세 밀리리터가 들어있는 멸균 된 유리 튜브에 추가하십시오. 튜브를 섭씨 25도에서 14 내지 16시간 동안 155 RPM의 회전 속도로 배양하여 효모 배양물을 성장시킨다.다음으로 YPD 배지로 밤새 배양물을 0.5의 OD600 값으로 희석한다. 섭씨 30도에서 네 시간 동안 155RPM으로 회전하여 인큐베이션하여 로그 성장 단계를 달성하십시오. 로그상 배양물을 신선한 YPD 배지로 희석하여 OD600 값이 0.65로 반복하여, 밀리리터 당 대략 1회 내지 7번째 콜로니 형성 단위를 10회 수득한다.동시에 1X PBS에서 장미 벵골의 4% 원액을 제조한다. 필터는 0.22 마이크로미터 필터로 멸균됩니다. 111 마이크로리터의 2% 로즈 벵골 용액을 1밀리리터의 로그 상 배양에 첨가하고, 실온에서 상이한 시점에서 공동 배양하여 세포 내의 RB의 흡수를 이해한다.실온에서 2 1/2분 동안 16, 100배 G에서 원심분리하고, 공동 배양물을 1X PBS 1 밀리리터로 세 번 세척하였다. 세척 후, 칸디다 알비칸스 배양물을 1X PBS의 1 밀리리터에 재현탁시킨다. 각 조건에 대해 배양물을 96웰 플레이트의 세 개의 다른 웰에 분배하십시오.웰을 LED 어레이에 맞춥니다. 조명에 노출된 그룹에서는 선풍기와 조명을 켭니다. 조사 후, 하나의 웰로부터 20 마이크로리터의 공동배양 용액을 취하고, 이를 1X PBS의 180 마이크로리터를 함유하는 튜브에 첨가함으로써 10배 연속 희석을 두 번 수행한다.그 다음 각 직렬 희석액의 20 마이크로리터를 YPD 한천 플레이트의 한 사분면에 떨어뜨려 플레이트 상에 계수가능한 콜로니를 얻었다. 형광 현미경 검사는 적색 형광 하에서 장미 벵골로 칸디다 알비 칸을 즉시 염색하는 것으로 나타났습니다. 15분간의 인큐베이션 후에, 대부분의 세포는 장미 벵골로 염색되었고, 이는 그것이 시간 의존적인 방식으로 세포에 진입한다는 것을 나타낸다.또한, 빛으로 장미 벵골의 활성화는 세포 내에서 자유 라디칼과 일중항 산소를 생성하여 세포 사멸을 초래합니다. 장미 벵골 또는 조사가없는 경우, 세포 사멸은 관찰되지 않았다. 칸디다 알비칸스는 0.2%로즈 벵골의 존재하에 녹색 광 조사 후 광량 의존적 방식으로 억제되었다.먼저 96웰 플레이트를 LED의 중심과 정렬해야 합니다. 둘째, 사용된 한천 플레이트는 별도의 콜로니의 혼합을 방지하기 위해 철저하게 건조되어야 한다. 플레이트에서 자란 칸디다 알비칸은 PDT가 세포의 유전자 발현에 어떻게 영향을 미치는지 대답 할 수있는 유전자 분석을 위해 추가로 보낼 수 있습니다.이러한 기술은 쉽고 저렴하며 다재다능한 플랫폼을 통해 암세포, 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스와 같은 다양한 세포 유형에서 PDT가 어떻게 작동하는지 조사하는 길을 열어줍니다.

rose-bengal-mediated-photodynamic-therapy-to-inhibit-candida-albicans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily lead to infections in the dermis which can, in turn, result in the dissemination of pathogens into the bloodstream. Understanding how the immune system fights infections at the very early stage and how the host can eliminate the pathogens is an important step to set the base for future therapeutic interventions. Here we describe a model of Candida albicans infection that can visualize the processes that occur early during an infection, including when the pathogen has passed the epithelial barrier, as well as the immune response elicited by the C. albicans invasion. We used this infection model to perform histological analyses that show the immune cells that infiltrate the skin as well as the presence and localization of the pathogen. Samples collected after the infection can be processed for RNA extraction.

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Here we describe a protocol that allows histological and molecular analysis of skin samples after Candida albicans intradermal injection. This protocol maintains the structural integrity of the skin and allows for the localization of tissue-resident or newly recruited immune cells as well as the pathogen distribution.

깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

규제 Candida albicans Biofilm 성장에 붉은 빛으로 매일 광선 요법

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

칸디다 알비칸스 위장관에서 최면 모포 발생을 연구하는 Ex vivo 분석

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

포유류 숙주에서 활성 감염 중 칸디다 알비칸스 돌연변이 균주에서 형태형성 표현형을 스크리닝하기 위한 생체 내 이미징 사용

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

마우스의 구강 칸디다증에 대한 커큐미노이드를 사용한 효과적인 aPDT

Curcuminoid-Mediated Antimicrobial Photodynamic Therapy on a Murine Model of Oral Candidiasis

Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) has been extensively investigated in vitro, and preclinical animal models of infections are suitable for evaluating alternative treatments prior to clinical trials. This study describes the efficacy of aPDT in a murine model of oral candidiasis. Forty mice were immunosuppressed with subcutaneous injections of prednisolone, and their tongues were inoculated using an oral swab previously soaked in a C. albicans cell suspension. Tetracycline was administered via drinking water during the course of the experiment. Five days after fungal inoculation, mice were randomly distributed into eight groups; a ninth group of untreated uninfected mice was included as a negative control (n = 5). Three concentrations (20 &#181;M, 40 &#181;M, and 80 &#181;M) of a mixture of curcuminoids were tested with a blue LED light (89.2 mW/cm2; ~455 nm) and without light (C+L+ and C+L- groups, respectively). Light alone (C-L+), no treatment (C-L-), and animals without infection were evaluated as controls. Data were analyzed using Welch&#39;s ANOVA and Games-Howell tests (&#945; = 0.05). Oral candidiasis was established in all infected animals and visualized macroscopically through the presence of characteristic white patches or pseudomembranes on the dorsum of the tongues. Histopathological sections confirmed a large presence of yeast and filaments limited to the keratinized layer of the epithelium in the C-L- group, and the presence of fungal cells was visually decreased in the images obtained from mice subjected to aPDT with either 40 &#181;M or 80 &#181;M curcuminoids. aPDT mediated by 80 &#181;M curcuminoids promoted a 2.47 log10 reduction in colony counts in comparison to those in the C-L- group (p = 0.008). All other groups showed no statistically significant reduction in the number of colonies, including photosensitizer (C+L-) or light alone (C-L+) groups. Curcuminoid-mediated aPDT reduced the fungal load from the tongues of mice.

저자 스포트라이트: 구강 칸디다증을 위한 쥐 모델에서 커큐민을 사용한 광역학 요법 탐색

This protocol describes the application of antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) in a murine model of oral candidiasis. aPDT was performed using a water-soluble mixture of curcuminoids and blue LED light.